CN103088032A - 一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法。该家蚕触角结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。家蚕触角结合蛋白的制备方法是用本发明的家蚕触角结合蛋白基因构建重组表达载体后导入宿主菌构建基因工程菌，利用IPTG诱导表达蛋白，再经过纯化得到最终蛋白产物。本发明的ABP基因片段不含信号肽序列，构建的重组表达载体pET-32a-ABP经诱导表达能获得大量重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

Description

一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法。 

背景技术

家蚕为鳞翅目昆虫中少数的益虫，家蚕触角结合蛋白（Antennal binding protein, ABP）是气味结合蛋白（Odorant binding proteins, OBPs）的一个亚类，在昆虫和外界环境进行化学信息交流过程中起着重要作用，对昆虫的觅食、求偶、繁殖都具有重要意义。灵敏的嗅觉对于昆虫的正常生存和适应环境不可或缺，昆虫嗅觉系统是一个高度专一、极其灵敏的化学监测器，能从成千上万种不同气味中识别出低达几百万分之一的某些特异性气味物质。昆虫感受到的气味物质多为脂溶性的小分子化合物，这些小分子物质通过触角上皮细胞间的孔道扩散到达触角感器淋巴液，而触角感器是亲水性的液体，外界亲脂性分子不能直接穿过这些亲水性的液体到达嗅觉神经树突末梢，家蚕触角结合蛋白（ABP）可能在嗅觉神经树突周围液体中溶解并运输脂溶性气味化合物穿过亲水性液体。 

鳞翅目昆虫中包括了大量农业和林业上的重要害虫，如何有效防治害虫但不污染环境是当前生产中的关键问题 ，开展家蚕触角结合蛋白的研究不仅有利于指导蚕桑业的生产实践，也可以利用家蚕作为模式生物进行相关研究，将其成果积极应用于鳞翅目害虫的防治。 

现有技术对于触角结合蛋白的研究较少，张瑶等在“家蚕ABP与ABPX基因定位于表达分析”（昆虫学报，2012）一文中利用家蚕ABP基因（GenBank登录号：DQ311409）序列，通过RT-PCR方法获取了ABP基因序列，其位于第5染色体上，由3个外显子和1个内含子组成，外显子序列长度在47~450bp之间，内含子长度3482bp。但是对于家蚕触角结合蛋白的表达和纯化还未见报道，因为该蛋白的表达量非常低、且难于纯化。 

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过构建重组表达载体pET-32a-ABP，摸索诱导表达条件并成功得到大量重组目的蛋白，重组蛋白经镍离子亲和层析柱纯化及凝胶过滤层析等技术可以得到纯度较高的重组蛋白，为以后研究其三维结构和其在信号通路中的功能奠定了极其重要的基础。 

本发明具体技术方案如下： 

一种家蚕触角结合蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2所示。

上述家蚕触角结合蛋白基因的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示。 

一种家蚕触角结合蛋白的重组表达载体，是由上述家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点构建而成。 

一种基因工程菌，其含有上述家蚕触角结合蛋白的重组表达载体。 

优选地，所述基因工程菌为E.coli BL21。 

一种家蚕触角结合蛋白的制备方法，包括如下步骤： 

（1）将权利要求1所述的家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体的多克隆位点，构建成重组表达载体，重组表达载体导入宿主菌，构建成基因工程菌，培养基因工程菌，并用IPTG诱导表达蛋白，离心收集菌体，经细胞破碎、离心后收集上清；

（2）收集的上清经纤维素膜过滤除去杂质后，过镍离子亲和层析柱，用梯度浓度的咪唑水溶液洗脱，收集咪唑浓度为80 mM时的洗脱液，即得到家蚕触角结合蛋白。

优选地，所述培养基因工程菌的培养基为含有Amp抗生素的LB培养基，培养条件是220rpm摇床37℃培养。 

优选地，所述IPTG的浓度为0.5mM，收集菌体前的离心速率为1000rmp。 

优选地，所述细胞破碎具体步骤为：收集的菌体用pH 7.4的PBS洗涤三次，冰浴条件下以200W的功率超声破碎两次，每次以超声1s停2s的方式循环共30min；收集上清前的离心条件为12000rmp离心10min。 

优选地，所述纤维素膜的孔径为0.45μm。 

本发明具有以下有益效果： 

ABP含有21个氨基酸的信号肽，通过分析发现，正是由于携带信号肽序列，导致蛋白不易结晶，根据这一发现，本发明通过设计引物，从第22个氨基酸开始克隆，得到的不含信号肽的ABP基因，并构建了不含有信号肽的重组表达载体pET-32a-ABP，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后经20mM~50mM浓度的咪唑水溶液洗掉未结合的蛋白，80mM浓度的咪唑水溶液洗脱目的蛋白，获得了纯度较高的目的蛋白，操作简易，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；由于膜蛋白的表达和纯化是一个世界性的难题，因此本发明用基因工程的手段成功表达膜蛋白且其以可溶性的形式存在，为目前研究膜蛋白提供了另一种途径；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

附图说明

图1是本发明ABP基因片段的PCR扩增产物电泳图，M：DNA Ladder Mix；1：二次PCR扩增条带。 

图2 是本发明ABP基因片段与pET-32a质粒的双酶切产物电泳图，M：DNA Ladder Mix；1：ABP基因片段双酶切产物；2：pET-32a质粒双酶切产物。 

图3是本发明重组质粒pET-32a-ABP的PCR产物和双酶切产物电泳鉴定图，M：DNA Ladder Mix；1：重组质粒双酶切的产物；2： PCR产物。 

图4是本发明的重组蛋白表达产物电泳图，M：蛋白分子量标准；1：pET-32a(-)空载体诱导对照；2：pET-32a-ABP未诱导对照；3：pET-32a-ABP诱导表达产物。 

图5 是本发明的重组蛋白表达产物Western blot图，M：蛋白分子量标准；1：pET-32a(-)空载体诱导对照；2：pET-32a-ABP未诱导对照；3：pET-32a-ABP诱导表达； 

图6是本发明的重组蛋白破碎后上清在不同浓度下咪唑水溶液的洗涤产物电泳图，M：蛋白分子量标准；1：20mM；2：40mM；3：60mM；4：80mM；5：100mM；6：150mM；7：200mM；8：500mM。

图7 是重组蛋白的质谱鉴定图一级质谱。 

图8是重组蛋白的质谱鉴定图二级质谱。 

图9是重组表达载体pET-28a-ABP表达产物电泳图，M：蛋白分子量标准，1：空载体诱导，2：重组载体未诱导，3：重组载体诱导。 

图10是重组表达载体pEGX-4T-1-ABP表达产物电泳图，M：蛋白分子量标准，1：空载体诱导，2：重组载体未诱导，3：重组载体诱导。 

图11是重组表达载体pEGX-6P-1-ABP表达产物电泳图，M：蛋白分子量标准，1：空载体诱导，2：重组载体未诱导，3：重组载体诱导。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 

实施例1 扩增ABP基因片段 

根据GenBank登录号：DQ311409公开的ABP基因mRNA序列，结合其他同源蛋白的特点，预测其前63bp为编码信号肽的序列，除去不要，直接从第64位开始扩增，引物设计如下：

上游引物F1: 5’-CGGAATTCGATAACGTCCACCTTAC-3’(SEQ ID NO:3，下划线为 EcoRⅠ酶切位点)；

下游引物R1: 5’-GCCCTCGAGCAGTGTGTAGTAATTT -3’ ( SEQ ID NO:4，下划线为XhoⅠ酶切位点)。

其中下游引物是在终止密码子后的51位加的，由于下游终止密码子的位置下游引物结合不牢固，所以往后找到了一处GC含量高的，可以结合的位置设计了下游引物。  

以家蚕蚕蛹总mRNA为模板，用反转录试剂盒（Fermentas公司）进行反转录合成cDNA，反应体系如下: 

cDNA第一链合成体系为：

混匀充分后65℃放置10 min，然后迅速放置冰上静置2 min，补加下列试剂：

充分混匀，在PCR中进行反应，反应程序设置如下：

42℃进行60 min，然后70℃反应10 min，最后4℃保存，反应所得产物可用于后续ABP的PCR扩增实验。

回收反转录扩增产物cDNA，再以回收产物为模板，用F1和R1为引物进行第2次扩增，反应体系：ddH₂O 25μL，dNTP 7.5μL，10×buffer 5μL，模板 5μL，引物R 2.5μL，引物F 2.5μL，Taq酶 2.5μL，总体积50μL。反应参数：94℃预变性10min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。 

最后回收的目的片段如图1所示，说明不含信号肽的ABP基因片段已成功获得。经测序鉴定与完整的ABP开放阅读框对比，其起始位点为ABP开放阅读框的64bp，至终止子后51bp结束，包括了除去编码信号肽碱基的ABP基因编码序列，其中第241位点为T而非C。不含信号肽的ABP基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

同时设计含有信号肽完整的ABP基因的上下游引物: 

上游引物F2: 5’-GCGCGGATCCATGATGTATTTAAGT-3’ (SEQ ID NO:5，下划线为BamHⅠ酶切位点)；

    下游引物R2: 5’- GCGCGTCGACTTAAAATAAAATATG-3’ (SEQ ID NO:6，下划线为SalⅠ酶切位点)。

该上下游引物能扩增完整的ABP基因片段，扩增产物大小应为423bp。 

以家蚕蚕蛹总mRNA为模板，用反转录试剂盒（Fermentas公司）进行反转录合成cDNA。所得产物再用引物F2和R2进行扩增，反应体系如下: ddH₂O 25μL，dNTP 7.5μL，10×buffer 5μL，模板 5μL，引物R2 2.5μL，引物F2 2.5μL，Taq酶 2.5μL，总体积50μL。 

PCR反应参数设为：94℃预变性10min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。 

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在预测大小位置未发现有核酸条带，证明该扩增实验未能成功扩增目的片段。 

实施例2 重组载体pET-32a-ABP的构建 

将上述PCR扩增获得的目的ABP基因片段通过限制性内切酶EcolⅠ和XhoⅠ（均购自Fermentas公司）双酶切，插入同样经过EcolⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-32a载体（该载体为原核表达载体，在加入目的片段的酶切位点上游有六个组氨酸标签，标签后面有个硫氧还蛋白，所以其表达的蛋白依次包含有HIS标签、硫氧还蛋白、目的蛋白。该载体可通过商业渠道购买，如Novagen公司等，本实施例使用的该载体为实验室保存），成功构建重组载体，命名为pET-32a-ABP。

ABP基因片段双酶切体系：ABP基因片段41μL，EcolⅠ2μL，XhoⅠ2μL，10×buffer 5μL，总体积共50μL。 

载体pET-32a双酶切体系：载体pET-32a 41μL，EcolⅠ 2μL，XhoⅠ 2μL，10×buffer 5μL，总体积共50μL。 

两个双酶切体系均在37℃进行双酶切20min，酶切产物电泳结果如图2。 

连接反应体系：pET-32a酶切产物 2.5μL，ABP基因片段酶切产物 2.5μL，Ligation high（连接酶，购自TOYOBO）5μL，总体积10μL，16℃在PCR仪中反应40min。 

连接产物转化到E.coli TG1感受态细胞(购自Fermentas公司)中培养；挑取单菌落摇菌培养后利用质粒提取试剂盒(购自康为世纪生物科技公司)抽提质粒，用PCR和双酶切进行鉴定，PCR鉴定是以质粒为模板，F1和R1为引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析，结果见图3的泳道2。双酶切是用EcolⅠ 和XhoⅠ双酶切重组载体，酶切产物进行电泳分析，结果见图3的泳道1。鉴定结果说明克隆成功，酶切产物送华大基因测序，其结果与预期相同，重组载体pET-32a-ABP构建成功。 

实施例3 重组蛋白的表达 

将实施例2重组载体pET-32a-ABP转化至E.coli BL21(购自Fermentas公司)中，得到重组基因工程菌（以下简称重组菌），在含50 mg/mL氨苄青霉素(上海恒远生物科技有限公司)的LB培养基(购自Oxoid公司)中37℃，220 rpm振荡培养至OD600≈0.5，加入IPTG至终浓度 0.5 mM，37℃诱导培养12h，取1.5mL菌液12000rpm离心后，将沉淀加入50μL 1×PBS重悬，然后取40μL重悬液，加入10μL的5×上样缓冲液，于60℃金属浴10min，然后在12000rpm下离心5min得到重组蛋白样品，取15μL进行12% SDS-PAGE，电泳结果如图4。以诱导培养的空载体pET-32a(-)和未诱导的重组载体pET-32a-ABP作为对照组。

Western blot检测结果也表明利用上述方法成功表达了含有HIS标签的重组蛋白且表达量很高，结果如图5。 

实施例4 目的蛋白的纯化 

（1）重组菌转入LB培养基中继续扩大培养，经浓度为0.5 mM的IPTG诱导表达后收集菌体，用pH 7.4的PBS洗涤三次，冰浴超声破碎，功率要求为200W，共超声两次，每次以超声1s停2s的方式循环共30min；使菌体破碎释放出包裹在里面的蛋白，然后离心，离心速率12000rpm，离心10min，分别收集上清和沉淀。

收集的上清含可溶的重组目的蛋白，上清经0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱(购自GE Healthcare)结合，依次用浓度为20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、150mM、200mM、500mM的咪唑水溶液进行洗涤，分别取不同浓度的咪唑水溶液的洗脱液制备蛋白样品，进行12%SDS-PAGE，结果如图6所示，说明20mM、40mM浓度的咪唑水溶液可以洗去几乎所有与镍柱未结合的蛋白，80mM浓度的咪唑水溶液就可以洗下重组蛋白。 

(2)经洗涤条件的摸索，SDS-PAGE发现，用浓度为20mM、50mM的咪唑水溶液依次洗脱，可以洗脱未结合在柱子上的杂蛋白，用浓度为80mM的咪唑水溶液可以洗脱下所有的重组目的蛋白且纯度很高，纯度达到80%。 

纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，通过挖点质谱鉴定，结果如图7，显示的肽指纹图谱与NCBI数据库比对，结果表明所表达的未知重组蛋白确定为家蚕触角结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。 

实施例5 其它重组载体构建及蛋白表达 

选用另外三种原核表达载体pET-28a、pEGX-4T-1 和pEGX-6P-1（均为实验室保存，也可以从市售渠道购买）分别与实施例1获得的ABP基因片段构建重组表达载体pET-28a-ABP、pEGX-4T-1-ABP和pEGX-6P-1-ABP，并采用与实施例3相同的诱导条件诱导表达重组蛋白，经0.1mM、0.5 mM、1.0mM不同浓度IPTG诱导，均未表达出重组蛋白。见附图9、10、11。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津耀宇生物技术有限公司

 

<120>  一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法

 

<130>  122200-I-IP-TJYU

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  423

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgatgtatt taagtttcgt tgtcctgata tgtctggcgt tcgccgtctt caactgcgga     60

 

gccgataacg tccaccttac tgaaactcaa aaagaaaaag ctaagcagta cacctcagaa    120

 

tgtgttaaag aatctggcgt gagcaccgaa gtgataaatg cagcgaagac tggacagtac    180

 

tccgaagata aagcttttaa gaaattcgtg ctttgctttt tcaacaaatc cgcaatcttg    240

 

aactcagatg gtacactgaa catggatgtt gcgctagcaa aacttcctcc tggtgttaat    300

 

aaatctgaag cccaaagcgt actagaacag tgcaaggata agaccgggca agacgcagcc    360

 

gataaagcct tcgagatctt ccaatgctac tacaaaggga ccaagacaca tattttattt    420

 

taa                                                                  423

 

 

<210>  2

<211>  411

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gataacgtcc accttactga aactcaaaaa gaaaaagcta agcagtacac ctcagaatgt     60

 

gttaaagaat ctggcgtgag caccgaagtg ataaatgcag cgaagactgg acagtactcc    120

 

gaagataaag cttttaagaa attcgtgctt tgctttttca acaaatccgc aatcttgaac    180

 

tcagatggta cactgaacat ggatgttgcg ctagcaaaac ttcctcctgg tgttaataaa    240

 

tctgaagccc aaagcgtact agaacagtgc aaggataaga ccgggcaaga cgcagccgat    300

 

aaagccttcg agatcttcca atgctactac aaagggacca agacacatat tttattttaa    360

 

ttaatctcga aataagaaac tatattggtc attctaaatt actacacact g             411

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cggaattcga taacgtccac cttac                                           25

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gccctcgagc agtgtgtagt aattt                                           25

 

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gcgcggatcc atgatgtatt taagt                                           25

 

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gcgcgtcgac ttaaaataaa atatg                                           25

 

 

<210>  7

<211>  119

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  7

 

Asp Asn Val His Leu Thr Glu Thr Gln Lys Glu Lys Ala Lys Gln Tyr

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Ser Glu Cys Val Lys Glu Ser Gly Val Ser Thr Glu Val Ile Asn

            20                  25                  30          

 

 

Ala Ala Lys Thr Gly Gln Tyr Ser Glu Asp Lys Ala Phe Lys Lys Phe

        35                  40                  45             

 

 

Val Leu Cys Phe Phe Asn Lys Ser Ala Ile Leu Asn Ser Asp Gly Thr

    50                  55                  60                  

 

 

Leu Asn Met Asp Val Ala Leu Ala Lys Leu Pro Pro Gly Val Asn Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Glu Ala Gln Ser Val Leu Glu Gln Cys Lys Asp Lys Thr Gly Gln

                85                  90                  95     

 

 

Asp Ala Ala Asp Lys Ala Phe Glu Ile Phe Gln Cys Tyr Tyr Lys Gly

            100                 105                 110        

 

 

Thr Lys Thr His Ile Leu Phe

        115                

Claims (10)

1.一种家蚕触角结合蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述家蚕触角结合蛋白基因的扩增引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示。

3.一种家蚕触角结合蛋白的重组表达载体，其特征在于，由权利要求1所述家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点构建而成。

4.一种基因工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的家蚕触角结合蛋白的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为E.coli BL21。

6.一种家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体的多克隆位点，构建成重组表达载体，重组表达载体导入宿主菌，构建成基因工程菌，培养基因工程菌，并用IPTG诱导表达蛋白，离心收集菌体，经细胞破碎、离心后收集上清；

（2）收集的上清经纤维素膜过滤除去杂质后，过镍离子亲和层析柱，用梯度浓度的咪唑水溶液洗脱，收集咪唑浓度为80 mM时的洗脱液，即得到家蚕触角结合蛋白。

7.根据权利要求6所述的家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养基因工程菌的培养基为含有Amp抗生素的LB培养基，培养条件是220rpm摇床37℃培养。

8.根据权利要求6所述的家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.5mM，收集菌体前的离心速率为1000rmp。

9.根据权利要求6所述的家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述细胞破碎具体步骤为：收集的菌体用pH 7.4的PBS洗涤三次，冰浴条件下以200W的功率超声破碎两次，每次以超声1s停2s的方式循环共30min；收集上清前的离心条件为12000rmp离心10min。

10.根据权利要求6所述的家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述纤维素膜的孔径为0.45μm。

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