CN104560953A - 快速提取淤泥微生物基因组dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒及提取方法，通过淤泥微生物细胞的破碎、杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱四个步骤提取淤泥微生物基因组DNA。常规的淤泥微生物基因组DNA通常采用无水乙醇沉淀基因组的方法，操作时间需要12h以上，且容易造成基因组DNA降解。而本发明试剂盒主要利用硅胶模吸附柱吸附基因组DNA，再采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去蛋白等杂质，利用所述试剂盒仅需不到4h的时间便可完成淤泥微生物基因组DNA的提取，更加方便、快捷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
污泥中的微生物的代谢活动，将水中的有机物氧化分解为无机物，从而实现净化。污泥中的微生物主要由细菌所组成，其数量可占污泥中微生物总重量的90～95％左右，细菌在有机污染物的净化中起重要作用。污泥中的微生物主要担当分解者的作用，能将有机分解成无机物，还原到自然界，为植物生存提供无机养料。
传统的分离培养微生物的方法是淤泥微生物多样性研究最早运用的方法。但是，能够在培养基上生长的细菌仅占不到环境微生物总量的l％。近10年来日益成熟的分子生物学技术突破了传统技术手段的局限，给淤泥微生物研究带来了新的希望。建立高效可靠的淤泥微生物总DNA提取方法，是进行微生物分子生态学研究的基础。
近年来，随着分子生物学的发展，基于宏基因组DNA技术的分子生物学研究手段越来越多地被引入到微生物学研究中。用分子生物学的方法分析淤泥微生物的关键是DNA的提取，但对于淤泥中微生物DNA的提取方法至今尚未有过多报导。因此，研究一种快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒及提取方法，所述试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得淤泥微生物基因组DNA。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.1-0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.1-0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.1-0.5mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度1-2mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度1-2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝7.0-9.0；
工作液B：质量浓度10-30％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液C：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液D：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度70-80％乙醇；
去蛋白液：由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度10-30mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝6.0-7.0，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30-40％；
漂洗液：由终浓度20-50mmol/L NaCl和终浓度2-5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.0-8.0,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80-90％；
洗脱液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0-9.0。
所述DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如工作液A：由终浓度0.1-0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.1-0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.1-0.5mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度1-2mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度1-2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝7.0-9.0，是指Tris在工作液A中的浓度为0.1-0.5mol/L mol/L，EDTA在工作液A中的浓度为0.1-0.5mol/L，工作液A的pH＝7.0-9.0。
进一步，所述去蛋白液由终浓度5mol/L盐酸胍和终浓度20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝6.6，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为38％。
进一步，所述漂洗液由终浓度20mmol/L NaCl和终浓度2mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.5,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为85％。
所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)淤泥微生物细胞的破碎：称取1-2g淤泥样品于10ml离心管中，每1-2g淤泥加入3-5ml工作液A，震荡5-10min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为3-5mg/ml(此处终浓度是指溶菌酶在工作液A与溶菌酶混合液中的浓度)，震荡5-10min后，于37℃，200-300r/min摇床震荡1-2h，然后加入600-800μl工作液B，震荡5-10min混匀后，于60-70℃水浴1-2h，水浴期间每10-20min震荡混匀1-2min；
2)杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入4-5ml工作液C，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液D，12000-13000rpm/min离心10-20min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后加入500-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后加入300-500μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，再次加入500-600μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；
4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30-60μl洗脱液，12000-13000rpm/min离心1-2min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。后续取3-6μl DNA水溶液，于1-2％琼脂糖凝胶中电泳检测。
进一步，所述的步骤4)加入漂洗液，离心，弃废液之后，再次将DNA吸附柱12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干，再次离心的目的主要是为了彻底的将液体从吸附柱中离心出来。
本发明采用以上技术方案，通过淤泥微生物细胞的破碎、杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱四个步骤提取淤泥微生物基因组DNA。常规的淤泥微生物基因组DNA通常采用无水乙醇沉淀基因组的方法，操作时间需要12h以上，且容易造成基因组DNA降解。而本发明试剂盒主要利用硅胶模吸附柱吸附柱吸附基因组DNA，再采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去蛋白等杂质，利用所述试剂盒仅需不到4h的时间便可完成淤泥微生物基因组DNA的提取，更加方便、快捷。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒提取的淤泥微生物基因组DNA的电泳检测图：
泳道1，2是利用本发明试剂盒提取到的淤泥微生物基因组DNA；
泳道3为TAKARA公司的DL4500marker。
具体实施方式
快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.1-0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.1-0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.1-0.5mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度1-2mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度1-2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝7.0-9.0；
工作液B：质量浓度10-30％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液C：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液D：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度70-80％乙醇；
去蛋白液：由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度10-30mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝6.0-7.0，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30-40％；
漂洗液：由终浓度20-50mmol/L NaCl和终浓度2-5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.0-8.0,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80-90％；
洗脱液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0-9.0。
所述DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)淤泥微生物细胞的破碎：称取1-2g淤泥样品于10ml离心管中，每1-2g淤泥加入3-5ml工作液A，震荡5-10min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为3-5mg/ml(此处终浓度是指溶菌酶在工作液A与溶菌酶混合液中的浓度)，震荡5-10min后，于37℃，200-300r/min摇床震荡1-2h，然后加入600-800μl工作液B，震荡5-10min混匀后，于60-70℃水浴1-2h，水浴期间每10-20min震荡混匀1-2min；
2)杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入4-5ml工作液C，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min离心10-20min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液D，12000-13000rpm/min离心10-20min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后加入500-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后加入300-500μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，再次加入500-600μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，再次12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干；
4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30-60μl洗脱液，12000-13000rpm/min离心1-2min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。后续取3-6μl DNA水溶液，于1-2％琼脂糖凝胶中电泳检测。
实施例1
快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.1mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.1mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度1.5mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度1％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝8.0；
工作液B：质量浓度20％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液C：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液D：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度70％乙醇；
去蛋白液：由终浓度5mol/L盐酸胍和终浓度20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝6.6，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为38％；
漂洗液：由终浓度20mmol/L NaCl和终浓度2mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.5,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为85％；
洗脱液：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.5。
实施例2
快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.3mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.3mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.13mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度1mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度1.5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝7.0；
工作液B：质量浓度10％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液C：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液D：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度75％乙醇；
去蛋白液：由终浓度3mol/L盐酸胍和终浓度10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.0，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30％；
漂洗液：由终浓度35mmol/L NaCl和终浓度3mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝7.0,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80％；
洗脱液：15mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝9.0。
实施例3
快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液A：由终浓度0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度0.5mol/L磷酸钠(Na3PO4)，终浓度2mol/L氯化钠(NaCl)和终浓度2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)组成，pH＝9.0；
工作液B：质量浓度30％的十二烷基硫酸钠(SDS)；
工作液C：体积比为酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；
工作液D：体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度80％乙醇；
去蛋白液：由终浓度6mol/L盐酸胍和终浓度30mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝6.0，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为40％；
漂洗液：由终浓度50mmol/L NaCl和终浓度5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)组成，pH＝8.0,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为90％；
洗脱液：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0。
实施例4
利用实施例1的试剂盒，提取淤泥微生物基因组DNA，具体包括以下步骤：
1)淤泥微生物细胞的破碎：称取两管1.5g淤泥样品于10ml离心管中，加入4ml工作液A，震荡5min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为3mg/ml(此处终浓度是指溶菌酶在工作液A与溶菌酶混合液中的浓度)，震荡5min后，于37℃，225r/min摇床震荡1h，然后加入600μl工作液B，震荡5min混匀后，于65℃水浴2h，水浴期间每10min震荡混匀1min；
2)杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入4ml工作液C，振荡器震荡60s后，13000rpm/min离心10min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液D，13000rpm/min离心10min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，13000rpm/min离心1min，弃废液，然后加入500μl去蛋白液，13000rpm/min离心1min，弃废液，然后加入500μl漂洗液，13000rpm/min离心1min，弃废液，再次加入500μl漂洗液，13000rpm/min离心1min，弃废液，再次13000rpm/min离心1min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干；
4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入50μl洗脱液，13000rpm/min离心1min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。后续取3-6μl DNA水溶液，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
实施例5
本发明的提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，其提取方法包括以下步骤：
1)淤泥微生物细胞的破碎：称取1g淤泥样品于10ml离心管中，加入3ml工作液A，震荡10min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为5mg/ml(此处终浓度是指溶菌酶在工作液A与溶菌酶混合液中的浓度)，震荡10min后，于37℃，200r/min摇床震荡2h，然后加入700μl工作液B，震荡10min混匀后，于60℃水浴1h，水浴期间每20min震荡混匀2min；
2)杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入5ml工作液C，振荡器震荡30s后，12000rpm/min离心20min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液D，12000rpm/min离心20min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，10000rpm/min离心2min，弃废液，然后加入600μl去蛋白液，10000rpm/min离心2min，弃废液，然后加入300μl漂洗液，12000rpm/min离心2min，弃废液，再次加入600μl漂洗液，12000rpm/min离心2min，弃废液，再次12000rpm/min离心2min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干；
4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30μl洗脱液，12000rpm/min离心2min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。后续取3-6μl DNA水溶液，于1-％琼脂糖凝胶中电泳检测。
实施例6
本发明的提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，其提取方法包括以下步骤：
1)淤泥微生物细胞的破碎：称取2g淤泥样品于10ml离心管中，加入5ml工作液A，震荡10min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为5mg/ml(此处终浓度是指溶菌酶在工作液A与溶菌酶混合液中的浓度)，震荡10min后，于37℃，300r/min摇床震荡2h，然后加入800μl工作液B，震荡10min混匀后，于70℃水浴1h，水浴期间每15min震荡混匀1min；
2)杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入5ml工作液C，振荡器震荡30s后，12000rpm/min离心20min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液D，12000rpm/min离心20min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，13000rpm/min离心1min，弃废液，然后加入600μl去蛋白液，13000rpm/min离心1min，弃废液，然后加入300μl漂洗液，13000rpm/min离心1min，弃废液，再次加入600μl漂洗液，13000rpm/min离心1min，弃废液，再次13000rpm/min离心1min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干；
4)DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入60μl洗脱液，12000rpm/min离心2min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。后续取3-6μl DNA水溶液，于2％琼脂糖凝胶中电泳检测。
利用实施例1的试剂盒，按照实施例4的提取方法提取的淤泥微生物基因组DNA于1％琼脂糖凝胶中的电泳检测结果见图1，其中泳道1，2均是利用本发明试剂盒提取到的淤泥微生物基因组DNA,泳道3为TAKARA公司的DL4500marker。从图中可以看出本方法可以较为快速地提取到淤泥微生物基因组DNA。
提取到的淤泥微生物基因组DNA，其纯度用OD260nm/OD280nm比值来衡量，纯度见表1。
表1淤泥微生物基因组DNA的纯度
| 泳道1 | 泳道2 | |
| OD比值(260:280) | 1.79 | 1.81 |
从表1可以看出，淤泥微生物基因组DNA的OD(260:280)范围在1.79-1.81。从中可看出，利用本发明试剂盒可以快速地提取到纯度高的淤泥微生物基因组DNA。
Claims (5)
1. 快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由DNA吸附柱及以下工作液组成：
工作液 A：由终浓度0.1-0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度0.1-0.5mol/L乙二胺四乙酸，终浓度0.1-0.5 mol/L磷酸钠，终浓度1-2 mol/L氯化钠和终浓度1-2%十六烷基三甲基溴化铵组成，pH=7.0-9.0；
工作液 B：质量浓度10-30%的十二烷基硫酸钠；
工作液 C：体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的混合液；
工作液 D：体积比为氯仿:异戊醇=24:1的混合液；
沉淀剂：质量浓度70-80%乙醇；
去蛋白液：由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度10-30 mmol/L三羟甲基氨基甲烷组成，pH=6.0-7.0，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30-40％；
漂洗液：由终浓度20-50mmol/L NaCl和终浓度2-5mmol/L三羟甲基氨基甲烷组成，pH=7.0-8.0, 调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80-90%；
洗脱液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH= 8.0-9.0。
2. 根据权利要求1所述的快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述去蛋白液由终浓度5mol/L盐酸胍和终浓度20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷组成，pH=6.6，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为38％。
3. 根据权利要求1所述的快速提取淤泥微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液由终浓度20mmol/L NaCl和终浓度2mmol/L三羟甲基氨基甲烷组成，pH=7.5, 调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为85%。
4.如权利要求1至3之一所述试剂盒的提取方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）淤泥微生物细胞的破碎：称取淤泥于离心管中，每1-2g淤泥加入3-5ml 工作液A，震荡5-10min，加入溶菌酶至溶菌酶终浓度为3-5mg/ml，震荡5-10min后，于37°C，200-300 r/min 摇床震荡1-2h，然后加入600-800 μl 工作液 B，震荡5-10min后，于60-70°C水浴1-2h，水浴期间每10-20min震荡1-2min；
2）杂蛋白的抽除：往上述溶液中加入4-5ml 工作液 C，振荡器震荡30-60s后，12000-13000rpm/min 离心10-20min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入与一次上清液等体积的工作液 D，12000-13000rpm/min 离心10-20min，取二次上清液至无菌的离心管中；
3）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往含有二次上清液的离心管中加入二次上清液两倍体积的沉淀剂，混合均匀后，加入DNA吸附柱中，10000-13000rpm/min 离心1-2min，弃废液，然后加入500-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，然后加入300-500μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，再次加入500-600μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；
4）DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30-60μl洗脱液，12000-13000rpm/min 离心1-2min，所得液体为淤泥微生物基因组DNA。
5.根据权利要求4所述试剂盒的提取方法，其特征在于：所述的步骤4）加入漂洗液，离心，弃废液之后，再次将DNA吸附柱12000-13000rpm/min 离心1-2min，弃废液，然后将DNA吸附柱静置吹干。
Priority Applications (1)
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2014
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