CN106834296A - 一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的嗅觉活性剂筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法包括以下工艺步骤：1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT‑PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K_D低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。

Description

一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的嗅觉活性剂筛选方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法。

背景技术

中华蜜蜂(Apis cerana cerana，简称中蜂)，是中国土生土长的优良蜂种，也是中国几千年以来养蜂业者的当家蜂种，由于长期的适应进化，中蜂对于中国本土特别是山区的植物生态系统如十字花科、蔷薇科、漆树科和山茶科等植物花香产生良好的嗅觉敏感和适应性。近年来，随着设施农业的开展，特别在冬季草莓设施农业生产过程中，利用中蜂授粉已经成为保障草莓高产高质不可或缺的生产工艺。然而目前在利用中蜂授粉过程中，授粉效率有时较低，这尤其不利于保证冬季设施农业下的蜜蜂授粉效率，从而对冬季草莓的产量和品质产生较大的影响。

中蜂授粉效率较低的重要原因是由于中蜂对待授粉植株花朵的气味不敏感，因此迫切需要了解中蜂对哪些气味能产生较强的敏感作用，即快速筛选并鉴定中蜂敏感或有引诱作用的植物花香物质，即嗅觉活性剂。该难题的解决将有助于增加中蜂在设施环境中的嗅觉活力并提高其设施授粉效率。不过由于各种植物花香的挥发物成分种类繁多复杂，如何快速地筛选出合适的嗅觉活性剂配方成为制约中华蜜蜂嗅觉活性剂开发和设计的瓶颈。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法的技术方案。

所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；

2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；

3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；

4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K_D低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。

进一步的，所述的步骤4)中IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。

进一步的，所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括：

1)荧光配基1-NPN与中华蜜蜂重组气味结合蛋白的结合

在281nm激发波长下，向1μmol/L的中华蜜蜂重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；

2)配基结合和EAG验证

选取中华蜜蜂植物花香气味物质和1-NPN进行竞争结合中华蜜蜂重组气味结合蛋白，如果中华蜜蜂植物花香气味物质将1-NPN与AcerOBP2相对荧光值竞争至50％以下，并且解离常数K_D低于20μmol/L以下时，则确定为适合中华蜜蜂的嗅觉引诱活性剂。

本发明从中华蜜蜂嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其气味结合蛋白基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术探讨了其与植物花香气味物质的亲和力。本发明为基于中华蜜蜂花香气味物质的嗅觉活性剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

附图说明

图1为AcerOBP2基因的PCR扩增图；

图2为重组阳性质粒的双酶切鉴定图；

图3为重组中华蜜蜂化学感受蛋白AcerOBP2诱导表达时间的优化；

图4为重组中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的分离纯化

图5为重组AcerOBP2蛋白与荧光配基1-NPN的荧光结合曲线图；

图6为候选配基与荧光配基1-NPN和重组AcerOBP2蛋白的竞争结合图；

图7为中华蜜蜂授粉蜂触角对不同花香气味物质的EAG反应对荧光结合验证图。

图3中：M：蛋白分子量标准；0：未诱导的pET30/AcerOBP2的BL21(DE3)菌体；1～6：1～6h优化表达产物

图4中：M：蛋白分子量标准；1～5：分离纯化的AcerOBP2重组蛋白

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：收集中华蜜蜂触角总RNA以及气味结合蛋白OBP的基因克隆

1中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的克隆

1.1中华蜜蜂总RNA的提取

采用Trizol试剂提取中华蜜蜂工蜂触角的总RNA，具体操作步骤如下：

1)从-80℃取出保存的中华蜜蜂工蜂触角样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100mg组织样品装入1.5mL离心管中，然后加入1ml Trizol试剂，漩涡混合器上进行混合；

2)将样品在室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

3)4℃，12 000×g，离心5min；

4)将上清转移至新的离心管中(切勿吸取沉淀)，然后加入200μL的氯仿上下颠倒混匀15s，室温放置15min；

5)4℃，12 000×g，离心10min；

6)转移500μL左右的上清至另一新的离心管中，然后加入200μL的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在15℃静置10min；

7)4℃，12 000×g，离心10min；

8)倒掉上清，然后向离心管中加入1ml浓度为75％的乙醇(1％DEPC水配制)，进行洗涤，4℃，12 000×g，离心5min；

9)重复步骤8)；

10)倒掉上清，先在空气中干燥沉淀5～10min，再用RNase free水溶解沉淀；

11)待RNA完全溶解后，利用NanoDrop超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，再将提取的总RNA保存于-80℃冰箱中，用于反转录合成第一链。

1.2第一链cDNA的合成

采用TaKaRa公司的反转录试剂盒合成中华蜜蜂的第一链cDNA。实验方法按照试剂盒说明书进行，具体实验步骤如下：

总RNA	1μL
		Oligo(dt)	1μL
5×PS Buffer	4μL
		PS RT Enzyme MixⅠ	1μL
Random 6mers	2μL
			Up to 20μL

混匀，进行短暂离心，RT反应程序：37℃15min，85℃5s。试验到此阶段合成了第一链cDNA，将其在-20℃条件下保存备用。

1.3基因克隆

根据GenBank中登录的意大利蜜蜂ASP2全长(GenBank登录号:AF393493)，设计特异性引物：

正向引物：5’-AAGGATCCATGAACACCCTCGTC-3’；

反向引物：5’-CGCAAGCTTTTACGAGAACAGTT-3’。

为了后续实验操作的需要，即将目的基因片段亚克隆至其他载体上，在设计引物时分别在正、反向引物中加入了BamH I，Hind III酶切位点(用下划线表示)。引物由上海生工公司合成。

以中华蜜蜂cDNA为模板，借助ExTaq酶进行PCR扩增AcerOBP2基因。PCR反应体系如下(20μL)：

PCR的反应条件为：95℃3min预变性，每个循环94℃45s，50℃45s，72℃45s，进行35个循环，然后72℃延伸10min，16℃forever。PCR结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行检测分析。

1.4 PCR产物的割胶回收

利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒对割胶产物进行回收。具体方法如下：

1)在紫外灯下切取目的片段，放入1.5mL的离心管中，先称重量，然后按质量比例换算后，加入600μL Buffer DE-A，在75℃条件下加热融化(加热5-7min，加热过程中注意混匀)；

2)然后向1)中的离心管中加入250μL Buffer DE-B，充分混合后装入制备管中，12000×g离心1min；

3)将柱中离心后的液体，加入500μL Buffer W1，12 000×g离心30s；

4)倒掉滤液，加入700μL Buffer W2，12 000×g常温离心30s；

5)倒掉滤液，加入700μL Buffer W2再洗一遍，12 000×g离心1min；

6)取一新的1.5ml离心管，将柱子放入管中，加入20μL ddH2O，室温放置1min后，12000×g离心1min，弃柱子后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收后产物纯度，并且用超微量紫外分光光度计检测浓度后保存在-20℃备用。

1.5连接反应

将目的基因片段的割胶回收产物连接到pGEM-T easy载体上，转化至TG1感受态细胞。连接体系如下：

实施例2：中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2表达载体构建

2.1 PCR扩增AcerOBP2基因

提取中华蜜蜂的总RNA，反转录得到的cDNA第一链后作为模板，以设计合成的中华蜜蜂AcerOBP2前后引物进行PCR反应，PCR结果经琼脂糖凝胶电泳，如图1中所示，得到了447bp左右的目的片段，与预期片段长度一致。

2.2双酶切鉴定

AcerOBP2基因PCR扩增得到的目的片段凝胶回收纯化后与pGEM-T easy Vector连接转化后，经过蓝白斑鉴定后，在含有氨苄青霉素培养基平板上选取白色克隆菌，接种培养并提取质粒后，利用BamH I和Hind III限制性内切酶双酶切鉴定，验证结果如图2所示，目的条带大小符合要求。

2.3转化至感受态细胞TG1

对重组质粒pGEM-T-AcerOBP2利用菌液PCR进行验证，然后送入上海桑尼测序公司测序。测序验证正确后，将pGEM-T-AcerOBP2质粒与表达载体pET30a(+)质粒均经BamH I和Hind III限制性内切酶双酶切，然后目的片段与pET30a(+)载体以摩尔数比3:1，在T4连接酶的作用下4℃连接过夜构建pET30/AcerASP2。连接后的产物先转化进入大肠杆菌TG1，选取阳性克隆菌落之后经PCR鉴定后，选取鉴定的含pET30/AcerOBP2的阳性克隆菌扩大培养，并提取质粒，提取的质粒经过双酶切酶切验证并送上海桑尼测序公司测序进一步确定。连接体系及双酶切体系如下：

1)双酶切体系(20μL)：

2)连接体系(10μL)：

3)连接产物的转化

a.取-70℃冻存的TG1感受态细胞(100μL)，冰上融化；

b.加入5μL连接产物，轻轻吹打均匀，冰浴30min；

c.将菌液放入42℃水浴中热激90s，迅速移置冰上放置5min；

d.加入1000μl的LB培养基(无氨苄)，于37℃恒温摇床上200rpm，复苏1h；

e.将菌液3000rpm/min，离心3min，吸出上清800μL；

f.剩余的200μL吸取100μL涂平板，待菌液被平板吸收后，于37℃倒置培养过夜；

g.挑取平板上的白色单菌落，放入含1mL LB(含氨苄)的1.5mL离心管中，37℃，220rpm，过夜培养10～12h；

h.利用菌落PCR法鉴定其是否为阳性克隆；

i.鉴定为阳性克隆的菌液，可进行扩大培养和测序。

2.4转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)

将构建成功的pET30-AcerOBP2载体转化进入用于原核表达的感受态BL21(DE3)菌中。挑取单菌落经扩大培养后再送入上海桑尼测序公司进行测序，如果测序得到的结果正确，可将此菌液保存于-20℃冰箱中。

实施例3：中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的诱导表达

验证后的单菌落在3mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃振荡培养过夜，次日以1％(V/V)的接种量接种到20mL LB培养基中扩大培养至OD₆₀₀在0.4左右，加IPTG至终浓度为1mmol/L进行30℃200rpm开始诱导表达。每隔1h取出1mL菌液，共诱导5h，以未诱导的菌液为阴性对照，诱导结束后，将每小时收集的菌液在8000rpm下离心10min沉淀，并用ddH₂O分别重新悬浮后5000rpm离心10min，收集菌体，加入150μl的1×SDS样品缓冲液悬浮菌体沉淀，并在100℃下隔水煮沸10min使菌体充分裂解，之后将各管中样品进行在5％的浓缩胶及12％的分离胶的SDS-PAGE胶中进行电泳中确定菌体是否有表达。

取50mL诱导后的菌液，8000rpm下离心10min收集菌体，弃上清后，用5mL的含溶菌酶的细菌裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％TritonX-100，1mg/mL溶菌酶)重悬液体后置于4℃充分裂解过夜，次日使用细胞超声裂解仪使菌体充分裂解，裂解后的菌体在4℃下12 000rpm离心10min后将上清转移到新的离心管中备用，在沉淀中加入3mL的包涵体裂解液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，8mol/L尿素)进行4℃充分裂解过夜，次日裂解后的溶液经4℃下12000rpm离心上清取出。将细菌裂解液裂解上清和包涵体裂解后上清各取出20μL加入20μL的1×SDS样品缓冲液在沸水中煮3min后，在5％的浓缩胶及12％的分离胶的SDS-PAGE蛋白变性胶中电泳，以观察AcerOBP2重组蛋白的表达形式。

表1 SDS-PAGE电泳浓缩胶与分离胶成分

结果分析：为得到更多的AcerOBP2，我们对表达时间进行优化，经SDS-PAGE，用Bandscan软件对电泳图进行分析，结果显示，当IPTG浓度为1mmol/L，温度30℃，诱导转速为200rpm时，5h的诱导量最大。且特异性蛋白条带在20kD左右，与预期一致。

如图3为重组中华蜜蜂化学感受蛋白AcerOBP2诱导表达时间的优化，第5泳道即第5h的诱导量最大。

实施例4：中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的纯化

4.1蛋白纯化

1)确定了AcerOBP2重组蛋白表达形式后诱导500mL的大肠杆菌，收集含有目的蛋白的细菌上清。在上清溶液中加入5mL蛋白提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl)，溶解1h，10 000rpm离心后取上清。

2)用含有镍NTA琼脂糖亲和层析柱纯化目的蛋白，用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ(0.5mol/L NaH₂PO₄，0.5mol/L Na₂HPO₄，0.5mol/L NaCl)平衡镍NTA琼脂糖柱，将4.1中step1)得到的蛋白溶液上柱洗脱，控制流速在2mL/min，

3)然后用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ洗涤，

4)分别用不同梯度咪唑(10、20、50、100、200、300、400mol/L)进行洗脱，分别收集不同浓度下的洗脱液，最后用SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度，。各种梯度咪唑洗脱液配方如下：

表2 洗脱液的配方比例

如图4为重组中华蜜蜂气味蛋白AcerOBP2的分离纯化图，1～5泳道为经分离纯化的AcerOBP2重组蛋白。

4.2透析除盐

1)透析袋的处理

a.将1mL 0.5mol/L EDTA加入到499mL ddH₂O配成1mmol/L EDTA溶液；

b.向上述溶液中加入10g NaHCO₃，充分搅拌混匀；

c.将透析袋剪成适宜大小，然后放入到配置好的溶液中，煮沸10min；

d.蒸馏水洗干净后再加入透析液透析。

2)透析

配制500mL 0.01mol/L的PBS溶液(pH 7.4)，将3.1.3中确定含有纯AcerOBP2重组蛋白的洗脱液全部转移于透析袋中，放入PBS溶液中于4℃透析3d，期间每天早晚分别更换新鲜的PBS缓冲液一次，最后将透析好的蛋白用Bradford法测定蛋白的浓度，用1.5ml离心管分装，-20℃冰箱保存备用。

实施例5：中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味挥发物荧光竞争实验

5.1材料与方法

5.1.1试剂与仪器

5.1.1.1实验试剂

实验所用的荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN)和各种气味挥发性物质的标准样品均购自于百灵威公司，纯度都在97％以上。待测蛋白为上述纯化好的AcerOBP2重组蛋白，蛋白终浓度为0.6μmol/L。

5.1.1.2实验仪器

RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)

5.1.2实验试剂的准备

将荧光配基1-NPN配成10mmol/L母液并置于4℃避光保存。将各标准样品均溶于HPLC级甲醇，配制成10mmol/L的溶液4℃保存。

5.1.3 AcerOBP2结合能力的测定

首先测定AcerOBP2与1-NPN的结合曲线。移取0.6μmol/L AcerOBP2蛋白溶液于石英比色皿中，然后逐步加入3μL的1mmol/L的1-NPN溶液反应2min后，在281nm波长下激发，记录荧光发射光谱及最大发射波长328nm处时的荧光值，根据Scatchard方程对光谱数据进行线性化(1)：

其中[D_t]表示溶液中总的1-NPN浓度，[D]表示溶液中游离的1-NPN浓度，[P_t]为AcerOBP2融合蛋白的浓度，K为1-NPN与AcerOBP2的结合常数，n为结合位点数。

然后使用1-NPN作为荧光探针，利用竞争结合实验来研究水果挥发性物质与中华蜜蜂AcerOBP2重组蛋白的解离常数。将供试挥发物质逐次加入到1-NPN与AcerOBP2蛋白混合液中，每次加入后反应时间2min，然后记录荧光值。根据公式(2)计算待测挥发物的解离常数K_D：

其中[IC₅₀]为挥发性物质能够将1-NPN与蛋白的结合率降至50％时的浓度，[1-NPN]为溶液中未结合的1-NPN浓度，K_1-NPN为蛋白/1-NPN复合物的解离常数。

5.1.4荧光光谱分析

(1)荧光配基1-NPN与重组蛋白的结合

在281nm激发波长下，向0.6μmol/L的重组AcerOBP2蛋白溶液中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀后进行荧光扫描，荧光光谱的多项式拟合相关系数达到0.9991，拟合较好(图5-a)；用Scatchard方程(公式1)线性化光谱数据后，拟合相关系数为0.9864，拟合较好(图5-b)。根据公式1可求得1-NPN与AcerOBP2蛋白的解离常数K_1-NPN为7.38μmol/L。

(2)配基结合实验

选择7种配基(β-紫罗兰酮、4-烯丙基藜芦醚、3,4-二甲基苯甲醛、苯乙醛、水杨酸甲酯、香叶醇、芳樟醇)分别进行荧光结合实验，这7种配基均能与1-NPN竞争结合AcerOBP2，且结合能力都较好，可将1-NPN与AcerOBP2相对荧光值竞争至50％以下(图6)。将1-NPN与相对荧光AcerOBP2的相对荧光值竞争至50％的最强配基是β-紫罗兰酮和4-烯丙基藜芦醚，竞争强度分别达到1.56％和7.09％，结合常数分别达到5.14和3.46μmol/L。

表3候选配基与1-NPN和重组AcerOBP2蛋白的竞争结合

如图6和表3所示，利用本发明发现多种花香类气味物质如β-紫罗兰酮、4-烯丙基藜芦醚、3,4-二甲基苯甲醛、水杨酸甲酯、香叶醇和芳樟醇等能与中华蜜蜂气味结合蛋白产生较强的亲和力，表明利用上述气味物质可以筛选针对于中华蜜蜂工蜂激发嗅觉的活性剂的配方。

实施例6：通过本发明筛选得到的嗅觉活性剂的有效性试验

6.1材料与方法

6.1.1供试昆虫

中华蜜蜂为活框饲养种群，共三脾，蜂王为当年新生蜂王，生殖活力强，样品均为采集工蜂，其特征是从户外返回蜂巢并携带花粉粒。

6.1.2实验仪器和试剂

6.1.2.1实验仪器

触角电位仪由荷兰Syntech公司生产，由智能化数据获取控制器IDAC-2、刺激气流控制器(Syntech CS-55)、微动操作仪(Syntech MN-151)及Syntech软件处理系统四部分组成。

6.1.2.2试剂

各种标准品，均购自百灵威。导电胶，手术刀，刀片，锡箔纸，定性滤纸。

6.1.3研究方法

6.1.3.1试剂及刺激样品的制备

分别将每种化合物溶于液体石蜡，并配成0.1(v/v)溶液进行EAG测定。剂量反应测试时，选择荧光结合实验中具有代表性的化合物，用溶剂作为对照。

6.1.3.2触角电位测定

1)首先用手术刀将中华蜜蜂触角从基部切下，然后小心地将中华蜜蜂触角的两端用导电胶分别黏在EAG的金属电极上。这时观察显示屏上的基线变化情况，等到基线平稳以后，表明触角已经稳定，且反应良好，此时便可以开始实验。

2)在滤纸条上(2cm×0.5cm)滴加10uL待测样品溶液，使溶剂挥发一会后，再将滤纸塞进巴斯德管内，用锡箔纸把管口两端封住，防止样品挥发。另取10uL液体石蜡+滤纸作为空白对照。测试时将巴斯德管一端插入送气管外侧直径为2mm的小孔内，送气管管口与触角纵向垂直，并与触角相距1cm左右。同时点击手标和踩脚踏板，刺激时间0.2s，刺激气流为100mL/min，两次刺激时间相隔2min，以保证触角感觉器的感觉功能完全恢复。随机测定待测样品，由于随着时间的延长，触角的生理活性也会跟着降低，为了避免此种情况对实验造成不利的影响，以0.01(v/v)的叶醇(溶剂为液体石蜡)作为标准参照刺激对各测试样品的刺激反应进行标准化校正。因为通过预实验发现中华蜜蜂对叶醇的反应存在稳定的峰值，所以选择叶醇最为标准参照。在测定样品前先进行1次对照CK(液体石蜡)和标准参照刺激，然后测试5个样品，再进行对照和标准参照刺激，如此循环往复，每个触角约测试5个样品，每个待测样品重复6次，EAG反应值参照付晓伟等[101]的方法计算，公式如下。

公式中Sr为中华蜜蜂对此种化合物EAG反应的相对值，Sc为此种化合物的EAG反应值，CKm为测定此种化合物前后的对照液体石蜡两次EAG反应的平均值，Rm为测定此种化合物前的标准参照EAG反应的平均值。

6.1.4数据处理与分析

利用SPSS 16.0软件对所获得的实验数据进行处理和分析。EAG反应的相对值采用Duncan法进行方差分析(P<0.05)。

表4中华蜜蜂对植物花香物质的EAG反应

从图6和表4可以得到4-烯丙基藜芦醚、β-紫罗兰酮、3,4-二甲基苯甲醛等均能够使中华蜜蜂产生较强的嗅觉刺激反应，相应的荧光结合解离常数也非常小(越小表明气味结合蛋白结合气味配基能力越强)。

Claims (3)

1.基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；

2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；

3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；

4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K_D低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。

2.如权利要求1所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。

3.如权利要求1所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括：

1)荧光配基1-NPN与中华蜜蜂重组气味结合蛋白的结合

在281nm激发波长下，向1μmol/L的中华蜜蜂重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；

2)配基结合和EAG验证

选取中华蜜蜂植物花香气味物质和1-NPN进行竞争结合中华蜜蜂重组气味结合蛋白，如果中华蜜蜂植物花香气味物质将1-NPN与AcerOBP2相对荧光值竞争至50％以下，并且解离常数K_D低于20μmol/L以下时，则确定为适合中华蜜蜂的嗅觉引诱活性剂。