CN105986025A

CN105986025A - 一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法

Info

Publication number: CN105986025A
Application number: CN201510093747.0A
Authority: CN
Inventors: 张玉燕; 修晓茜; 刘红旭; 范洪海
Original assignee: Beijing Research Institute of Uranium Geology
Current assignee: Beijing Research Institute of Uranium Geology
Priority date: 2015-03-03
Filing date: 2015-03-03
Publication date: 2016-10-05

Abstract

本发明属于地质科研结合分子生物学技术领域，具体涉及一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法。将研究前期采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩心样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；DNA片段的提取；目的基因PCR增殖；目的基因的纯化，去除杂质DNA；基因连接；基因克隆；基因验证；菌种培养基和铀试剂的配制；微生物的分离和培养；微生物与铀富集的关系研究。本发明涵盖从野外地质观察到实验内提纯模拟的各个阶段，定性分析了微生物与铀成矿的关系，过程规范化和可信度高，方法合理可行，对于深化砂岩型铀成矿作用机理、判定微生物与铀成矿的关系具有重要作用。

Description

一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法

技术领域

本发明属于地质科研结合分子生物学技术领域，具体涉及一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法。

背景技术

微生物成矿作为生物成矿作用的一个分支是当今地学的前沿科学，也是国际成矿作用研究领域的新动向、新热点。

微生物成矿作用是指微生物及其代谢作用所产生的有机质参与成矿或分异、聚集元素形成矿床或矿化菌体自身直接堆积形成有用矿产的作用。

研究表明砂岩型铀矿床中微生物与铀的沉淀富集关系密切，但现有技术在微生物富集铀的人工合成方面仍属空白。

发明内容

本发明需要解决的技术问题为：现有技术难以完成微生物富集铀的人工合成。

本发明采用了如下技术方案：

一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，该方法具体包括以下步骤：

(1)将采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；

(2)DNA片段的提取，经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程得到高纯度的DNA样本；

(3)目的基因PCR增殖，PCR包括变性、退火和延伸三个基本反应步骤；

(4)目的基因的纯化，去除杂质DNA；

(5)基因连接；

(6)基因克隆；

(7)基因验证；

(8)菌种培养基和铀试剂的配制；

(9)微生物的分离和培养；

(10)微生物与铀富集的关系研究。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(2)中能够使DNA充分溶解的盐浓度为2mol/L，将钠磷酸盐、MT缓冲溶液和含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，将装样完成的裂解基质管在12000g条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来，完成粗提；使用蛋白质沉淀剂PPS将蛋白质同DNA进行分离；使用DNA吸附质配合乙醇洗液去除粗提样品中的硅酸盐物质。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(3)中PCR技术包括：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火和延伸三过程，将增殖好的DNA样品用荧光染料进行染色，然后将样品放入到填充有分离树脂的点泳池内进行电泳，30min后检测电泳池中的荧光分布情况，将带有荧光的部分切割下来。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(4)中，将经过PCR复制后的树胶取出，放入到一只离心管中，向离心管中加入Buffer DEA，离心去除树脂，保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer DEA和Buffer DEB，离心重洗，弃滤液保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入BufferW2，离心并重复操作；将DNA制备管重置于一只离心管中，向制备管中加入高纯水并离心；弃DNA制备管，保留离心管中的滤液。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(5)中，取一只离心管，分别加入Buffer 2PL、T载体、步骤(4)中的滤液和T4连接酶，在-80℃温度条件下静置，完成基因连接。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(6)中，将静置的样品取出解冻，然后将全部液体转移到装有大肠杆菌离心管中，向该离心管中注入CaCl₂溶液；溶液混合均匀后在冰冻条件下静置；将静置好的溶液在42℃的恒温水浴锅中加热；向离心管中加入SOC培养基，在恒温室中以120r/min固定速率震动保存；将反应好的样品转移到加有氨苄的培养皿中，并用涂抹棒把样品涂抹均匀；恒温培养16个小时。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(7)中，将培养好的样品取出，在可见光条件下找出培养基上白色的菌群，并用移液枪枪尖选取白色菌种；将提取的白色菌种转移到另外一只培养基上的指定位置，然后再培养16个小时。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(8)中，培养基配方：KH₂PO₄ 0.5g、NH₄CI 1.0g、CaCI₂.2H₂O 0.1g、Na₂SO₄1.0g、MgSO₄、7H₂O 2.0g、乳酸钠3.5ml、酵母抽提物1.0g、维生素C 0.1g、巯基乙酸钠0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.5g，按培养基配方称量好培养基所需药品；称取5mg铀加热溶于浓硝酸，直至液体变为淡黄色，无铀矿粉末存在为止，将溶解后的铀溶液与之前称量药品混合，加蒸馏水至1L，调节ph至7.5。

所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中在37℃条件下，将步骤(9)中得到的单菌落微生物与步骤(8)中得到的含铀溶液混合20天；得到了混合样品制片观察；将混合样品经2.5％的戊二醛溶液固定，经蒸馏水和分别为30％、50％、70％、80％、90％梯度浓度酒精清洗和脱水后，置冷冻干燥机内真空烘干；将所得样品进行沾台，喷金，然后在扫描电镜下观察。

本发明的有益效果是：

本发明的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，涵盖从野外地质观察到实验内提纯模拟的各个阶段，定性分析了微生物与铀成矿的关系，过程规范化和可信度高，方法合理可行；对于深化砂岩型铀成矿作用机理、判定微生物与铀成矿的关系具有重要作用。

附图说明

图1为本发明的砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法作进一步说明。

实施例1

一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，包括野外采取实验样品、实验室内提取微生物DNA进行铀成矿模拟实验两个阶段，具体步骤如下：

步骤1将研究前期采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中。

步骤2DNA片段的提取：DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的盐溶液中溶解度不同，利用这一特点选择盐浓度为2mol/L就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，以达到分离目的；DNA在盐溶液中的溶解度先增大后减小，在DNA溶解度最低时，DNA从溶液中析出，而其他杂质还留在溶液中，达到粗提取的目的；粗提的DNA中往往带有大量的蛋白质，使用蛋白质沉淀剂可以有效的将蛋白质同DNA进行分离；因为所提取的DNA来自岩芯样品，所以使用DNA吸附质配合乙醇洗液可以去除粗提样品中的硅酸盐物质；经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程能够得到高纯度的DNA样本。具体步骤如下：

步骤2.1将978μl钠磷酸盐缓冲溶液加入到裂解基质管中；

步骤2.2向裂解基质管中加入122μl的MT缓冲溶液；

步骤2.3将500mg含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，完成装样过程；

步骤2.4将装样完成的裂解基质管在12000转/秒条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来；

步骤2.5将上层清夜转移到容积为2ml的洁净离心管中，加入250μl PPS试剂，振荡10次，使离心管内的物质混合均匀；

步骤2.6将离心管在12000g条件下离心5min，取上层清夜，等量加入到两个2ml的离心管中；

步骤2.7振荡离心管，使管内物质混合均匀，之后取0.5ml上层清夜到15ml的试管中；

步骤2.8振荡2分钟，以便DNA与吸附质结合，然后用过滤器配合乙醇洗液进行过滤，以除去硅酸盐；

步骤2.9去掉300-500μl的上清液，在去除上清液的过程中注意避免接触到底部的基质；

步骤2.10振荡剩余物质使之混合均匀，然后将混合均匀的物质移入到一个容积大约为600μl SPIN过滤管中，在12000g条件下离心1min，再将过滤后残留下来的固体物质放入另一只SPIN管中重复离心一次；

步骤2.11加入500μl的SEWS-M试剂，轻轻地振荡使管内的物质呈悬浮状态；

步骤2.12将悬浮液在12000g条件下离心2min，使基质同剩余的洗液脱离，然后将基质在室温下干燥5min；

步骤2.13将干燥好的基质与50-100μl的DES试剂混合，然后在12000g条件下离心1min，将洗脱的DNA移入一个干净的试管内，并保存于零下20℃或者4℃的恒温箱内备用。

步骤3目的基因PCR增殖：从岩芯中提取的DNA样本含量非常低，无法直接进行测序，使用PCR技术可以令提取液中的DNA含量呈对数增加；PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物；PCR包括变性、退火和延伸三个基本反应步骤：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火和延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，经过几十次扩增后，可将目的基因扩增放大几百万倍。具体步骤如下：

步骤3.1将新提取的DNA样品加入到一只干净的试剂盒内，设置定时加热器的时间间隔为30分钟，加热温度设定在90摄氏度℃；

步骤3.2当加热器温度指示器显示90℃时DNA双链螺旋会自动解旋形成单链DNA样品；

步骤3.3当模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右时迅速加入DNA引物，让引物与DNA上的固定碱基对组结合，之后向溶液中加入dNTP试剂；

步骤3.4dNTP试剂中包含的碱基对会在引物的作用下同DNA的单链发生碱基配对作用，而重新产生一条新的DNA样品；

步骤3.5持续对新产生的DNA样品进行加热，重复上述操作n次，则可将DNA样品的数量增至2ⁿ倍；

步骤3.6将增殖好的DNA样品用荧光染料进行染色，然后将样品放入到填充有分离树脂的点泳池内进行电泳。30分钟后检测电泳池中的荧光分布情况，将带有荧光的部分用刀切割下来；

步骤3.7将DNA样品放入冷冻室进行保存。

步骤4目的基因的纯化：去除杂质DNA。具体步骤如下：

步骤4.1将经过PCR复制后的树胶取出，放入到一只2ml的离心管中，向离心管中加入300μl的Buffer DEA；

步骤4.2将离心管置于漂浮板上，放入到水浴锅中用75℃的温度加热8分钟使树胶融化；

步骤4.3将溶解的液体用移液枪转移到DNA制备管中，并在离心机上使用12000g的速度进行离心1min以去除树脂；

步骤4.4弃滤液(树脂)，保留DNA制备管中的沉淀(DNA)；

步骤4.5将DNA制备管重新置入一只2ml的离心管中，加入100μl的BufferDEA和100μl的Buffer DEB，混合均匀后用离心机离心在12000g的速度下离心30s，对DNA进行重洗；

步骤4.6弃滤液，保留DNA制备管中的沉淀(DNA)；

步骤4.7将DNA制备管重新置入一只2ml的离心管中，加入500μl的BufferW1，混合均匀后用离心机离心，在12000g的条件下离心30s；

步骤4.8弃滤液，保留DNA制备管中的沉淀(DNA)；

步骤4.9将DNA制备管重新置入一只2ml的离心管中，加入500μl的BufferW2，混合均匀后用离心机离心，在12000g的条件下离心30s；

步骤4.10重复上一步操作，然后再空离一次；

步骤4.11将DNA制备管重置于一只1ml的离心管中，向制备管中加入30μl的高纯水，在12000g条件下离心1min；

步骤4.12弃DNA制备管，保留离心管中的滤液(DNA)；

步骤4.13将滤液置于-4℃条件下保存备用。

步骤5基因连接：经过PCR增殖的DNA样品为一系列碱基对数量相同但序列不同的混合物，且不具备生理活性，需要同特定载体结合成为质粒后注入活的细菌体内才能激发其生理活性；PCR增殖过程中，DNA链从引物的5’端开始向3’端方向复制；在taq酶的作用下会在最后一个3’端处自动添加一个A碱基，在特殊的DNA连接酶催化作用下，该碱基可以与特定载体上的T碱基配对，形成环状的质粒，称为DNA的连接过程。具体步骤如下：

步骤5.1取一只100μl的离心管，用移液枪加入5μl的Buffer 2PL；

步骤5.2用移液枪加入1μl的T载体；

步骤5.3用移液枪加入3μl的DNA片段(即上一个操作过程后得到的滤液)；

步骤5.4用移液枪加入1μl的T4连接酶；

步骤5.5静置过夜，设置温度为-80℃。

步骤6基因克隆：经过DNA连接的质粒可在氯化钙等诱发剂作用下，透过细胞膜进入细胞体内，称为DNA克隆；由于每一个细菌只能容纳一种类型的质粒，当一个质粒进入细菌体内后，其余类型的质粒将受到排斥，可据此将不同碱基序列的DNA区分开来。具体步骤如下：

步骤6.1将静置过夜的样品取出，在冰盒中放置约10分钟左右解冻，然后用移液枪将全部10μl的液体转移到装有大肠杆菌的容积为1ml的离心管中，向该离心管中注入事先调配好的CaCl₂溶液90μl；

步骤6.2指轻弹离心管，使溶液混合均匀；

步骤6.3将离心管在冰冻条件下静置20分钟；

步骤6.4将静置好的溶液在42℃的恒温水浴锅中加热1min，以激活大肠杆菌，同时使质粒导入到大肠杆菌体内；

步骤6.5重新恢复到-4℃保存2min；

步骤6.6用移液枪向离心管中加入900μl的SOC培养基；

步骤6.7将加好培养基的样品放入到恒温室内，在37℃的条件下以120r/min固定速率震动保存1.5h；

步骤6.8将反应好的样品用移液枪提取100μl转移到加有氨苄的培养皿中，并用特殊的涂抹棒把样品涂抹均匀；

步骤6.9在37℃的温度下恒温培养16个小时。

步骤7基因验证：通过特殊的技术将单个细菌移植到培养基上在适合的温度和营养条件下进行培养就能得到大量具有指定基因类型的细菌群落，而这些群落可以作为后期DNA测序的样本。具体步骤如下：

步骤7.1将培养好的样品取出，在可见光条件下找出培养基上白色的菌群，并用移液枪枪尖选取白色菌种；

步骤7.2将提取的白色菌种转移到另外一只培养基上的指定位置，然后再培养16个小时；

步骤7.3待菌种长到一定数量后，用刀将菌种从培养基上切下，送相关测序公司测序。

步骤8菌种培养基和铀试剂的配制。具体步骤如下：

步骤8.1培养基配方：KH₂PO₄ 0.5g、NH₄CI 1.0g、CaCI₂.2H₂O 0.1g、Na₂SO₄1.0g、MgSO₄、7H₂O 2.0g、乳酸钠3.5ml、酵母抽提物1.0g、维生素C 0.1g、巯基乙酸钠0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.5g，按培养基配方称量好培养基所需药品；

步骤8.2然后领取一三角瓶称取5mg铀加热溶于浓硝酸，直至液体变为淡黄色，无铀矿粉末存在为止；将溶解后的铀溶液与之前称量药品混合，加蒸馏水至1L，调节ph至7.5；

步骤8.3分装至不同的三角瓶中，每瓶50ml，121℃灭菌30min。

步骤9微生物的分离和培养。具体步骤如下：

步骤9.1利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，很容易地分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。例如硫酸盐还原菌最佳培养环境为pH为7-8，Eh值在-100mV以下，温度在30-40℃，无氧条件；铁还原菌在ph为6，温度30℃，无氧条件下生长较好。铁细菌在pH值为6-7，温度为22-25℃，有氧富铁质环境下有利于培养。经过多次重复移种。最后富集的菌株很容易在固定培养基上长出单菌落。

步骤10微生物与铀富集的关系研究。具体步骤如下：

步骤10.1在37℃条件下，将步骤9中得到的单菌落微生物与步骤8中得到的含铀溶液混合20天；

步骤10.2将步骤10.1中得到了混合样品制片观察。将混合样品经2.5％的戊二醛溶液固定，经蒸馏水和分别为30％、50％、70％、80％、90％梯度浓度酒精清洗和脱水后，置冷冻干燥机内真空烘干；

步骤10.3将步骤10.2中所得样品进行沾台，喷金。然后在扫描电镜下观察，可以发现在微生物菌细胞内、外均有铀酰矿物沉淀产生。这是由于一方面微生物从还原U⁶⁺过程中得到生长能，其代谢过程中产生的化学配位体(如磷酸盐配位体等)和排泄物配合铀酰；另一方面微生物细胞中的负电荷与带正电荷的UO₂ ²⁺间产生的生理化学作用(生物吸附、吸收、离子交换等)，和溶液pH值、磷酸盐含量的变化导致的溶液的化学状态的改变，导致了铀在菌胞内的富集。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。本发明中未作详细描述的内容均可以采用现有技术。

Claims

1.一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：

(4)目的基因的纯化，去除杂质DNA；

(5)基因连接；

(6)基因克隆；

(7)基因验证；

(8)菌种培养基和铀试剂的配制；

(9)微生物的分离和培养；

(10)微生物与铀富集的关系研究。

2.根据权利要求1所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(2)中能够使DNA充分溶解的盐浓度为2mol/L，将钠磷酸盐、MT缓冲溶液和含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，将装样完成的裂解基质管在12000g条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来，完成粗提；使用蛋白质沉淀剂PPS将蛋白质同DNA进行分离；使用DNA吸附质配合乙醇洗液去除粗提样品中的硅酸盐物质。

3.根据权利要求2所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(3)中PCR技术包括：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火和延伸三过程，将增殖好的DNA样品用荧光染料进行染色，然后将样品放入到填充有分离树脂的点泳池内进行电泳，30min后检测电泳池中的荧光分布情况，将带有荧光的部分切割下来。

4.根据权利要求3所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，将经过PCR复制后的树胶取出，放入到一只离心管中，向离心管中加入Buffer DEA，离心去除树脂，保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer DEA和BufferDEB，离心重洗，弃滤液保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer W2，离心并重复操作；将DNA制备管重置于一只离心管中，向制备管中加入高纯水并离心；弃DNA制备管，保留离心管中的滤液。

5.根据权利要求4所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(5)中，取一只离心管，分别加入Buffer 2PL、T载体、步骤(4)中的滤液和T4连接酶，在-80℃温度条件下静置，完成基因连接。

6.根据权利要求5所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(6)中，将静置的样品取出解冻，然后将全部液体转移到装有大肠杆菌离心管中，向该离心管中注入CaCl₂溶液；溶液混合均匀后在冰冻条件下静置；将静置好的溶液在42℃的恒温水浴锅中加热；向离心管中加入SOC培养基，在恒温室中以120r/min固定速率震动保存；将反应好的样品转移到加有氨苄的培养皿中，并用涂抹棒把样品涂抹均匀；恒温培养16个小时。

7.根据权利要求6所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(7)中，将培养好的样品取出，在可见光条件下找出培养基上白色的菌群，并用移液枪枪尖选取白色菌种；将提取的白色菌种转移到另外一只培养基上的指定位置，然后再培养16个小时。

8.根据权利要求7所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(8)中，培养基配方：KH₂PO₄0.5g、NH₄CI 1.0g、CaCI₂.2H₂O 0.1g、Na₂SO₄1.0g、MgSO₄、7H₂O 2.0g、乳酸钠3.5ml、酵母抽提物1.0g、维生素C 0.1g、巯基乙酸钠0.1g、FeSO₄.7H₂O 0.5g，按培养基配方称量好培养基所需药品；称取5mg铀加热溶于浓硝酸，直至液体变为淡黄色，无铀矿粉末存在为止，将溶解后的铀溶液与之前称量药品混合，加蒸馏水至1L，调节ph至7.5。

9.根据权利要求8所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：在37℃条件下，将步骤(9)中得到的单菌落微生物与步骤(8)中得到的含铀溶液混合20天；得到了混合样品制片观察；将混合样品经2.5％的戊二醛溶液固定，经蒸馏水和分别为30％、50％、70％、80％、90％梯度浓度酒精清洗和脱水后，置冷冻干燥机内真空烘干；将所得样品进行沾台，喷金，然后在扫描电镜下观察。