CN103789300B - 一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，步骤如下：（1）取活性污泥，然后加入氯化钠溶液洗涤，制得初洗污泥；（2）向初洗污泥中加入提取缓冲液和溶菌酶溶液；然后加入十二烷基硫酸钠溶液，离心取上清液；（3）加入Tris-饱和酚溶液，再加入Tris-饱和酚溶液，离心取上清，制得提取液A；（4）加入混合溶液I，再加入混合溶液II，离心取上清，加入乙酸钠溶液，再加入预冷无水乙醇，离心取沉淀，制得粗提物；（5）加入乙醇溶液，离心，收集沉淀，再加入TE缓冲液和RNaseA溶液，即得。本发明提高了活性污泥宏基因组DNA样品的产量和质量。

Description

一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

环氧丙烷皂化废水是一种由氯醇法生产环氧丙烷过程产生的大量污水。根据相关报道，每生产1t环氧丙烷就产生50-80t废水。该废水具有pH值高、氯化钙含量高、COD高的特点，其中含有大量难以生化降解的氯化物，如氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等。这种高盐、富含有机物的废水可造成严重的环境污染，采用合理有效的方式处理这种废水不容忽视。

生物活性污泥法是当前环氧丙烷皂化废水处理的主要方式，但这种方法受到微生物活性及其耐盐度的限制，处理效果有待提高。采用有效的方法研究分析活性污泥微生物群落的主要的建群种，有针对性的进行驯化培养，可大大提高活性污泥菌种的活性及耐盐度，进而提高活性污泥处理废水的工作能力。

活性污泥中微生物群落结构复杂，而且绝大多数的微生物是不能被传统方法分离培养的，通过传统的富集、分离、培养很难对污泥微生物群落进行准确分析。宏基因组技术突破了传统微生物培养的局限性，是当前进行微生物群落分析最有效的方式之一，而获得高质量的宏基因组DNA，是准确分析微生物群落的必要条件。

中国专利文献CN101392248A（申请号200810064771.1）公开了一种厌氧活性污泥DNA的提取方法，按照以下步骤进行：一、污泥清洗;二、裂解细胞;三、DNA的纯化;即提取出厌氧活性污泥DNA。

中国专利文献CN102732504A（申请号201110096525.6）公开了一种由油/气藏复杂环境样品中直接提取微生物宏基因组的简易方法，包括以有机相/水相萃取获得油样/油水样中微生物组份，真空过滤水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等裂解细胞，在高盐条件下通过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除蛋白质以及多糖等有机大分子组份，随后通过核酸抽提及沉淀，获得无偏好的油/气藏微生物宏基因组成分。

但上述方法应用与环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取是，均出现DNA样品条带弥散，无法获得较高质量的宏基因组DNA样本的问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取0.5～2g活性污泥，离心，收集沉淀；然后加入5～20ml的质量浓度为0.9%的氯化钠溶液洗涤1～5min，离心，收集沉淀，重复3～5次，制得初洗污泥；

（2）向步骤（1）制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取缓冲液和20～80μL溶菌酶溶液，混合均匀，36～38℃水浴保温25～40min；然后加入200～800μL的质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，取上清液；

所述提取缓冲液含有浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、浓度为80～120mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、浓度为150～250mmol/L的NaCl、质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮和质量浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵，pH7.5～8.5；

（3）向步骤（2）的上清液中加入800～3300μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，再加入等体积500～2000μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，制得提取液A；

（4）向步骤（3）制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，混合均匀，离心，取上清，再加入等体积混合溶液II，混合均匀，离心，取上清，加入上清1/10～1/5体积的乙酸钠溶液，再加入上清2～3倍体积的预冷无水乙醇，冰上放置30～40min；低温离心，取沉淀，制得粗提物；

所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液；

所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液；

（5）向步骤（4）制得的粗提物中加入500～2000μL的体积百分比为70%的乙醇溶液，悬浮沉淀，离心，收集沉淀，重复1～3次；然后加入500～2000μL的无水乙醇，悬浮沉淀，离心，收集沉淀，室温干燥，再加入60～240μL的TE缓冲液和3～12μL的RNaseA溶液，制得宏基因组DNA。该宏基因组DNA需置于-20℃进行冷冻保存。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的离心，条件均为：8000～10000g离心1～1.5min。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中溶菌酶溶液浓度为10～15mg/ml。溶菌酶的作用是通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶为市售产品，本领域技术人员可以根据该溶菌酶的目的选择合适厂家生产的溶菌酶。

根据本发明优选的，所述步骤（2）、（3）和（4）中的离心，条件均为：8000～10000g离心10～15min。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的低温离心，条件为：-4～0℃，10000～12000g离心10～15min。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的乙酸钠溶液浓度为3mol/L，pH5.2。

根据本发明优选的，所述步骤（5）中的离心，条件均为：10000～12000g离心1～1.5min。

如无特殊说明，上述工艺条件均可采用本领域惯用条件，常用试剂如：Tris-饱和酚溶液、TE缓冲液、RNaseA溶液等如无特殊说明，均采用本领域常用试剂。

有益效果

本发明克服了现有宏基因组DNA提取方法无法提取环氧丙烷皂化废水活性污泥中宏基因组DNA的弊端，通过采用质量浓度为0.9%的氯化钠溶液—提取缓冲液—溶菌酶—十二烷基硫酸钠溶液对活性污泥样品进行预处理和微生物细胞壁破碎，将获得的高纯度、高含量的宏基因组DNA样品用酚、氯仿、异戊醇的混合溶液反复多次处理，并将上述处理后DNA样品进行无水乙醇/乙酸钠沉淀提取获得宏基因组DNA。本发明所述方法大大提高了活性污泥宏基因组DNA样品的产量和质量，获得丰富度较高的环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品，并且操作简单、可行性强，成本低，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；

其中：泳道M1、泳道M2为DNA Ladder；泳道1～2为实施例1提取的宏基因组DNA，泳道3为实施例2提取的宏基因组DNA，泳道4～6为对比例1提取的宏基因组DNA；

图2为环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；

其中：泳道M1、泳道M2为DNA Ladder；泳道3为实施例1提取的宏基因组DNA，泳道4为实施例2提取的宏基因组DNA，泳道1～2为对比例2提取的宏基因组DNA。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

实施例中所述的环氧丙烷皂化废水活性污泥取自滨化集团股份有限公司环氧丙烷皂化废水处理过程中的活性污泥。

溶菌酶购自Amresco公司，浓度10mg/ml。

RNaseA溶液购自天根生化科技（北京）有限公司。

Tris-饱和酚溶液购自Amresco公司。

TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA（乙二胺四乙酸），pH=8.0

实施例1

一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取方法，步骤如下：

（1）在离心管里加湿质量为0.5g活性污泥，于10000g离心1min，收集沉淀；然后加入0.9%的氯化钠溶液5ml洗涤1min，10000g离心1min，重复洗涤、离心步骤三次，收集沉淀，制得初洗污泥；

（2）向步骤（1）制得的初洗污泥中加入600μL提取缓冲液和20μL浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液，涡旋至混匀；37℃水浴保温30min；然后加入200μL的质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，涡旋至混匀；10000g离心10min，取上清液转移至另一离心管；

所述提取缓冲液含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、100mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、200mmol/L的NaCl、质量浓度1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和质量浓度2%的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），pH8.0。

（3）向步骤（2）的800μLTris-饱和酚溶液，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管，向获得的上清液中再加入500μLTris-饱和酚溶液，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管，制得提取液A；

（4）向步骤（3）制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管；再加入等体积混合溶液II，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管；加入上清液1/10体积的乙酸钠溶液，乙酸钠溶液浓度为3mol/L,乙酸钠溶液pH5.2，再加入两倍上清液体积的预冷无水乙醇，然后于冰上放置30min；在0℃，12000g离心10min，收集沉淀，制得粗提物；

所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液；

所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液；

（5）向步骤（4）制得的粗提物中加入500μL的体积百分比为70%的乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；12000g离心1min，收集沉淀；向获得的沉淀中加入500μL体积百分比为70%乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；12000g离心1min，收集沉淀；然后再加入500μL无水乙醇洗涤沉淀1次；上下颠倒振荡悬浮沉淀，12000g离心1min，收集沉淀，室温干燥，再加入60μL的TE缓冲液和3μL的RNaseA溶液，制得宏基因组DNA，置于-20℃冷冻保存。

实施例2

一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取方法，步骤如下：

（1）在离心管里加湿质量为2g活性污泥，于8000g离心1.5min，收集沉淀；然后加入0.9%的氯化钠溶液20ml洗涤5min，8000g离心1.5min，重复洗涤、离心步骤5次，收集沉淀，制得初洗污泥；

（2）向步骤（1）制得的初洗污泥中加入2400μL提取缓冲液和80μL浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液，涡旋至混匀；38℃水浴保温40min；然后加入800μL的质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，涡旋至混匀；8000g离心15min，取上清液转移至另一离心管；

所述提取缓冲液含有120mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、120mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、250mmol/L的NaCl、质量浓度1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和质量浓度2%的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），pH8.5。

（3）向步骤（2）的上清液中加入3300μLTris-饱和酚溶液，振荡混匀，8000g离心15min，将上清液转移至另一离心管，向获得的上清液中再加入2000μLTris-饱和酚溶液，振荡混匀，8000g离心15min，将上清液转移至另一离心管，制得提取液A；

（4）向步骤（3）制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，振荡混匀，8000g离心15min，将上清液转移至另一离心管；再加入等体积混合溶液II，振荡混匀，8000g离心15min，将上清液转移至另一离心管；加入上清液1/5体积的乙酸钠溶液，乙酸钠溶液浓度为3mol/L,乙酸钠溶液pH5.2，再加入两倍上清液体积的预冷无水乙醇，然后于冰上放置30min；在-4℃，1000g离心15min，收集沉淀，制得粗提物；

所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液；

所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液；

（5）向步骤（4）制得的粗提物中加入2000μL的体积百分比为70%的乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；10000g离心1.5min，收集沉淀；向获得的沉淀中加入2000μL体积百分比为70%乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；12000g离心1min，收集沉淀；然后再加入500μL无水乙醇洗涤沉淀1次；上下颠倒振荡悬浮沉淀，10000g离心1.5min，收集沉淀，室温干燥，再加入240μL的TE缓冲液和12μL的RNaseA溶液，制得宏基因组DNA，置于-20℃冷冻保存。

对比例1

采用中国专利文献CN101392248A（申请号200810064771.1）说明书中实施例1所述的方法提取宏基因组DNA。

对比例2

一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取方法，步骤如下：

（1）在离心管里加湿质量为0.5g活性污泥，于10000g离心1min，收集沉淀,制得污泥；

（2）向步骤（1）制得的污泥中加入600μL提取缓冲液和20μL浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液，涡旋至混匀；37℃水浴保温30min；然后加入200μL的质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，涡旋至混匀；10000g离心10min，取上清液转移至另一离心管；

所述提取缓冲液含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、100mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、200mmol/L的NaCl、质量浓度1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和质量浓度2%的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），pH8.0。

（3）向步骤（2）的上清液中加入800μLTris-饱和酚溶液，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管，向获得的上清液中再加入500μL Tris-饱和酚溶液，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管，制得提取液A；

（4）向步骤（3）制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管；再加入等体积混合溶液II，振荡混匀，10000g离心10min，将上清液转移至另一离心管；加入上清液1/10体积的乙酸钠溶液，乙酸钠溶液浓度为3mol/L,乙酸钠溶液pH5.2，再加入两倍上清液体积的预冷无水乙醇，然后于冰上放置30min；12000g离心10min，收集沉淀，制得粗提物；

所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液；

所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液；

（5）向步骤（4）制得的粗提物中加入500μL的体积百分比为70%的乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；12000g离心1min，收集沉淀；向获得的沉淀中加入500μL体积百分比为70%乙醇溶液，上下颠倒振荡悬浮沉淀；12000g离心1min，收集沉淀；然后再加入500μL无水乙醇洗涤沉淀1次；上下颠倒振荡悬浮沉淀，12000g离心1min，收集沉淀，室温干燥，再加入60μL的TE缓冲液和3μL的RNaseA溶液，制得宏基因组DNA，置于-20℃冷冻保存。

试验例

分别取通过实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的方法提取的宏基因组DNA溶液5μL点样于含1μg/mL溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE，电压为100V，电泳时间为40min，凝胶成像系统观察并记录相应结果，如图1和图2所示。

由图1中可以看出，实施例1、实施例2提取的宏基因组DNA（泳道1～3）具有明显的亮带，而对比例1所述方法提取的宏基因组DNA没有明显亮带，因此采用本发明所述方法提取的环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品的产量较高、质量较好，丰富度较高。

由图2可以看出，实施例1、实施例2提取的宏基因组DNA（泳道3～4）具有明显的亮带，而对比例2所述方法提取的宏基因组DNA样品条带弥散，亮带没有实施例1的亮带明显，因此采用本发明所述方法提取的环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品的产量较高、质量较好，丰富度较高。

结果分析

通过上述结果，经分析发现影响环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA提取的主要因素可能为高浓度的氯化钙，因此通过利用生理盐水稀释、缓冲液中添加具有络合作用能力的EDTA试剂，络合活性污泥中存在的钙离子，使溶菌酶能够在较为温和的条件下有效地作用于活性污泥中的微生物菌体，从而获得质量较好的宏基因组DNA样品，同时消除相关干扰因素的作用。

Claims (7)

1.一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取0.5～2g活性污泥，离心，收集沉淀；然后加入5～20ml的质量浓度为0.9%的氯化钠溶液洗涤1～5min，离心，收集沉淀，重复3～5次，制得初洗污泥；

（2）向步骤（1）制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取缓冲液和20～80μL溶菌酶溶液，混合均匀，36～38℃水浴保温25～40min；然后加入200～800μL的质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，取上清液；

所述提取缓冲液含有浓度为80～120mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、浓度为80～120mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、浓度为150～250mmol/L的NaCl、质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮和质量浓度为2%的十六烷基三甲基溴化铵，pH7.5～8.5；

（3）向步骤（2）的上清液中加入800～3300μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，再加入等体积500～2000μL Tris-饱和酚溶液，混合均匀，离心，取上清，制得提取液A；

（4）向步骤（3）制得的提取液A中加入等体积混合溶液I，混合均匀，离心，取上清，再加入等体积混合溶液II，混合均匀，离心，取上清，加入上清1/10～1/5体积的乙酸钠溶液，再加入上清2～3倍体积的预冷无水乙醇，冰上放置30～40min；低温离心，取沉淀，制得粗提物；

所述混合溶液I是酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1的比例混合的混合溶液；

所述混合溶液II是氯仿、异戊醇按体积比25:1的比例混合的混合溶液；

（5）向步骤（4）制得的粗提物中加入500～2000μL的体积百分比为70%的乙醇溶液，悬浮沉淀，离心，收集沉淀，重复1～3次；然后加入500～2000μL的无水乙醇，悬浮沉淀，离心，收集沉淀，室温干燥，再加入60～240μL的TE缓冲液和3～12μL的RNaseA溶液，制得宏基因组DNA。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中的离心，条件均为：8000～10000g离心1～1.5min。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中溶菌酶溶液浓度为10～15mg/ml。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（2）、（3）和（4）中的离心，条件均为：8000～10000g离心10～15min。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中的低温离心，条件为：-4～0℃，10000～12000g离心10～15min。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中的乙酸钠溶液浓度为3mol/L，pH5.2。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中的离心，条件均为：10000～12000g离心1～1.5min。