CN101550413B - 堆肥微生物总dna的提取与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法及其缓冲液，包括以下步骤：向待提取DNA的堆肥样品中以8～15ml/g堆肥的用量添加去腐缓冲液进行脱腐；然后以1.0～1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液进行微生物总DNA的粗提；最后用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，得到堆肥微生物总DNA。本发明的方法能够减少腐殖酸的影响，并有效提高堆肥中提取的DNA的产量和纯度，以便更好地服务于堆肥微生物分子生态学和其它功能基因的研究。
Description
技术领域
本发明涉及DNA的提取与纯化方法，具体涉及一种微生物总DNA的提取与纯化方法及所用到的缓冲液。
背景技术
堆肥是指利用自然界广泛分布的细菌、真菌、放线菌等微生物的相互协同作用，人为地促进固体废物中可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的过程，因此，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。对堆肥进行微生物研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术，由于环境中的绝大多数微生物(＞95％)无法通过培养方式进行研究，且堆肥中的微生物种类繁多、经常处于动态变化状态，培养研究无法反映系统中微生物的种群动态变化过程。
目前，分子生物学方法是一种能够不依赖于微生物培养而对微生物进行研究的新技术，要对堆肥中的微生物开展分子生物学研究就必须获取高质、高量的DNA，然后利用PCR扩增、梯度凝胶电泳以及构建克隆文库和DNA测序等对微生物的DNA序列进行分析，从而获取微生物的遗传信息。因此在分子生物学研究中，DNA的提取与纯化是基础工作，高质量核酸样品的获得直接影响到后续分析的可信度。由于堆肥中微生物种类繁多，而且混杂有大量腐殖酸类杂质，特别是随着堆肥反应的进行，腐殖酸类物质的含量越来越多，因此，如何有效减少腐殖酸等杂质的污染，使微生物细胞充分裂解而释放DNA，从而获得高产率和高纯度的DNA是进行堆肥微生物生态学及其它功能基因研究的关键。目前文献中报道的堆肥DNA提取方案都是在DNA提取和纯化过程中对腐殖酸进行处理，但是由于腐殖酸具有一些复杂的理化性质(如极性、氧化还原性、络合与吸附性等)，使得它在DNA的提取过程中不仅会阻止十二烷基硫酸钠(SDS)等变性剂的渗透，抑制溶菌酶、蛋白酶K等的活性，而且一定程度上还会影响裂解缓冲液对微生物的裂解。同时经裂解缓冲液处理后溶出的黄腐酸与棕腐酸既能氧化为醌，又能还原为酚，这样可导致部分DNA随氧化的苯酚进入有机相而丧失。即便在对DNA进行纯化与浓缩的乙醇或异丙醇溶液中，腐殖酸仍与DNA表现出相似的沉淀行为，因此，在对核酸粗提物进行进一步纯化过程中，仍然会有一些理化性质与核酸相近的腐殖酸组分与之共存，从而影响到核酸的定量及后续的PCR扩增、杂交、酶切及克隆等分子生物学操作过程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能减少腐殖酸影响、并有效提高DNA的产量和纯度、以便更好地服务于堆肥微生物分子生态学和其它功能基因研究的堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法，还提供一种能有效脱除堆肥产品中腐殖酸的去腐缓冲液，还提供一种能有效应用于堆肥微生物总DNA提取的DNA提取缓冲液。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法，包括以下步骤：
(1)样品的脱腐：向待提取DNA的堆肥样品中以8～15ml/g堆肥的用量加入去腐缓冲液，然后置于60～65℃的水浴中保温3～8min，保温期间可将样品轻轻搅匀，再以3000～5000×g离心5～7min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的颜色无明显差异(一般重复1～2次即可满足要求)；
(2)DNA的提取：将上述脱腐后的样品置入液氮中保持3～5min，然后以60～65℃的温度解冻15～20min；以1.0～1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液，并在37℃温度下以200～250rpm振荡45～60min；然后以100～150μl/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸钠溶液(W/V为10％)得混合液，65℃水浴1.0～1.5h，水浴时可每隔10～15min上下轻轻颠倒一次；再加入与所述混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂(氯仿与异戊醇的V/V为24∶1)，摇匀后(至乳状)以8000～12000×g离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀1～2h，以10000～13000×g速度离心8～15min；离心后的沉淀以0.8～1.5ml/g堆肥的用量加入预冰冷的乙醇溶液(V/V为70％)进行洗涤，以10000～13000×g速度离心3～5min，然后以500～1000μl/g堆肥的用量将洗涤后的堆肥样品溶于TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；
(3)DNA的纯化：用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.25～0.5μg/ml的核糖核酸酶A(RnaseA)，37℃水浴中消化30～40min以除去RNA，得到纯化后的堆肥微生物总DNA。
上述技术方案中，所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、焦磷酸钠(Na4P2O7)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氯化钠(NaCl)、曲拉通X-100(Triton X-100)与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为：
Tris-HCl 50～100mM
Na4P2O7 100～150mM
Na2EDTA 50～100mM
PVP 0.5～1.0％W/V
NaCl 100～200mM
Triton X-100 0.02～0.06％V/V。
上述去腐缓冲液除了可用于本发明的DNA提取和纯化工艺，也可用于需要对堆肥产品进行腐殖酸脱除的其他场合。以上配制得到的去腐缓冲液的pH值一般保持在10.0左右。
上述技术方案中，所述DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸钠(Na3PO4)、氯化钠(NaCl)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为：
Tris缓冲液 0.1～0.15M
EDTA 0.1～0.15M
Na3PO4 0.1～0.12M
NaCl 1～1.5M
CTAB 1～2％W/V
蛋白酶K 0.1～0.2mg/ml。
上述DNA提取缓冲液除了可用于本发明的DNA提取和纯化工艺，也可用于需要对堆肥微生物进行总DNA提取的其他场合。以上配制得到的DNA提取缓冲液的pH值一般保持在8.0左右。
上述技术方案中，所述TE缓冲液是由作为溶质的Tris-HCl、EDTA与溶剂水配制而成，各溶质组分在TE缓冲液中的浓度分别为：
Tris-HCl 10mM
EDTA 1mM。
以上配制得到的TE缓冲液的pH值一般保持在8.0左右。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的方法首先是对堆肥样品中的腐殖酸和其它杂质进行洗脱，这样既减少了腐殖酸类物质的污染，又避免了这些物质对后续DNA提取过程的干扰；据此，本发明专门研制了一种新的去腐缓冲液，该去腐缓冲液中含有的Na4P2O7、Na2EDTA、PVP等均具有较好的脱腐功能，并通过大量实验优化了各组分的浓度配比，使本发明的去腐缓冲液能够达到理想的脱腐效果，为后续DNA的提取和纯化步骤提供了保证和支持；
(2)本发明在DNA的提取步骤中，首先研制了一种能有效提取微生物总DNA的DNA提取缓冲液；为了尽可能避免DNA在提取中的机械损伤，提取过程仅采用液氮与60～65℃之间冻融的方法以提高微生物细胞的裂解效率，从而保持了DNA较好的完整性；为了使蛋白酶K的作用更好地发挥，本发明还将DNA提取缓冲液与堆肥样品在37℃下振荡温浴45～60min，这 样既保证了其处于酶催化的最适温度，又可以与样品充分接触；在DNA提取步骤中加入的氯仿-异戊醇试剂能够抽提掉大部分细胞裂解产生的蛋白质和糖类物质；可见由于综合采用了生物、化学、物理相结合的方法，使堆肥中的微生物细胞在蛋白酶K、SDS和CTAB等物质作用下尽可能地裂解，充分释放其中的核酸物质，从而实现了DNA产量的最大。
本发明的方法针对堆肥的特定理化性质，使用了对不同对象有特定作用的处理方法，从而获得了片段长度比较单一的DNA经过纯化后，DNA的产量相比于现有技术，提高了40％以上；同时，腐殖质类物质的产量大大减少，几乎去除了堆肥中所有的腐殖酸类物质。因此，本发明的方法从堆肥中提取和纯化的DNA具有产量大、纯度高、质量好等明显优势，从而为全面、快速地分析堆肥中微生物的多样性及功能基因奠定了良好的基础。
附图说明
图1为本发明实施例中纯化后的堆肥微生物总DNA的琼脂糖凝胶电泳照片；其中M为DNA分子量标记λDNA/Hind III(Tiangen生物公司购买)，1、2、3分别代表三个平行堆肥样品，数字表示DNA的大小，单位是kb。
图2为本发明实施例中经PCR扩增得到的真菌18S rDNA产物的琼脂糖凝胶电泳照片；其中M为DNA分子量标记100bp DNA Ladder(Tiangen生物公司购买)，1、2、3分别代表三个平行堆肥样品，数字表示DNA的大小，单位是bp。
图3为本发明实施例中经PCR扩增得到的细菌16S rDNA产物的琼脂糖凝胶电泳照片；其中M为DNA分子量标记DNAMarderV(Tiangen生物公司购买)，1、2、3分别代表三个平行堆肥样品，数字表示DNA的大小，单位是bp。
图4为本发明实施例中经PCR扩增纯化DNA得到的放线菌16S rDNA产物的琼脂糖凝胶电泳照片；其中M为DNA分子量标记100bp DNALadder(Tiangen生物公司购买)，1、2、3分别代表三个平行堆肥样品，数字表示DNA的大小，单位是bp。
具体实施方式
实施例：
首先进行堆肥的取样。堆肥取自一个20L的实验规模的堆肥装置，堆肥材料主要包括稻草1.074kg、菜叶0.9kg、树叶0.216kg、麸皮0.24kg和土壤0.721kg，采样点为堆肥表面以下3cm，一共取三个样品(分别编号为1、2、3)，每个样品1g，取样时间是在堆肥处理18d，温度为38℃，pH值为8.32，含水率为58％，有机质含量为20.3％。其中，pH值用玻璃电极法测定，含水率在105℃下重复烘烤至恒重测定，有机质含量根据重铬酸钾法测定。
采用本发明的方法对上述堆肥样品进行堆肥微生物总DNA的提取和纯化，具体包括以下 步骤：
1、样品的脱腐
向每个堆肥样品(1g)中分别加入10ml的去腐缓冲液，然后置于60℃的水浴中保温5min，保温期间用玻璃棒将堆肥样品与去腐缓冲液轻轻搅匀，再以5000×g离心5min，去上清；重复两次本步骤的洗涤与离心过程，至离心后的上清颜色与去腐缓冲液的颜色无明显差异。
本步骤中用到的去腐缓冲液是由作为溶质的Tris-HCl、Na4P2O7、Na2EDTA、PVP、NaCl、Triton X-100与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为：
Tris-HCl 100mM
Na4P2O7 100mM
Na2EDTA 100mM
PVP 1.0％W/V
NaCl 120mM
Triton X-100 0.06％V/V。
2、DNA的粗提
将上述洗涤脱腐后的样品置入液氮中保持5min，然后以60～65℃的温度解冻20min；加入1m1DNA提取缓冲液，并在37℃恒温条件下以200rpm振荡45min(选用恒温振荡器振荡)；然后加入100μl的十二烷基硫酸钠溶液(W/V为10％)得混合液，65℃水浴1.5h，水浴时可每隔15min上下轻轻颠倒一次；水浴结束后再加入与所得混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂(氯仿与异戊醇的V/V为24∶1)，摇匀至乳状后以9000×g离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀1.5h，以13000×g速度离心10min；离心后的沉淀用1ml预冰冷的乙醇溶液(V/V为70％)进行洗涤，以10000×g速度离心3min(冷冻离心机)，然后溶于500μl的TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液。
本步骤中用到的DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、EDTA、Na3PO4、NaCl、CTAB、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为：
Tris缓冲液 0.1M
EDTA 0.1M
Na3PO4 0.1M
NaCl 1.5M
CTAB 1％W/V
蛋白酶K 0.2mg/ml。
3、DNA的纯化
用TIANquick Midi普通DNA产物纯化试剂盒(Tiangen，北京)对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.5μg/ml的核糖核酸酶A，37℃水浴中消化30min以除去RNA，得到纯化后的堆肥微生物总DNA。
对上述纯化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳监测。DNA片段大小的检测按照常规的琼脂糖凝胶电泳进行，所用的琼脂糖凝胶电泳的浓度为0.8％(W/V)，所用的DNA分子量标记(M)为北京天为时代科技有限公司的DNA/Hind III，所用的电泳缓冲液为1×TAE电泳缓冲液，以10V/cm的电压降在水平电泳槽上电泳，电泳结束后凝胶用SYBR Green I染色10min，然后在Gel Doc2000凝胶成像系统(BioRad公司)上拍照检测，结果如图1所示，从图中可以看出，纯化后的DNA条带单一，没有拖尾现象，DNA片段长度约为23kb。
进行琼脂糖凝胶电泳所用试剂如下：
1×TAE电泳缓冲液：40mM Tris碱，20mM乙酸，2mM EDTA；
0.8％(W/V)琼脂糖：0.8g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液加热溶解，然后冷却；
SYBR Green I染色液：SYBR Green I稀释10000倍。
对脱腐前后及纯化后DNA中的腐殖酸含量进行测定。腐殖酸的吸收波长为340nm，使用一系列浓度(0.1～100ng/μl)的腐殖酸混合物(Aldrich Chemical Milwaukee，WI，USA)作标准曲线，通过加入10ng/μl DNA(Molecμlar Probes，USA)和2μg/μl牛血清白蛋白(Amresco，USA)以检查DNA和蛋白质对腐殖酸浓度测定的影响，使用紫外下分光光度计在340nm波长处测定各个样品的吸光度。根据测量结果计算得出脱腐前和脱腐后堆肥样品中腐殖酸类物质的含量分别为36.2±0.7μg/g堆肥和6.5±0.4μg/g堆肥，即经过去腐缓冲液洗涤后，腐殖酸含量减少了81.2±0.3％，纯化后DNA中腐殖酸类物质的含量为0.8±0.2μg/g堆肥，几乎去除了堆肥中所有的腐殖酸类物质。
对纯化后DNA的浓度进行测定。DNA浓度使用Eppendorf公司的BioPhotometer核酸蛋白分析仪进行测定，实验步骤根据仪器操作手册进行，仪器根据测量结果自动给出所检测DNA溶液的浓度，根据稀释倍数计算得到原始DNA浓度，再根据DNA溶液浓度和体积计算得到纯化后的DNA产量为58±2.3μg/g堆肥，比现有技术提高了约41％。
用真菌的18S rDNA、细菌和放线菌的16S rDNA进行PCR扩增及产物检测，其具体步骤如下：
(1)选择真菌的18S rDNA扩增通用引物对EF4(5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3′)和fung5(5′-GTAAAAGTCCTGGTTCCCC-3′)作为PCR扩增引物，扩增出18S rDNA序列片段，长度约为600bp(见图2)；
50μl的PCR反应体系为：2μl纯化DNA，dNTP 200μM each，引物各0.4μM，10×Buffer(withMgCl2)5μl，Taq DNA聚合酶(Tiangen，北京)2.5U，加去离子水补足至50μl；扩增条件为94℃预变性2min；接下来是94℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min，终止于4℃。
(2)选择细菌的16S rDNA扩增通用引物341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)作为PCR扩增引物，扩增长度约为600bp(见图3)；
50μl的PCR反应体系为：4μl纯化DNA，dNTP 400μM each，引物0.1μM，10×Buffer(withMgCl2)5μl，Taq DNA聚合酶(Tiangen，北京)2.5U，加去离子水补足至50μl；扩增条件为94℃预变性5min；接下来是94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，终止于4℃。
(3)选择放线菌的16S rDNA扩增通用引物对F243(5′-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3′)和R513(5′-CCGCGGCTGCTGGCACGTA-3′)作为PCR扩增引物，扩增出16S rDNA序列片段，长度约为300bp(见图4)；
50μl的PCR反应体系为：4μl纯化DNA，dNTP 200μM each，引物0.8μM，10×Buffer(withMgCl2)5μl，Taq DNA聚合酶(Tiangen，北京)2.5 U，加去离子水补足至50μl；扩增条件为94℃预变性2min；接下来是94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，终止于4℃。
上述的PCR扩增产物都同样采用1％琼脂糖凝胶电泳，除所用的DNA分子标记M为从北京天根生化有限公司(Tiangen)购买的100bp DNA ladder Marker以外，其余方法和步骤与上述微生物总DNA的琼脂糖凝胶电泳过程相同。电泳检测结果分别如图2、图3和图4所示，从图中可以看出，使用细菌、真菌和放线菌的通用引物均能成功地从纯化的DNA中扩增出各自的目的条带，且扩增特异性强，长度分别为600bp、600bp、300bp左右。这充分说明本发明的方法可提取堆肥中高质量的DNA，以供研究者同时研究堆肥中三类微生物的种群结构和功能基因。
Claims (1)
1.一种堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法，包括以下步骤：
(1)样品的脱腐：向待提取DNA的堆肥样品中以8～15ml/g堆肥的用量添加去腐缓冲液，然后置于60～65℃的水浴中保温3～8min，再以3000～5000×g离心5～7min，去上清；重复本步骤直至离心后的上清颜色与所述去腐缓冲液的颜色无明显差异；
所述去腐缓冲液是由作为溶质的三羟甲基氨基甲烷盐酸、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、曲拉通X-100与溶剂水配制而成，各溶质组分在去腐缓冲液中的浓度分别为：
三羟甲基氨基甲烷盐酸 50～100mM
焦磷酸钠 100～150mM
乙二胺四乙酸二钠 50～100mM
聚乙烯吡咯烷酮 0.5～1.0％W/V
氯化钠 100～200mM
曲拉通X-100 0.02～0.06％V/V；
(2)DNA的提取：将上述脱腐后的样品置入液氮中保持3～5min，然后以60～65℃的温度解冻15～20min；以1.0～1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取缓冲液，并在37℃温度下以200～250rpm振荡45～60min；然后以100～150μl/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸钠溶液得混合液，65℃水浴1.0～1.5h；再加入与所述混合液等体积的氯仿-异戊醇试剂，摇匀后以8000～12000×g离心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相体积的异丙醇并沉淀1～2h，以10000～13000×g速度离心8～15min；离心后的沉淀以0.8～1.5ml/g堆肥的用量加入预冰冷的乙醇溶液进行洗涤，以10000～13000×g速度离心3～5min，然后以500～1000μl/g堆肥的用量将洗涤后的堆肥样品溶于TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；
所述DNA提取缓冲液是由作为溶质的Tris缓冲液、乙二胺四乙酸、磷酸钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化胺、蛋白酶K与溶剂水配制而成，各溶质组分在DNA提取缓冲液中的浓度分别为：
Tris缓冲液 0.1～0.15M
乙二胺四乙酸 0.1～0.15M
磷酸钠 0.1～0.12M
氯化钠 1～1.5M
十六烷基三甲基溴化胺 1～2％W/V
蛋白酶K 0.1～0.2mg/ml；
(3)DNA的纯化：用试剂盒对上述粗提的DNA溶液进行纯化，在纯化产物中加入终浓度为0.25～0.5μg/ml的核糖核酸酶A，37℃水浴中消化30～40min，得到纯化后的堆肥微生物总DNA。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20110209 Termination date: 20130514 |