CN101845436B - 一种同时提取堆肥中总dna和rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体公开了一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法：首先向堆肥样品中添加去腐缓冲液，振荡混匀，静置，悬浮液进行离心分离；重复本操作至离心后的上清液澄清；用液氮研磨脱腐后的样品至粉状，然后置于裂解液中振荡混匀，再冰浴，离心分离；取裂解后的上清液，加入醋酸钠和抽提缓冲液，振荡后离心分离；取抽提后的上层水相加入氯仿-异戊醇，振荡后离心分离；再加入异丙醇沉淀RNA，经洗涤、干燥、溶解后得到纯化的RNA；取抽提后的有机相加入Tris碱溶液，取离心后的上层水相加入氯仿-异戊醇，离心分离后再加入醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA，经洗涤、溶解后得到纯化的DNA。本发明的方法具有产量大、质量好、成本低等优点。

Description

一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取DNA和RNA的方法，尤其涉及一种提取堆肥中总DNA和RNA的方法。

背景技术

堆肥是指利用自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物或者人工加入的特殊菌种，人为地促进可降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程。由此可见，微生物是堆肥过程的主体，因此充分认识其中的微生物学原理能为改进堆肥处理工艺、提高堆肥处理效率提供依据。对堆肥进行微生物研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术，由于环境中的绝大多数微生物(＞95％)无法通过培养方式进行研究，且堆肥中的微生物种类繁多并经常处于动态变化状态，培养研究无法完全反映系统中微生物的种群动态变化过程。

分子生物学技术是一项可不对微生物进行培养也能对堆肥进行微生物研究的新技术。对于堆肥中微生物的分子生物学研究，其关键在于DNA和RNA的提取与纯化，高质量核酸样品的获得将直接影响到下游分析的可信度。由于堆肥中微生物种类繁多且堆肥成分复杂(常常包含大量的杂质，如腐殖质、多糖、多酚、重金属等)，这给DNA和RNA的提取与纯化带来了很大障碍。而环境中又广泛存在着核糖核酸酶，这使RNA的提取变得更加困难，因此，常规的DNA和RNA提取与纯化方法不能直接应用于堆肥微生物环境中，如何充分使微生物细胞裂解并释放DNA与RNA，有效减少腐殖质等杂质的污染，从而获得高产率和高纯度的DNA与RNA，这是对堆肥微生物群落进行分子生态学研究的关键。此外，传统方法中的DNA和RNA的分离纯化绝大部分都是单独进行，同时提取DNA和RNA的方法较少，纯度也较低，较难满足下游的实验要求，而采用试剂盒提取成本很高。但现代分子生物学研究往往需要同时检测DNA和RNA，通过同时检测来研究堆肥中微生物群落结构及其动态变化，可以弥补单一方法所带来的偏差，提高下游分析结果的可信度，因此寻找一种有效的、低成本的同时提取堆肥微生物中总DNA与RNA的方法意义重大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种产量大、质量好、成本低的同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法，包括以下步骤：

(1)样品的脱腐：先向待提取DNA和RNA的堆肥样品中以8～12ml/g堆肥样品的用量添加预冷的去腐缓冲液，振荡混匀，冰上静置数秒；然后将静置后的悬浮液进行离心分离，弃上清液；重复本步骤直至离心后的上清液澄清透明；

(2)样品的裂解：用液氮研磨上述脱腐后的样品至粉状，然后将粉状样品添加至裂解液中，涡旋振荡混匀，再冰浴使其充分裂解，期间可温和振荡数次，并进行离心分离；由于本发明采用的是液氮作为介质进行研磨，因此不需要特殊的仪器，避免了玻璃珠破碎过于剧烈导致的片段机械损伤，从而能更好地保持DNA和RNA较好的完整性；

(3)核酸的抽提：取上述裂解步骤后得到的上清液，加入体积为该上清液的0.05～0.2倍的醋酸钠溶液，混合后再加入与该上清液等体积的水饱和苯酚-氯仿-异戊醇组成的抽提缓冲液，涡旋振荡后置于冰上5～10min，再进行离心分离；

(4)RNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的上层水相，向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，涡旋振荡混匀后进行离心分离；再取该离心分离后的上层水相，向其中加入等体积冰预冷的异丙醇，于-20℃～-10℃静置20～30min沉淀RNA，再进行离心分离；弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀(2～3次)，再进行离心分离；弃上清，在空气中干燥去除残余的乙醇，经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解、分装后即得到纯化的RNA溶液；

(5)DNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的有机相，向该有机相中加入等体积的Tris碱溶液反相抽提DNA，混匀后离心分离；取离心后的上层水相，并向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后离心分离，回收水相，加入0.05～0.2倍体积的醋酸钠溶液和1.5～2.5倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃～-10℃静置20～30min沉淀DNA，再进行离心分离；去上清后用70％的乙醇洗DNA沉淀，再用含RNase的TE缓冲液溶解得到纯化的DNA溶液。

上述的技术方案中，所述去腐缓冲液优选是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸钠、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂)、吐温-80(Tween-80)与溶剂水配制而成，各溶质组分在所述去腐缓冲液中的浓度分别为：

三羟甲基氨基甲烷盐酸            50～100mM，

乙二胺四乙酸                    50～100mM，

聚乙烯吡咯烷酮                  0.5％～1.0％W/V，

柠檬酸钠                        10～20mM，

氯化钠                          100～200mM，

氯化钙                          10～50mM，

吐温-80                         0.5％～1.0％。

相比于现有的去腐缓冲液，上述去腐缓冲液的组成和配方针对堆肥样品的特性作了进一步的改进和优化，添加去腐缓冲液后，可溶于碱性的部分(例如腐殖酸和富里酸)可以部分被除去，其中聚乙烯吡咯烷酮能有效去除腐殖质、多糖和多酚类物质，吐温-80能有效分散堆肥样品颗粒，减少微生物细胞粘附堆肥样品颗粒，使微生物细胞更大程度地释放到溶液中，CaCl₂能促使微生物细胞膜的通透性增加，有利于后续微生物细胞的裂解；乙二胺四乙酸可以螯合重金属离子，并抑制DNase的活性。因此，上述各组分协同作用，能起到对堆肥样品中腐殖质很好的去除效果。

上述的技术方案中，所述样品裂解液优选是由作为溶质的异硫氰酸胍、柠檬酸钠、N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、β-巯基乙醇与溶剂水配制而成，各溶质组分在所述样品裂解液中浓度分别为：

异硫氰酸胍                         4～6M，

柠檬酸钠                           20～30mM，pH 7.0，

N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)       0.5％～1.0％W/V，

β-巯基乙醇                        100～200mM。

上述的各技术方案中，所述离心分离时的离心加速度优选控制在10000～12000×g，离心时的温度优选控制在2℃～8℃，离心分离的时间优选控制在3～15min。

上述的各技术方案中，所述步骤(2)中，所述裂解液的用量优选为1.0～1.5ml/g堆肥样品，冰浴的时间优选控制在10～20min。

上述的各技术方案中，所述步骤(3)中，所述醋酸钠溶液的浓度优选为2M，pH值优选为4.0～4.5；所述步骤(5)中，所述醋酸钠溶液的浓度优选为3M，pH值优选为5.0～5.5。

上述的各技术方案中，所述抽提缓冲液中水饱和苯酚、氯仿、异戊醇的体积比优选为25；24；1；所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比优选为24∶1。再通过后续的酸性酚-氯仿-异戊醇抽提便能使RNA进入水相，DNA位于酚相和水相的界面，从而同时分离得到DNA与RNA。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的方法能够有效减少堆肥中腐殖质的影响，增强堆肥中微生物的裂解程度，最大程度地提高DNA和RNA的产量和纯度。本发明能够同时从堆肥中提取出DNA和RNA，经纯化后的DNA和RNA具有产量大、质量好等优势，能够用于表征堆肥过程中微生物群落的结构及其动态变化和特定功能基因的表达分析，从而为全面、准确地分析堆肥中微生物的多样性及功能基因的表达奠定良好的基础，以更好地服务于堆肥微生物分子生物学和其他功能基因的研究。

附图说明

图1为本发明实施例中从堆肥中提取的总DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例中从堆肥中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例：

首先进行堆肥的取样。本实施例所用堆肥取自一个20L实验规模的堆肥装置，堆肥由稻草、菜叶、麸皮、土壤按质量比11∶3∶2∶8堆制而成，采样点为堆肥表面以下3cm，一共取三个样品(分别编号为1、2、3)，每个样品1g，取样时间是在堆肥处理5d，温度为38℃，pH值为7.82，含水率为62％，有机质含量为61.3％。

采用本发明的方法对上述堆肥样品进行堆肥微生物总DNA和RNA的提取和纯化，具体包括以下步骤：

1、样品的脱腐

向每个堆肥样品(1g)中分别添加10ml的预冷的去腐缓冲液，然后置于涡旋振荡器上充分振荡混匀60s(30～60s均可)，冰上静置10s(5～10s均可)，然后将静置后的悬浮液体转入一个新离心管中，12000×g，4℃离心3min(2～3min均可)，弃上清液；

重复本步骤操作直至离心后的上清液澄清透明(即重复添加去腐缓冲液洗涤沉淀脱腐，直至上清液澄清透明后即停止操作，完成脱腐处理，一般两到三次即可)。

本步骤中所用到的去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸钠、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂)、吐温-80(Tween-80)与溶剂水配制而成，溶液pH值保持在8.0左右，各溶质组分在去腐缓冲液中浓度分别为：

三羟甲基氨基甲烷盐酸                100mM，

乙二胺四乙酸                        100mM，

聚乙烯吡咯烷酮                      1.0％W/V，

柠檬酸钠                            15mM，

氯化钠                              120mM，

氯化钙                              40mM，

吐温-80                             0.5％。

2、样品的裂解

取上述脱腐后的样品至预冷的研钵中，加入液氮研磨该样品至粉状；然后转入已预盛有1.5ml裂解液的离心管中，涡旋振荡混匀，再冰浴以使其充分裂解，期间可温和振荡数次，然后再进行离心分离；

本步骤所用到的样品裂解液是由作为溶质的异硫氰酸胍、柠檬酸钠、N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、β-巯基乙醇与溶剂水配制而成，各溶质组分在该样品裂解液中的浓度分别为：

异硫氰酸胍                         4M，

柠檬酸钠                           25mM，pH 7.0

N-十二烷基肌氨酸钠                 0.5％，

β-巯基乙醇                        100mM。

3、核酸的抽提

取上述裂解步骤后得到的上清液，先向其中加入0.1倍体积的2M的醋酸钠溶液(pH为4.0)，颠倒混合后再加入与该上清液等体积且冰冷的水饱和苯酚-氯仿-异戊醇组成的抽提缓冲液，其中水饱和苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，涡旋振荡15～30s，置于冰上10min(5～10min均可)，再在12000×g、4℃的条件下离心分离10min。

4、RNA的分离与纯化

取上述核酸抽提后得到的上层水相至另一新离心管中，向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(体积比为24∶1)，涡旋振荡混匀后以12000×g、4℃条件离心5min；再取该离心分离后的上层水相至另一新离心管中，并加入等体积冰冷的异丙醇，置于-20℃条件下放置30min(20～30min均可)以沉淀RNA，再在12000×g、4℃条件下离心15min；弃上清后，用70％的乙醇洗沉淀2次，再在10000×g、4℃条件下离心5min；弃上清后，在空气中干燥微量离心管去除残余的乙醇即得到纯化后的RNA，向纯化后的RNA中加入50μl经DEPC处理过的水，置于冰上15min使RNA样品溶解，分装后置于-80℃保存。

5、DNA的分离与纯化

取上述核酸抽提后得到的有机相，向有机相中加入等体积的1M Tris碱溶液(pH为10.5)反相抽提DNA，温和颠倒混匀后，在10000×g、4℃条件下离心15min；将离心后的上层水相转移到另一个新的离心管中；再向得到的上层水相中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(24∶1)，温和颠倒混匀后以10000×g、4℃条件离心10min；回收水相，加入0.1倍体积的3M的醋酸钠溶液(pH为5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置30min沉淀DNA，然后以10000×g、4℃条件离心10min得到DNA沉淀；再用70％乙醇洗DNA沉淀2次，室温晾干沉淀；再用含RNase的TE缓冲液(pH为8.0)洗脱DNA，得到纯化的DNA溶液。

本实施例最后提取的总DNA琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，其中M为DNA分子量标准λDNA/Hind III(从TIANGEN生物公司购买)，从图1可以看出本发明提取的DNA条带单一，DNA片段长度约为23kb，没有拖尾现象。本实施例最后提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，从图2中可以清晰地看到28S、18S两条带，且28S条带的亮度约为18S条带亮度的两倍，说明本发明方法提取的RNA完整性较好，可用于下游RT-PCR等实验。

Claims (1)

1.一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法，包括以下步骤：

（1）样品的脱腐：先向待提取DNA和RNA的堆肥样品中以8～12 ml/g堆肥样品的用量添加预冷的去腐缓冲液，振荡混匀，冰上静置数秒；然后将静置后的悬浮液进行离心分离，弃上清液；重复本步骤直至离心后的上清液澄清透明；

（2）样品的裂解：用液氮研磨上述脱腐后的样品至粉状，然后将粉状样品添加至裂解液中，所述裂解液的用量为1.0～1.5 ml/g堆肥样品，涡旋振荡混匀，再冰浴10～20 min使其充分裂解，并进行离心分离；

（3）核酸的抽提：取上述裂解步骤后得到的上清液，加入体积为该上清液的0.05～0.2倍、浓度为2 M、 pH值为4.0～4.5的醋酸钠溶液，混合后再加入与该上清液等体积的水饱和苯酚-氯仿-异戊醇组成的抽提缓冲液，所述抽提缓冲液中水饱和苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1；涡旋振荡后置于冰上5～10 min，再进行离心分离；

（4）RNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的上层水相，向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1；涡旋振荡混匀后进行离心分离；再取该离心分离后的上层水相，向其中加入等体积冰预冷的异丙醇，于-20℃～-10℃静置20～30 min沉淀RNA，再进行离心分离；弃上清，用70%的乙醇溶液洗涤沉淀，再进行离心分离；弃上清，在空气中干燥去除残余的乙醇，经过焦碳酸二乙酯处理水溶解、分装后即得到纯化的RNA溶液；

（5）DNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的有机相，向该有机相中加入等体积的浓度为1M 、pH为10.5的Tris碱溶液反相抽提DNA，混匀后离心分离；取离心后的上层水相，并向其中加入等体积的所述氯仿-异戊醇混合液，混匀后离心分离，回收水相，加入0.05～0.2倍体积、浓度为3 M 、pH值为5.0～5.5的醋酸钠溶液和1.5～2.5倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃～-10℃静置20～30 min沉淀DNA，再进行离心分离；去上清后用上述的乙醇溶液洗DNA沉淀，再用含RNase的pH为8.0的TE缓冲液溶解得到纯化的DNA溶液；

所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙、吐温-80与溶剂水配制而成，各溶质组分在所述去腐缓冲液中的浓度分别为： 

三羟甲基氨基甲烷盐酸              50～100 mM，

乙二胺四乙酸                      50～100 mM，

聚乙烯吡咯烷酮                    0.5%～1.0% W/V，

柠檬酸钠                          10～20 mM，

氯化钠                            100～200 mM，

氯化钙                            10～50 mM，

吐温-80                            0.5%～1.0%；

所述裂解液是由作为溶质的异硫氰酸胍、柠檬酸钠、N-十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇与溶剂水配制而成，各溶质组分在所述裂解液中浓度分别为：

异硫氰酸胍                        4～6 M，

柠檬酸钠                          20～30 mM，pH 7.0，

N-十二烷基肌氨酸钠                0.5%～1.0% W/V， 

β-巯基乙醇                        100～200 mM；

所述离心分离时的离心加速度控制在10000～12000 ×g，离心分离时的温度控制在2℃～8℃，离心分离的时间控制在3～15 min。

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