CN102250876A - 从生物材料中分离纯化rna的方法 - Google Patents

从生物材料中分离纯化rna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102250876A
CN102250876A CN2011101292535A CN201110129253A CN102250876A CN 102250876 A CN102250876 A CN 102250876A CN 2011101292535 A CN2011101292535 A CN 2011101292535A CN 201110129253 A CN201110129253 A CN 201110129253A CN 102250876 A CN102250876 A CN 102250876A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
precipitation
volume
biomaterial
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011101292535A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102250876B (zh
Inventor
杨湘龙
李学敬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Spring Tide Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201110129253.5A priority Critical patent/CN102250876B/zh
Publication of CN102250876A publication Critical patent/CN102250876A/zh
Priority to US14/117,035 priority patent/US9382576B2/en
Priority to PCT/CN2012/071598 priority patent/WO2012155577A1/zh
Priority to EP12785101.2A priority patent/EP2711421A4/en
Priority to JP2014510644A priority patent/JP5824141B2/ja
Priority to KR1020137032647A priority patent/KR101639650B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of CN102250876B publication Critical patent/CN102250876B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括：(1)将组织器官和甲酰胺、单价阳离子盐水溶液混合，匀浆，得到脱水生物样品；(2)将脱水生物样品与单价阳离子盐水溶液混合，孵育；(3)加入起沉淀作用的单价阳离子盐水溶液，混匀，离心，将上清液倒入另一离心管中；(4)加入异丙醇，混匀，离心，倒掉上相液体、下相液体及介于两相间的残余杂质，得到白色RNA沉淀。本发明的方法能高效剥离生物样品中RNA上蛋白质，避免了产品中残存的蛋白质对产物RNA的分解作用；本发明所用试剂为低毒化合物，对环境和人体的危害小；且操作简便、操作人员不需专业的技术便可操作，设备简单、成本低廉，所得到的RNA得率和纯度都极高。

Description

从生物材料中分离纯化RNA的方法
技术领域
本发明涉及一种RNA的纯化分离方法。
背景技术
核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，可在所有活性细胞中存在。DNA是细胞的遗传物质，其上的基因可被转录为信使RNA(mRNA)，而后者所携带的对应遗传信息又会被翻译为具有功能活性的蛋白。除了mRNA，还有其它的RNA：转移RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，干扰RNA(iRNA)，微小RNA(miRNA)和不均一RNA(hnRNA)。通过检测组织或者细胞中的mRNA，iRNA和miRNA来分析基因的表达与调控是生命科学领域中极其重要的手段，并为细胞提供了极大量的生理指标。检测mRNA，iRNA和miRNA水平的技术多种多样，包括：聚合酶链反应(PCR)、定量聚合酶链反应(qPCR)、实时PCR(Real-Time PCR)、Northern Blotting，生物芯片和转录子组测序等。在所有这些技术中，必须使用所分离的RNA样品，并且该RNA样品不应含有下列在活性细胞中所存在的污染物：基因组DNA，蛋白，脂肪，酚类物质，多糖和其它某些生物分子。[Wyatt，J.R，and Tinoco，I.J.(1993)RNA structure and RNA function，in The RNA World(Gesteland，R.F and Atkins，J.F.，eds.)，ColdSpring Harbore Laboratory Press，Cold Sring Harbor，NY，pp.465-496.]
从生物材料中分离RNA，必须使RNA与DNA及构成生物标本的其它成分分离。纯化RNA的关键是：1、操作过程中必须使包括核酸酶(RNases)在内的具有核酸酶活性的所有酶失活，防止这些酶对RNA的分解作用。2、将天然RNA上附着蛋白完全剥离开，释放裸露RNA到溶液中；这样既可防止RNA随着附着蛋白而一起当成杂质被去掉，用以提高提取RNA的得率，同时又能防止得到的RNA样品中因残存痕量蛋白而导致的RNA分解，以提高所分离RNA的质量和纯度。3、所得到的RNA样品中不能含有任何残余的微量蛋白，因为这些微量蛋白中常常含有具有RNases活性的酶，会导致RNA分解。
在细胞中除了核酸酶之外，还有许多酶具有RNase活性，如真核和原核细胞中都存在具有RNase活性的多种DNA聚合酶，转录酶，逆转录酶等。所以在提取RNA之前，彻底抑制包括RNases在内的所有酶的活性，才是防止RNA分解的关键所在。因此，在得到的RNA样品中，也不能有痕量的蛋白存在，因为痕量蛋白中完全可能存在某些具有RNase活性的酶，导致得到的RNA很快被分解。
许多科学家发明和阐述了各种分离RNA的方法。这些方法大多数依赖于氯化铯密度梯度离心或者苯酚、氯仿抽提，其缺点是耗时、使用有害试剂对环境和人体造成危害、样品被外源性核酸和蛋白污染。[U.S.Pat.Nos.5,075,430；5,234,809；5,155,018；6,277,648；6,875,857；6,958,392；6,953,686；6,310,199；6,992,182；6,475,388；5,075,430；7,074,916；U.S.PatentPublication No.20060024701；European Patent No.EP0765335；Boom et al.1990，J.ClinicalMicrobiology 28：495；Cox，R.A.(1968)The use of guanidinium chloride in the isolation ofnucleic acids Methods Enzymol 12，Part B，120-129；Chirgwin，J，M.，Przybyka，A.E.，MacDonald，R.J.，Rutter，W.J.(1979)Isolation of biologically active ribonucliec acid from sourcesinriched in ribonuclease.Biochemistry 18(24)，5294-5299]
在早期的RNA提取中，使用苯酚和氯仿进行蛋白抽提[Kirby，K.S.(1968)Isolation ofnucleicacids with phenolic solutions，Methods Enzymol 12，part B，87-99.]；该方法中，有相当一部分没有完全剥离掉蛋白的RNA分子，会连着去掉的蛋白而被当成杂质去掉；而在所得到RNA样品中还有一部分RNA还附着少量的蛋白，因此需要反复的苯酚和氯仿抽提去掉残存的蛋白。这就导致了所提取的RNA的得率极低、整个RNA提取过程繁杂冗长、而且不能完全去除的痕量蛋白常常导致所提取的RNA被分解。[Ingle，J.and Burns，R.G.(1968)The loss ofribosomal ribonucleic acid during the preparation of nucleic acid from certain plant tissues by thedetergent-pjenol method，Biochem J.110，605，606]
为了克服苯酚和氯仿抽提法所提取RNA的诸多缺陷，有人使用氯化铯梯度离心法，只选择性沉淀RNA，可以获得极高纯度的核酸，是一种代替苯酚、氯仿抽提的方法，但该方法需要极其昂贵的设备，严格的操作训练和繁杂的操作过程，没有在普通实验室应用的可能，更不具备推广价值。[Glisin，V.，Crkvenjakov，R.，and Byus，C(1974)Ribonucleic anid isolated bycesium chloride centrifugation.Biochemistry 13，2633-2637.]
目前应用最多的Chomczynski，P.的美国专利United States Patent 5,945,515和论文公开的技术。[Chomczynski，P.and Sacchi，N，(1987)Single-step method ofRNA siolation of biologicallyactive ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.Biocemistry 18，5294-5299；andSacchi，N，(1987)Single-step method of RNA siolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Bilchem 162(1)，156-159.]
Chomczynski，P.在其专利中公开了同时分离RNA、DNA和蛋白的一种溶液。该溶液含有硫氰酸胍、40～60％的苯酚，作为苯酚稳定剂的甘油，和保持溶液pH值为4的缓冲液。该溶液是一种均一混合物(即单相液)，通过加入10％的氯仿，可将其进行有效的分相，导致RNA分配到水相，而蛋白和DNA则集中在有机相和两相之间。加入等体积的异丙醇到水相，可进行RNA的沉淀。通过离心而得到的RNA沉淀，可用70％乙醇洗涤，并晾干。
该方法的优点是与以往的技术相比，其操作时间大大缩短为不到1小时，操作强度也大大降低。产品的纯度高，效率高。但该方法仍然存在下列的许多问题，只能用于实验室，而不能广泛推广使用：
需要昂贵的实验室条件，如高速冷冻离心机，液氮，低温冰箱，通风橱等。
需要熟练的技术人员，即使用该方法，需要培训专门人员和实验工作经验。
所用耗材，如离心管、微量加样器吸头、玻璃器皿和试剂，都需要DEPC水处理，或者高温、长时间烘烤，以去掉顽固性RNases对RNA的分解作用。这是需要大量时间和精力的。
不仅使用高毒化合物苯酚和氯仿，而且使用剧毒的高浓度(2～5M)胍盐溶液，对健康极其有害---硫氰酸胍和盐酸胍被CHIP(英联邦化学制剂危害信息与包裹)定为有害品，也被HCS(美国危险交通设备标准)认为是有毒试剂。
E.虽然高浓度胍盐和苯酚、氯仿联合剥离RNA上的蛋白之效果极大提高，但仍不能完全剥离RNA上的蛋白-----这常常导致一些生物材料所提取RNA之得率的降低，并且由于得到的RNA样品中残存微量的蛋白，这些微量蛋白中的Rnases会导致所提取RNA的分解。
F.还有，对于不溶于胍盐的组织，特别是植物的大多数组织，使用高浓度胍盐的方法是不会产生任何RNA。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种安全、简易、快速和高效的、并适于普通实验室应用和工业化生产的从生物材料中分离纯化RNA的方法。
本发明的技术方案概述如下：
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)用下述两种方法之一种制备脱水生物样品：
方法一：将组织器官加入到体积比为1000∶0-1000的甲酰胺与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液的混合液中，在0～25℃匀浆5s～20min，得到脱水生物样品；所述组织器官和所述混合液的比例为0.5～200mg∶1ml，所述组织器官为动物、植物或真菌的组织器官；
方法二：将单细胞沉淀中加入到体积比为1000∶0-1000的甲酰胺与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液的混合液中，在0～25℃悬浮或在0～37℃匀浆20s～20min，得到脱水生物样品；所述单细胞沉淀来自革兰氏阳性菌培养细胞、革兰氏阴性菌培养细胞、真菌培养细胞、动物培养细胞、植物培养细胞、血液细胞或精液细胞；
(2)按体积比为200∶0～200，将所述脱水生物样品与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液混合或按体积比为160∶50∶40将所述脱水生物样品、3M-13.5M单价阳离子盐水溶液和质量浓度为5％-40％的十二烷基硫酸钠的甲酰胺溶液混合，在0～95℃孵育0.5～120min，在0～40℃放置0～10min；
(3)按体积比为200∶400～1000向步骤(2)获得的产物中加入起沉淀作用的3.3M-5M的单价阳离子盐水溶液，混匀，在4～25℃下，2000～16000g离心0.15～30min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)按体积比为900∶300～800的比例，向上清液中加入异丙醇，混匀，在4～37℃下，2000～16000g离心1～30min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
所述还包括下述步骤：用体积百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液洗涤白色RNA沉淀，在4～37℃，2000～16000g离心10～60s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。
所述组织器官和所述混合液的比例为5～100mg∶1ml。
所述单价阳离子盐为氯化锂、氯化钠或氯化钾至少一种。
所述单价阳离子盐为氯化钠或氯化锂。
所述起沉淀作用单价阳离子盐为氯化锂、氯化钠和氯化钾至少一种。
所述起沉淀作用单价阳离子盐为氯化钠和氯化钾。
所述步骤(4)为：按体积比为700∶400～600的比例，向上清液中加入异丙醇，混匀，在20～25℃下，8000～12000g离心2min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
实验证明本发明的方法能够高效剥离生物样品中的RNA上的蛋白质，获得纯品RNA产品，避免了现有技术存在的产品中残存的蛋白质对产物RNA的分解作用；本发明所用试剂为低毒化合物，对环境和人体的危害小；由于不易被分解，所获得的产品可方便于远途运输和室温存贮；本发明操作简便、操作人员不需专业的技术便可操作，设备简单、成本低廉，所得到的RNA得率和纯度都极高。
该发明适于普通实验室应用和工业化生产。
附图说明
图1为实施例1和实施例2所获得的产品的电泳图。
图2为实施例3产品的电泳图、产率及纯度比值。
图3为实施例4产品的电泳图、产率及纯度比值。
图4为实施例5产品的电泳图、产率及纯度比值。
图5为实施例10使用5MNaCl水溶液的解离时间和油菜幼叶RNA得率之间的关系。
图6为实施例11用于解离作用的13.5MLiCl水溶液体积和山楂树幼叶RNA得率之间的关系。
图7为实施例12使用13.5M LiCl水溶液的解离时间和山楂树幼叶RNA得率之间的关系。
图8为实施例13使用13.5M LiCl水溶液的解离温度和杨树幼叶RNA得率之间的关系。
图9为实施例14使用油菜幼叶匀浆液的解离作用之后之冷却时间和RNA得率的关系。
图10为实施例15的用本发明方法和Trizol试剂法分别提取小鼠肝脏RNA样品中的β-actin mRNA之RT-PCR扩增比较。
图11为实施例16的用本发明方法和Trizol试剂法分别提取油菜幼叶RNA样品中的β-actin mRNA之RT-PCR扩增比较。
图12为实施例18的小鼠肝脏质量与甲酰胺体积之比例和RNA样品得率的关系。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域的技术人员能够理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1用甲酰胺悬浮的大肠杆菌细胞中RNA在高温下不分解
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)将已经接种了大肠杆菌菌株JM109(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)的LB培养基在37℃180转/分摇床上过夜培养；在1.5ml离心管中加入1ml的该大肠杆菌培养菌液，室温下8,000g以上离心1分钟，然后倒掉液体；再如上重复一次离心，然后用微量加样器吸去残余液体，得到大肠杆菌菌株JM109细胞沉淀；向大肠杆菌菌株JM109细胞沉淀中加入160μl甲酰胺，在25℃悬浮15s，得到脱水生物样品；大肠杆菌菌株JM109细胞沉淀和甲酰胺的比例为5mg∶160μl；
(2)向160μl脱水生物样品中加入40μl质量百分浓度为20％十二烷基硫酸钠(SDS)的甲酰胺溶液，混匀，在80℃孵育10min，以破裂细菌细胞，在0℃放置5min；
(3)向步骤(2)获得的产物中加入起沉淀作用的600μl 3.3M NaCl水溶液，蜗旋震荡混匀，并冰浴5分钟，在4℃下，8000g离心1min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)向上清液中加入600μl异丙醇混匀，在4℃下，8000g离心2min，倒掉液体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
用体积百分浓度为70％的乙醇水溶液洗涤离心管底部的沉淀；在在4℃，8000g离心30秒钟，倒掉洗涤液后，倒扣离心管于滤纸上，以晾干沉淀，加入150μl的注射用水溶解沉淀，用于检测。
琼脂糖凝胶电泳检验：取0.4μl上述RNA水溶液样品在1.2％的非变性琼脂糖凝胶(1xTAE电泳缓冲液)中电泳，以4V/cm的电压电泳30分钟。
琼脂糖凝胶电泳结果：电泳图谱如图1中的1道所示，该大肠杆菌RNA溶液样品的16srRNA，23srRNA边缘整齐，证明所提取的大肠杆菌RNA溶液中RNA分子没有被分解。
归纳：实施例1的结果说明了用甲酰胺悬浮大肠杆菌细胞后，即使在80℃下进行该细胞的孵育，可完全抑制甲酰胺溶液中的具有RNases活性的所有酶，防止了RNA分子被分解。
实施例2用异丙醇抽提杂质和离心沉淀RNA方法去掉RNA样品中的核酸酶
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)-(2)同实施例1；
(3)向步骤(2)获得的200μl产物中加入起沉淀作用的700μl含有3.57MNaCl，1.14MKCl的水溶液，蜗旋震荡混匀，在室温下，16000g离心5min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)向上清液中加入500μl异丙醇混匀，在25℃下，16000g离心10min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
用体积百分浓度为80％的乙醇水溶液洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。
加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。取RNA样品各50μl到两个离心管中，在70℃下分别孵育5分钟、60分钟。最后取出这两个离心管放于室温下冷却。
琼脂糖凝胶电泳检测：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳结果：电泳图谱如图1中的2、3道RNA样品分别进行了5分钟、60分钟的70℃保温，其结果显示，该大肠杆菌RNA溶液的两种孵育处理后样品完全一样，即为它们的16s rRNA，23s rRNA边缘整齐，证明所提取的大肠杆菌RNA溶液中RNA分子在长时间的保温试验后仍然没有被分解。
实施例2归纳：使用异丙醇抽提杂质和离心沉淀RNA方法提取大肠杆菌细胞RNA，所得的RNA溶液样品中完全不含有可分解RNA的任何核酸酶。
实施例3甲酰胺中的SDS促进蛋白-RNA复合物的分开
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
分别称取一定质量的SDS固体，放于1.5ml离心管中，并加入1ml甲酰胺液体，放于70℃下保温10分钟，以溶解SDS固体，以获得1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％SDS的甲酰胺溶液；将已经接种了大肠杆菌菌株JM109的LB培养基在37℃180转摇床上过夜的培养；取2ml过夜培养的菌液，加入到37℃下保温的100ml LB培养基，并在37℃180转摇床上培养3～4小时，其600nm的吸光度值达到约0.8；取10个1.5ml离心管，每个离心管中加入1ml的该大肠杆菌培养菌液，室温下8,000g以上离心1分钟，然后倒掉液体；再如上重复一次离心，吸去残余液体。分别用200μl含有0.00％(对照组)、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％SDS的甲酰胺溶液，悬浮该离心管中的细胞沉淀；
将离心管80℃下孵育10分钟，以破裂细菌细胞。然后将离心管冰浴5分钟以上；
(3)～(4)同实施例2；
用体积百分浓度为80％的乙醇水溶液洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图2-1所示，所有的处理所得到的RNA样品的23s rRNA和16s rRNA条带边缘清晰，表明RNA没有被分解。另外，4道的RNA条带最亮，表明4％SDS-甲酰胺悬浮液用于细胞裂解，可以获得最大的得率。
分光光度计测定：取RNA溶液样品75μl，加入到石英比色杯中的2ml TE溶液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)中混匀，并以TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)为对照，在紫外分光光度计上进行260nm，280nm的吸光度测定。
分光光度计分析结果：如图2-2显示，不存在SDS的情况下，也能产生RNA；但随着双价阳离子SDS浓度的增高，解离作用越来越强，但使用4.00％SDS的细胞裂解液是最高解离效果。所有的RNA样品的OD260/OD280皆在2.1-2.25之间，如图2-3显示，表明其无蛋白污染，没有、或者只有极微量DNA污染。
实施例3归纳：该实施例说明了不同浓度的SDS甲酰胺溶液在80℃下对大肠杆菌细胞进行裂解和分开蛋白-RNA复合物的效果。悬浮大肠杆菌的甲酰胺溶液在80℃下能进行大肠杆菌细胞裂解和分开蛋白-RNA复合物(即解离作用)；但是SDS对解离作用有促进作用；于80℃10分钟解离作用时，使用4％SDS-甲酰胺溶液悬浮大肠杆菌细胞时，可获得最大RNA得率。
实施例4甲酰胺中的钠离子(Na+)促进蛋白-RNA复合物的分开
从生物材料大肠杆菌菌株ATCC27853中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)将已经接种了大肠杆菌菌株ATCC27853(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)的LB培养基在37℃180转/分摇床上过夜的培养。取2ml过夜培养的菌液，加入到37℃下保温的100ml LB培养基，并在37℃180转/分摇床上培养3～4小时，其600nm的吸光度值达到约0.8。取10个1.5ml离心管，每个离心管中加入1ml的该大肠杆菌培养菌液，室温下8,000g以上离心1分钟，然后倒掉液体；再如上重复一次离心，吸去残余液体，得到大肠杆菌单细胞沉淀。
在0℃下，向各个单细胞沉淀的离心管中分别加入200μl甲酰胺进行悬浮；
(2)向各个离心管中分别加入：
0μl 5M NaCl(对照组)、5μl 5M NaCl、10μl 5M NaCl、15μl 5M NaCl、20μl 5M NaCl、25μl 5M NaCl、30μl 5M NaCl、40μl 5M NaCl、50μl 5M NaCl、75μl 5M NaCl，混匀，于80℃下孵育10分钟，以破裂细菌细胞，然后将离心管室温下放置2分钟；
(3)向步骤(2)获得的各个产物中加入起沉淀作用的700μl含有3.57MNaCl，1.14MKCl的水溶液，蜗旋震荡混匀，在室温下，16000g离心1min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)向上清液中加入500μl异丙醇混匀，在25℃下，12000g离心2min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图3-1所示，使用200μl甲酰胺溶液和10～50μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，所得到的RNA样品的23s rRNA和16s rRNA条带边缘清晰。另外，用200μl甲酰胺溶液和20～30μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，可获得很高的RNA产量。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图3-2显示，不存在NaCl的情况下，也能产生少量RNA；但随着加入的5M NaCl水溶液体积的增高，所提取的大肠杆菌的RNA产量越来越大，使用200μl甲酰胺溶液和20μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，可获得最高的RNA产量。使用200μl甲酰胺和10μl-50μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，所得到的RNA样品的OD260/OD280皆在2.1～2.25之间(图3-3显示)，表明其无蛋白污染，没有或者只有极微量DNA污染。
实施例4归纳：该实施例说明使用200μl甲酰胺溶液和10～50μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，并在80℃下孵育，可以对大肠杆菌细胞进行裂解和有效分开蛋白-RNA复合物，产生裸露的RNA分子。用200μl甲酰胺溶液和20μl 5M NaCl溶液来悬浮细胞沉淀，可获得最高的RNA产量，并且无蛋白污染和RNases污染。将上面的结果与实施例3归纳相比较，可以得出：通过加热作用，在甲酰胺中的钠离子(Na+)可以有效地分开细菌之蛋白-RNA复合物，产生裸露的完整RNA分子。
实施例5用白菜幼叶的甲酰胺匀浆液和不同体积的5MNaCl(解离剂)之混合液的RNA提取
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入3ml 4℃储存的甲酰胺和300mg的白菜幼叶(购自市场)，并进行匀浆20s；
(2)在室温下，取6个1.5ml离心管，每个离心管中加入200μl的白菜幼叶的甲酰胺匀浆液，并分别加入20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、75μl 5M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；
将离心管进行90℃下孵育10分钟。然后将离心管于室温下放置5分钟；
(3)～(4)同实施例2。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图4-1所示，使用200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液和20～75μl 5M NaCl水溶液来悬浮细胞沉淀，所得到的RNA样品的26s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。另外，用200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液和40～60μl5M NaCl水溶液混合后所提取的RNA溶液，具有最亮的18s rRNA和26s rRNA电泳带谱，即其是具有最高的RNA得率。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图4-2显示，随着加入到200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液的5M NaCl的增高，所提取的大白菜幼叶的RNA得率越来越大，但使用200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液和50μl 5M NaCl溶液来进行90℃孵育，可获得最高的RNA得率。所有的RNA样品的OD260/OD280皆在2.1～2.25之间，如图4-3显示，表明其无蛋白污染，没有或者只有极微量DNA污染。
实施例5归纳：该实施例说明使用200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液溶液和10～50μl5M NaCl水溶液来悬浮细胞沉淀，并在90℃下孵育，可以有效地分开真核细胞的蛋白-RNA复合物，产生裸露的RNA分子。用200μl的白菜幼叶之甲酰胺匀浆液和50μl 5M NaCl水溶液来进行90℃的孵育，可获得最高的RNA产量，并且无蛋白污染和RNases污染。
实施例6小鼠肝脏RNA的提取(1)
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入2ml 4℃储存的甲酰胺溶液和200mg的新鲜的小鼠(京白1号，购自中国医学科学院血液学研究所)肝脏，并进行匀浆20s；
(2)在室温下，在1.5ml离心管加入200μl步骤(1)获得的小鼠肝脏的甲酰胺匀浆液和50μl 5M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)向步骤(2)获得的200μl产物中加入起沉淀作用的700μl含有3.57MNaCl，1.14MKCl的水溶液，蜗旋震荡混匀，在室温下，16000g离心5min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)向上清液中加入500μl异丙醇混匀，在25℃下，16000g离心10min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得到的RNA样品的28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：所提取小鼠肝脏RNA的得率为5.2μg/mg，所得的RNA溶液的260nm吸光度与280nm吸光度的比值为2.22。
实施例6归纳：使用本发明的方法，可以很好地提取动物组织RNA。
实施例7小鼠肝脏RNA的提取(2)
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，倒扣离心管于滤纸干燥沉淀；再加入1ml体积百分浓度为95％的乙醇水溶液浸泡RNA沉淀，并该离心管盖上盖后，于室温下浸泡30天，离心，倒掉95％乙醇液体，倒扣离心管于滤纸上晾干RNA沉淀；最后加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得到的RNA样品的28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1；该结果与实施例6的分光光度计分析结果接近。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：所提取小鼠肝脏RNA的得率为5.4μg/mg，所得的RNA溶液的260nm吸光度与280nm吸光度的比值为2.24；该结果与实施例6的分光光度计分析结果接近。
实施例7归纳：使用本发明的方法所提取的RNA沉淀，就是在室温，体积百分浓度为95％的乙醇水溶液中浸泡保存，仍无分解。
实施例8小鼠肝脏RNA的提取(3)
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入2ml 4℃储存的甲酰胺与0.5ml 5M NaCl水溶液的混合液混匀，再加入200mg的新鲜的小鼠(京白1号)肝脏，匀浆1min，
(2)在室温下，在1.5ml离心管加入250μl步骤(1)获得的小鼠肝脏的甲酰胺匀浆液，然后将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：所提取小鼠肝脏RNA的得率为4.95μg/mg，所得的RNA溶液的260nm吸光度与280nm吸光度的比值为2.15；该结果与实施例6的分光光度计分析结果接近。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得到的RNA样品的28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1；该结果与实施例6的分光光度计分析结果接近。
实施例8归纳：用甲酰胺和5M NaCl水溶液按照4∶1的体积比匀浆小鼠肝脏，用于提取RNA，也获得了高质量和高得率的RNA样品。
实施例9小鼠小肠RNA的提取
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在1.5ml离心管中加入1ml 4℃储存的甲酰胺和100mg的新鲜的、用生理盐水洗净的小鼠(京白1号)小肠，在37℃下用电泳匀浆器进行三次(20000rpm、20秒匀浆)；
(2)同实施例6；
(3)向步骤(2)获得的200μl产物中加入起沉淀作用的700μl含有3.57MNaCl，1.14MKCl的水溶液，蜗旋震荡混匀，在室温下，2000g离心30min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)同实施例6
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得到的RNA样品的28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：所提取小鼠小肠RNA的得率为1.21μg/mg，所得的RNA溶液的260nm吸光度与280nm吸光度的比值为2.22。
实施例9归纳：使用本发明的方法，能高效地提取小鼠小肠的RNA。
实施例10使用5M NaCl水溶液的解离时间和油菜幼叶RNA得率之间的关系
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入5ml 4℃储存的甲酰胺和500mg的新鲜的油菜(Brassica campestris L.)幼叶，并进行充分的匀浆；
(2)在室温下，在7个1.5ml离心管分别加入200μl的白菜幼叶的甲酰胺匀浆液和50μl5M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将离心管进行1、2、5、10、15、20、30分钟、87.5℃下孵育；然后将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图5所示所提取油菜幼叶RNA的得率会随着孵育时间的增长而增大，但在接近孵育时间到达10分钟时，所得RNA得率已经接近最高得率。
实施例10归纳：使用5M NaCl水溶液用于解离剂作用提取RNA，所使用的孵育(解离)时间为10分钟之后，所得到的RNA得率已经接近最大得率。
实施例11用于解离作用的13.5M LiCl水溶液体积和山楂树幼叶RNA得率之间的关系
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入7ml 4℃储存的甲酰胺和700mg的新鲜的山楂(Crataegus pinnatifida)树幼叶，并进行充分的匀浆；
(2)取3组1.5ml离心管，每组皆为9个离心管；在室温下，分别在每组的9个1.5ml离心管中加入200μl的山楂树幼叶的甲酰胺匀浆液和0、4、7、9、10、11、15、20、25μl 13.5MLiCl水溶液，涡旋震荡混匀；将这三组离心管分别在55、75、85℃下进行2分钟孵育；然后将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图6所示，在不同的孵育(解离)温度下提取山楂树幼叶RNA，使用10μl 13.5M LiCl水溶液和200μl的幼叶匀浆液混合液用于解离作用，可以获得最大的RNA得率。
实施例11归纳：使用1份体积13.5M LiCl水溶液和20份体积的山楂树幼叶匀浆液混合液，在某一特定温度下进行孵育(解离)作用，可以获得最大的RNA得率。
实施例12使用13.5M LiCl水溶液的解离时间和山楂树幼叶RNA得率之间的关系
(1)在冰上Downce匀浆器中加入7ml 4℃储存的甲酰胺和700mg的新鲜的山楂(Crataegus pinnatifida)树幼叶，并进行充分的匀浆；
(2)取3组1.5ml离心管，在室温下，分别在每组的6个1.5ml离心管中加入200μl的山楂树幼叶的甲酰胺匀浆液和10μl 13.5M LiCl(解离剂)，涡旋震荡混匀；然后将这三组离心管分别在55、75、85℃下进行0、1、2、5、10、20分钟孵育；然后将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图7所示，在不同的孵育(解离)温度下提取山楂树幼叶RNA，所提取幼叶RNA的得率会随着孵育时间的增长而增大，但在接近孵育时间到达2分钟时，所得RNA得率已经接近最高得率。
实施例12归纳：在不同的孵育(解离)温度下使用13.5M LiCl水溶液用于提取RNA，所使用的孵育(解离)时间为2分钟之后，所得到的RNA得率已经接近最大得率。
实施例13使用13.5M LiCl水溶液的解离温度和杨树幼叶RNA得率之间的关系
(1)在冰上Downce匀浆器中加入7ml 4℃储存的甲酰胺和700mg的新鲜的杨树(Populusbonatii Levl)幼叶，并进行充分的匀浆；
(2)在室温下，在8个1.5ml离心管中加入200μl的杨树幼叶的甲酰胺匀浆液和10μl 13.5MLiCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将离心管分别在29、37、45、55、65、75、85、95℃下进行2分钟孵育；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：在29～85℃下进行孵育(解离)作用的RNA之26s rRNA，18s rRNA的条带边缘光滑整齐，所以没有分解。而在95℃下进行孵育(解离)作用的RNA之26s rRNA，18s rRNA的条带模糊不清楚，表明该RNA样品已经被分解了。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图8所示，在不同的孵育(解离)温度下提取山杨树幼叶RNA，所提取幼叶RNA的得率会随着孵育温度的增长而增大，但在到达85℃孵育(解离)时，所得RNA得率已经接近最高得率。
实施例13归纳：在不同的孵育(解离)温度下使用13.5M LiCl水溶液提取RNA，在到达85℃孵育(解离)时，所得RNA得率已经接近最高得率，而且其没有被分解。
实施例14油菜幼叶匀浆液的解离作用之后之冷却时间和RNA得率的关系。
(1)在冰上Downce匀浆器中加入7ml 4℃储存的甲酰胺和700mg的新鲜的油菜(Brassicacampestris L.)幼叶，并进行充分的匀浆；
(2)取2组1.5ml离心管，在室温下，分别在每组的4个1.5ml离心管中加入200μl的油菜幼叶的甲酰胺匀浆液和50μl 5M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将这2组离心管分别在90℃下进行10分钟孵育；然后将离心管于室温下或者冰浴放置0、2、5、10分钟的时间；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入100μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：如图9所示，匀浆混合液在解离作用之后的过长放置时间，会导致所提取RNA的得率的降低，而在解离作用之后的5分钟内放置，所提取RNA的得率的降低极其微小；在低温下(如0℃)的解离作用后冷却更容易导致RNA得率的降低。
实施例14归纳：在解离作用之后，匀浆混合液不宜放置时间超过5分钟；放置的温度为室温(25℃)较好。
实施例15用本发明方法和Trizol试剂法分别提取小鼠肝脏RNA样品中的β-actin mRNA之RT-PCR扩增比较
1.按照实施例6步骤(1)-(4)提取小鼠(京白一号)肝脏的RNA；用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入50μl的注射用水(无RNases污染)溶解来自约20mg的小鼠肝脏的RNA沉淀；
2.按照Invitrogen公司之Trizol说明书提取50mg的小鼠肝脏RNA，将所得RNA沉淀溶解于50μl无RNases污染的水中；
3.按照KaTaRa公司的说明书，用AMV逆转录酶合成上述两个RNA样品中的第一条cDNA；
4.按照下表加入合成的cDNA溶液和各种溶液；其中primer f和primer r是用于扩增β-actin之cDNA的一对引物，分别为：
β-act in F 5’atcatgtttgagaccttcaaca 3’；
β-act in R5’catctcttgctcgaagtcca 3’；
所扩增的DNA产物长度为318bp；
扩增条件如下：进行94℃下2分钟初始变性；进行35循环的94℃30秒变性、62℃30秒淬火和72℃30秒的延伸反应；进行72℃下2分钟终止延伸反应。
表1
  组成   体积/ul
  cDNA   2
  10×PCR Buffer   2.5
  dNTPs(10mM)   0.5
  primer f(20pmol/ul)   0.25
  primer r(20pmol/ul)   0.25
  Taq酶(2u/ul)   0.5
  Sybr Green I(10×)   1
  ddH2O   18
琼脂糖凝胶电泳：取1μl上述RT-PCR扩增产物在1.2％的非变性琼脂糖凝胶(1xTAE电泳缓冲液)中电泳。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图10所示，使用本发明方法从约20mg小鼠肝脏中所得的RNA样品进行β-actinmRNA扩增，所得的DNA产物片断，与使用Trizol试剂方法从50mg小鼠肝脏中所得的RNA样品对应的DNA产物片断进行比较，其亮度，前者为后者的两倍。
实施例15归纳：使用本发明的方法所提取小鼠肝脏RNA，与用Trizol试剂法所提取小鼠肝脏RNA的样品相比，具有更好的酶学效果。
实施例16用本发明方法和Trizol试剂方法分别提取油菜幼叶RNA样品中的β-actin mRNA之RT-PCR扩增比较
1.按照实施例14步骤(1)-(4)提取油菜(Brassica campestris L.)幼叶的RNA；用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入50μl的注射用水(无RNases污染)溶解来自约20mg的油菜幼叶的RNA沉淀；
2.按照Invitrogen公司之Trizol说明书提取50mg的油菜幼叶的RNA，将所得RNA沉淀溶解于50μl无RNases污染的水中；
3.按照KaTaRa公司的说明书，用AMV逆转录酶合成上述两个RNA样品中的第一条cDNA；
4.按照下表加入合成的cDNA溶液和各种溶液；其中primer f和primer r是用于扩增β-actin之cDNA的一对引物，分别为：
β-act in F 5’ggaatggtgaaggctggtt 3’；
β-act in R5’tcccgttctgcggtagtg 3’；
所扩增的DNA产物长度为578bp；
扩增条件如下：进行94℃下2分钟初始变性；进行35循环的94℃30秒变性、62℃30秒淬火和72℃30秒的延伸反应；进行72℃下2分钟终止延伸反应。
表2
  组成   体积/ul
  cDNA   2
  10×PCR Buffer   2.5
  dNTPs(10mM)   0.5
  primer f(20pmol/ul)   0.25
  primer r(20pmol/ul)   0.25
  Taq酶(2u/ul)   0.5
  Sybr Green I(10×)   1
  ddH2O   18
琼脂糖凝胶电泳：取1μl上述RT-PCR扩增产物在1.2％的非变性琼脂糖凝胶(1xTAE电泳缓冲液)中电泳。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图11所示，使用本发明方法从约20mg油菜幼叶中所得的RNA样品进行β-actinmRNA扩增，所得的DNA产物片断，与使用Trizol试剂方法从50mg油菜幼叶中所得的RNA样品对应的DNA产物片断进行比较，其亮度，前者为后者的数倍。
实施例16归纳：使用本发明提取油菜幼叶RNA的样品，与用Trizol试剂所提取油菜幼叶RNA的样品相比，具有更好的酶学效果。
本发明的方法中单价阳离子盐优选氯化钠和氯化锂，但实验证明，单价阳离子盐还可以选用氯化铷、氯化铯、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铷、乙酸铯、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、乙酸铵至少一种也可以进行RNA的提取。
实验证明，沉淀剂还可以选用氯化铷、氯化铯、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铷、乙酸铯、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵和乙酸铵至少一种。
实施例17多种动植物组织的提取
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上4个1.5ml离心管中加入1ml 4℃储存的甲酰胺，再分别加入100mg的新鲜的杨树成熟叶和小鼠(京白1号，购自中国医学科学院血液学研究所)心脏、小鼠肺脏、与小鼠大腿肌肉，并进行26500rpm的20s电动匀浆处理；
(2)在室温下，在4个1.5ml离心管皆加入50μl 5M NaCl水溶液，再分别加入200μl步骤(1)获得的四种脱水生物样品，然后涡旋震荡混匀；将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入50μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得到的RNA样品的28s rRNA(或者26s rRNA)和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法类似。
分光光度计分析结果：从各组织中所提取RNA样品的得率和纯度分析如表3所示。
表3
实施例17归纳：使用本发明的方法，可以很好地提取多种动、植物组织RNA。
实施例18脱水生物样品中小鼠肝脏质量与甲酰胺体积之比例和RNA样品得率的关系
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上7个1.5ml离心管中加入1ml 4℃储存的甲酰胺后，再分别分别加入10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、400mg、800mg的新鲜小鼠(京白1号，购自中国医学科学院血液学研究所)肝脏组织，并进行26500rpm的20s电动匀浆处理；由于使用800mg小鼠肝脏的处理所得到的液体粘稠而弃用；
(2)在室温下，在6个1.5ml离心管分别加入50μl 5M NaCl水溶液，再分别加入200μl步骤(1)获得的6种脱水生物样品，然后涡旋震荡混匀；将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)～(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：除了400mg小鼠肝脏组织+1ml甲酰胺匀浆处理组所得RNA之带谱呈弥散状态外，其余所得到的RNA样品的28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法类似。
分光光度计分析结果：从各组织中所提取RNA样品的得率分析如图12所示。
实施例18归纳在本发明中，按照1ml甲酰胺和小于20mg小鼠肝脏组织的比例进行匀浆来按照提取RNA，所得RNA样品没有分解；使用1ml甲酰胺和5mg小鼠肝脏组织的比例进行匀浆，可以获得最大的RNA得率。
实施例19本发明中沉淀剂体积用量、异丙醇体积用量和产生盐颗粒析出及液体分相情况的相关关系
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上1个10ml离心管中加入4ml 4℃储存的甲酰胺和0.4g新鲜的杨树幼叶，并进行26500rpm的3次20s电动匀浆处理；
(2)在室温下，按照表4和表5取15个1.5ml离心管，每个离心管中皆加入50μl 5M NaCl水溶液和200μl步骤(1)获得的脱水生物样品，然后涡旋震荡混匀；将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)按照表4、表5，向步骤(2)获得的250μl产物中加入起沉淀作用的含有3.57M NaCl水，114MKCl的水溶液(沉淀剂)，蜗旋震荡混匀，在室温下，16000g离心5min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)按照表4、表5，向步骤(3)获得的上清液中加入异丙醇，涡旋震荡混匀混匀，然后在室温下静置，以观察离心管中的液体是否分为上下两相液体，以及是否产生盐颗粒析出，结果如表4和表5所示；在25℃下，16000g离心10min，倒掉液体及及可能悬浮于液体中的可见的残余杂质固体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀；产生盐颗粒析出的离心管，在加入1ml乙醇水溶液后剧烈震荡，析出的盐颗粒被溶解而去除了。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：根据RNA样品的电泳图谱中26s rRNA和18s rRNA条带边缘是否清晰来判断所提取RNA是否分解。其结果如表4、表5所示。
实施例19归纳从表4、表5可知道，加入异丙醇后产生上下两相液体的处理能获得不分解的RNA产物；其原因是包括具有RNase活性的酶的所有蛋白，介于上下两相之间而被除去了。
表4
Figure BDA0000061943060000161
Figure BDA0000061943060000171
注解：沉淀剂为含有3.57M NaCl，1.14M KCl的水溶液。
表5
注解：沉淀剂为含有3.57M NaCl，1.14M KCl的水溶液。
实施例20
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)同实施例6步骤(1)；
(2)在室温下，在5个1.5ml离心管分别加入200μl步骤(1)获得的小鼠肝脏的脱水生物样品和50μl、100μl、150μl、200μl和250μl的3M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)-(4)同实施例6步骤(3)-(4)；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：使用50μl-200μl 3M NaCl水溶液到200μl生物脱水样品中混合而提取的RNA样品，其28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
实施例20归纳：使用本发明的方法，可以很好地提取动物组织RNA。
实施例21
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上Downce匀浆器中加入1ml 4℃储存的甲酰胺溶液和100mg的新鲜的小鼠脾脏(京白1号，购自中国医学科学院血液学研究所)，并进行匀浆20s；
(2)在室温下，在4个1.5ml离心管加入160μl步骤(1)获得的小鼠肝脏的脱水生物样品和40μl质量体积比分别为10％、20％、30％、40％十二烷基硫酸钠的甲酰胺溶液，以及50μl 5M NaCl水溶液，涡旋震荡混匀；然后将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)-(4)同实施例6步骤(3)-(4)；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得的四种RNA样品，其28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
实施例21归纳：使用本发明的方法，可以很好地提取动物组织RNA。
实验证明用3M NaCl水溶液、10M LiCl水溶液或13.5M LiCl水溶液替代本实施例中5MNaCl水溶液，也可以获得高质量的RNA。
实施例22
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜的小鼠脾脏(京白1号，购自中国医学科学院血液学研究所)用生理盐水冲洗于一个10ml离心管中，然后将获得的细胞悬液平均分装于5个1.5ml离心管中，室温下5000g离心10min，然后吸去液体，再次离心，吸去离心管中的残余液体，得到单细胞沉淀；在室温下，在5个1.5ml离心管加入160μl甲酰胺进行悬浮；
(2)在室温下，在上面的5个1.5ml离心管加入40μl质量浓度比分别为5％、10％、20％、30％、40％十二烷基硫酸钠的甲酰胺溶液，悬浮，然后分别加入50μl 5M NaCl水溶液涡旋震荡混匀；然后将离心管90℃下孵育10分钟，将离心管于室温下放置2分钟；
(3)-(4)同实施例6步骤(3)-(4)；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得的5种RNA样品，其28s rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
实施例22归纳：使用本发明的方法，可以很好地提取动物单细胞的RNA。
实验证明，采用一次性用200μl甲酰胺替代本实施例中的步骤(1)和步骤(2)中所用的甲酰胺和十二烷基硫酸钠的甲酰胺溶液，十二烷基硫酸钠的浓度做相应的改变，也可以获得高质量的RNA。
实验证明，用本发明的方法并采用电动匀浆器对细胞进行破坏，也可以从植物的组织器官、真菌的组织器官、革兰氏阳性菌培养细胞、真菌培养细胞、植物培养细胞、血液细胞或精液细胞获得高质量的RNA。
实验证明，用本发明的方法及其衍生方法所获得的RNA也属于本发明的保护范围。
实施例23
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上5个Downce匀浆器中分别加入2ml 4℃储存的甲酰胺溶液和200mg的新鲜的杨树幼叶，并进行20s、1min、5min、10min和20min匀浆；
(2)-(4)同实施例6；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
分光光度计测定：与实施例3中的分光光度计测定方法相同。
分光光度计分析结果：20s、1min、5min、10min和20min匀浆所RNA的得率为1.2μg/mg，2.2μg/mg，2.8μg/mg，3.1μg/mg，3.2μg/mg。
归纳：组织匀浆越充分，得到的RNA的得率越高。
实施例24
从生物材料中分离纯化RNA的方法，包括如下步骤：
(1)在冰上1个Downce匀浆器中分别加入2ml 4℃储存的甲酰胺溶液和200mg的新鲜的杨树幼叶，并进行5min匀浆；
(2)在冰浴中的一个1.5ml离心管中，分别加入30μl 13.5M LiCl水溶液和200μl来自步骤(1)中的脱水生物样品，涡旋震荡混匀；然后将离心管0℃冰浴中下孵育12小时；
(3)-(4)同实施例6步骤(3)-(4)；
用1ml体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，洗涤白色RNA沉淀，在室温，16000g离心10s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。加入150μl的注射用水(无RNases污染)溶解沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：与实施例1中的琼脂糖凝胶电泳方法相同。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：所得的RNA样品，其26ss rRNA和18s rRNA条带边缘清晰、且两者亮度比例接近2；1。
归纳：低温长时间孵育，得到高质量的RNA。

Claims (8)

1.从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)用下述两种方法之一种制备脱水生物样品：
方法一：将组织器官加入到体积比为1000∶0-1000的甲酰胺与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液的混合液中，在0～25℃匀浆5s～20min，得到脱水生物样品；所述组织器官和所述混合液的比例为0.5～200mg∶1ml，所述组织器官为动物、植物或真菌的组织器官；
方法二：将单细胞沉淀中加入到体积比为1000∶0-1000的甲酰胺与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液的混合液中，在0～25℃悬浮或在0～37℃匀浆20s～20min，得到脱水生物样品；所述单细胞沉淀来自革兰氏阳性菌培养细胞、革兰氏阴性菌培养细胞、真菌培养细胞、动物培养细胞、植物培养细胞、血液细胞或精液细胞；
(2)按体积比为200∶0～200，将所述脱水生物样品与3M-13.5M单价阳离子盐水溶液混合或按体积比为160∶50∶40将所述脱水生物样品、3M-13.5M单价阳离子盐水溶液和质量浓度为5％-40％的十二烷基硫酸钠的甲酰胺溶液混合，在0～95℃孵育0.5～120min，在0～40℃放置0～10min；
(3)按体积比为200∶400～1000向步骤(2)获得的产物中加入起沉淀作用的3.3M-5M的单价阳离子盐水溶液，混匀，在4～25℃下，2000～16000g离心0.15～30min，将上清液倒入另一离心管中；
(4)按体积比为900∶300～800的比例，向上清液中加入异丙醇，混匀，在4～37℃下，2000～16000g离心1～30min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
2.根据权利要求1所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述还包括下述步骤：用体积百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液洗涤白色RNA沉淀，在4～37℃，2000～16000g离心10～60s，倒掉洗涤液后，干燥沉淀。
3.根据权利要求1所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述组织器官和所述混合液的比例为5～100mg∶1ml。
4.根据权利要求1所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述单价阳离子盐为氯化锂、氯化钠和氯化钾至少一种。
5.根据权利要求4所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述单价阳离子盐为氯化钠或氯化锂。
6.根据权利要求1所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述起沉淀作用单价阳离子盐为氯化锂、氯化钠和氯化钾至少一种。
7.根据权利要求6所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述起沉淀作用单价阳离子盐为氯化钠和氯化钾。
8.根据权利要求1所述的从生物材料中分离纯化RNA的方法，其特征是所述步骤(4)为：按体积比为700∶400～600的比例，向上清液中加入异丙醇，混匀，在20～25℃下，8000～12000g离心2min，倒掉上相液体、下相液体及介于上下两相之间的可见的残余杂质固体，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。
CN201110129253.5A 2011-05-18 2011-05-18 从生物材料中分离纯化rna的方法 Expired - Fee Related CN102250876B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110129253.5A CN102250876B (zh) 2011-05-18 2011-05-18 从生物材料中分离纯化rna的方法
US14/117,035 US9382576B2 (en) 2011-05-18 2012-02-24 Method for isolating and purifying RNA from biological materials
PCT/CN2012/071598 WO2012155577A1 (zh) 2011-05-18 2012-02-24 从生物材料中分离纯化rna的方法
EP12785101.2A EP2711421A4 (en) 2011-05-18 2012-02-24 METHOD OF SEPARATING AND PURIFYING RNA FROM BIOLOGICAL MATERIAL
JP2014510644A JP5824141B2 (ja) 2011-05-18 2012-02-24 生体試料よりｒｎａを分離精製する方法
KR1020137032647A KR101639650B1 (ko) 2011-05-18 2012-02-24 생물학적 물질로부터 순수 rna 분리법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110129253.5A CN102250876B (zh) 2011-05-18 2011-05-18 从生物材料中分离纯化rna的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102250876A true CN102250876A (zh) 2011-11-23
CN102250876B CN102250876B (zh) 2014-08-13

Family

ID=44978446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110129253.5A Expired - Fee Related CN102250876B (zh) 2011-05-18 2011-05-18 从生物材料中分离纯化rna的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9382576B2 (zh)
EP (1) EP2711421A4 (zh)
JP (1) JP5824141B2 (zh)
KR (1) KR101639650B1 (zh)
CN (1) CN102250876B (zh)
WO (1) WO2012155577A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155577A1 (zh) * 2011-05-18 2012-11-22 Yang Xianglong 从生物材料中分离纯化rna的方法
CN110468124A (zh) * 2019-08-05 2019-11-19 海南大学 一种维氏气单胞菌总rna提取方法
CN112195176A (zh) * 2020-09-30 2021-01-08 天津大潮基因科技有限公司 从生物材料中分离纯化核酸固体的方法
CN114262753A (zh) * 2014-10-08 2022-04-01 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 用于埃博拉和其他传染病的实时诊断测试(rdt)的方法和装置
CN114657174A (zh) * 2022-03-29 2022-06-24 湖南科技学院 一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014114650A1 (en) * 2013-01-24 2014-07-31 Roche Diagnostics Gmbh Rt-qpcr analysis of micro-dissected material from stained ffpet section
KR20190059523A (ko) 2017-11-23 2019-05-31 경북대학교병원 핵산 추출을 위한 혈액 시료 전처리 방법
CN109022423A (zh) * 2018-09-14 2018-12-18 上海细胞治疗集团有限公司 一种血浆miRNA提取方法
CN110643602A (zh) * 2019-10-24 2020-01-03 安徽师范大学 一种黄山木兰根系总rna的提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001079485A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
CN101260432A (zh) * 2008-04-10 2008-09-10 上海交通大学 利用s1酶切割单链核酸特性的rna定量检测方法
CN101367857A (zh) * 2008-10-16 2009-02-18 上海交通大学 利用硅膜柱吸附rna的rna提取方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5075430A (en) 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5155018A (en) 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
DE4143639C2 (de) 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
JPH06165676A (ja) * 1992-06-16 1994-06-14 Wako Pure Chem Ind Ltd マイコバクテリウム属の菌体からの核酸鎖抽出方法
AU6230594A (en) * 1993-02-01 1994-08-29 University Of Iowa Research Foundation, The Quartenary amine surfactants and methods of using same in isolation of rna
EP1146049B1 (de) 1994-02-11 2005-08-17 Qiagen GmbH Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
WO1995034569A1 (de) 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
US5945515A (en) 1995-07-31 1999-08-31 Chomczynski; Piotr Product and process for isolating DNA, RNA and proteins
US6475388B1 (en) 1996-11-13 2002-11-05 Transgenomic, Inc. Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography
US6958392B2 (en) 1998-10-09 2005-10-25 Whatman, Inc. Methods for the isolation of nucleic acids and for quantitative DNA extraction and detection for leukocyte evaluation in blood products
DE19900638C2 (de) 1999-01-11 2002-12-19 Max Planck Gesellschaft Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien
US6310199B1 (en) 1999-05-14 2001-10-30 Promega Corporation pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids
US6953686B1 (en) 1999-05-28 2005-10-11 Cambrex Bio Science Baltimore, Inc. Methods of DNA purification and purified DNA
CN100386441C (zh) * 2000-11-08 2008-05-07 贝克顿迪肯森公司 收集和稳定生物样品的装置、抑制体外基因诱导的方法和制备全血样品的方法
CA2433746A1 (en) 2001-01-09 2002-07-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
ATE324376T1 (de) 2001-01-16 2006-05-15 Invitrogen Corp Reagenz zur isolierung von rna
US7601491B2 (en) * 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
CN102250876B (zh) * 2011-05-18 2014-08-13 李学敬 从生物材料中分离纯化rna的方法
WO2013074927A1 (en) * 2011-11-16 2013-05-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for isolating total rna from cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001079485A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
CN101260432A (zh) * 2008-04-10 2008-09-10 上海交通大学 利用s1酶切割单链核酸特性的rna定量检测方法
CN101367857A (zh) * 2008-10-16 2009-02-18 上海交通大学 利用硅膜柱吸附rna的rna提取方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155577A1 (zh) * 2011-05-18 2012-11-22 Yang Xianglong 从生物材料中分离纯化rna的方法
CN114262753A (zh) * 2014-10-08 2022-04-01 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 用于埃博拉和其他传染病的实时诊断测试(rdt)的方法和装置
CN110468124A (zh) * 2019-08-05 2019-11-19 海南大学 一种维氏气单胞菌总rna提取方法
CN112195176A (zh) * 2020-09-30 2021-01-08 天津大潮基因科技有限公司 从生物材料中分离纯化核酸固体的方法
WO2022068826A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 天津大潮基因科技有限公司 从生物材料中分离纯化核酸固体的方法
CN112195176B (zh) * 2020-09-30 2023-05-02 天津大潮基因科技有限公司 从生物材料中分离纯化核酸固体的方法
CN114657174A (zh) * 2022-03-29 2022-06-24 湖南科技学院 一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法
CN114657174B (zh) * 2022-03-29 2023-07-25 湖南科技学院 一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140039221A (ko) 2014-04-01
JP2014518625A (ja) 2014-08-07
CN102250876B (zh) 2014-08-13
JP5824141B2 (ja) 2015-11-25
WO2012155577A1 (zh) 2012-11-22
EP2711421A4 (en) 2015-03-11
KR101639650B1 (ko) 2016-07-14
EP2711421A1 (en) 2014-03-26
US20150112054A1 (en) 2015-04-23
US9382576B2 (en) 2016-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102250876B (zh) 从生物材料中分离纯化rna的方法
US8367817B2 (en) Reagents for isolation of purified RNA
Weber et al. PIG-B: a homemade monophasic cocktail for the extraction of RNA
CN105713900A (zh) 基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法
CN101845436B (zh) 一种同时提取堆肥中总dna和rna的方法
CN103290131A (zh) 一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及pcr-rflp检测方法
CN105986025A (zh) 一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法
CN107287227A (zh) 一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用
CN104651390A (zh) 一种构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法
CN103243089B (zh) 一种鞣制动物标本皮张dna的提取方法
CN110305862B (zh) 一种从浓香型白酒酒醅中提取总rna的方法
CN110408613B (zh) 一种木材靶向细胞dna提取方法
CN102643795A (zh) 一种采用pvp预处理提取土壤微生物总dna的方法
CN104178482A (zh) 从浓香型大曲中提取微生物总dna的方法
CN107400719B (zh) 一组柞蚕微孢子虫检测引物及其应用
CN116694623B (zh) 用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取dna、rna以及蛋白质的裂解液及其提取方法
CN109055360B (zh) 一种提取按蚊总rna的方法
Parimoo et al. Sample Preparation in DNA Analysis
RU2294633C2 (ru) Биологический маркер для определения породы рыб, набор и способ определения породной принадлежности рыб
CN103981174A (zh) 冷冻原肠中微生物基因组dna的提取方法
KR20030028498A (ko) 객담에서 ｒｎａ를 추출하는 방법
Schwiesow RNA Extraction Without A Kit
CN113817722A (zh) 从骆驼乳粉中提取纯化dna的方法，及应用所述方法的骆驼乳粉的检测方法
Specifications MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit
CN103173437A (zh) 一种优秀冰雪运动员线粒体dna分离与纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200608

Address after: Unit 25, n212, experimental building, Tianjin International Biomedical Research Institute, No.220, Dongting Road, Tianjin Economic and Technological Development Zone, Binhai New Area, Tianjin, 300457

Patentee after: Tianjin spring tide Gene Technology Co.,Ltd.

Address before: 300384 Tianjin city Nankai District Huayuan District Tianhua in 28-5-202

Patentee before: Li Xuejing

TR01 Transfer of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140813

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee