CN103205417A - 一种快速提取高纯度质粒dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，属于核酸纯化技术领域。首先向大肠杆菌沉淀物中加入悬浮液，涡旋振荡至沉淀完全溶解，然后加入碱裂解液，混匀后加入快速沉淀缓冲液，再混匀后进行离心分离1分钟，取上清转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，加入漂洗液进行脱盐离心，加入无核糖核酸酶的水洗脱离心，得到质粒核糖核酸溶液。本发明方法具有高效、快速、简洁的特点，纯化的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，属于核酸纯化技术领域。
背景技术
质粒DNA的提取和纯化是分子生物学的基本步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组等领域。从原核生物中提取和纯化质粒DNA的经典步骤为：菌体裂解、质粒分离和纯化。目前菌体裂解最常用的方法有：一步法质粒提取法和碱裂解法。一步法质粒提取法是由德国Eppendorf公司发明。它是一种基于溶菌酶裂解细菌的提取方法。该方法使用含有溶菌酶和去污剂的裂解液裂解细胞，裂解产物澄清无粘性，裂解后无需离心可直接与过滤膜进行结合，然后通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒DNA。该提取方法虽然方便，快捷和重复性好，但不适合于低拷贝质粒的提取和丰富培养基培养大肠杆菌质粒的提取。碱裂解法质粒DNA纯化技术是1979年由Birnboim&Doly发明。该方法仍是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三种溶液处理，一般需要20分钟左右的时间才能完成质粒的提取。该提取方法适用面较广，重复性好，但实验周期相对较长，影响了研究者的实验进程。
发明内容
本发明的目的是提出一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，基于已有的碱裂解法，采用一种新的快速沉淀缓冲液，并对整个质粒提取流程进行优化，以使整个质粒提取过程大大缩短。
本发明提出的快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下各步骤：
（1）对1～3毫升培养12～16小时的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1分钟，取出离心分离的沉淀物；
（2）向步骤（1）的沉淀物中加入75微升悬浮液，悬浮液的成分为：50毫摩尔葡萄糖、25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10毫摩尔乙二胺四乙酸，涡旋振荡至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
（3）向上述第一溶液中加入75微升碱裂解液，碱裂解液的成分为：200毫摩尔氢氧化钠和重量体积比为1%的十二烷基硫酸钠，上下翻转6～8次，使步骤（2）中所得到的菌体充分裂解，得到第二溶液；
（4）向第二溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，上下翻转6～8次，充分混匀，对混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟；
所述的快速沉淀缓冲液中各组分的质量为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，并使混合液体积为100毫升；
（5）将步骤（4）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，吸附离心的转速为13000转/分钟，吸附离心时间为30秒，倒去废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及体积百分比为75%的无水乙醇，漂洗液的pH值为7.5，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液；
（7）在步骤（6）的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脱缓冲液，洗脱缓冲液为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，洗脱缓冲液的pH值为8，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到高纯度质粒DNA。
本发明提出的快速提取质粒DNA的方法，其优点是：
1、本发明提出的快速提取质粒DNA的方法，使用了一种新的快速沉淀缓冲液，并对整个质粒提取流程进行优化，快速沉淀缓冲液一方面中和氢氧化钠；另一方面提高体系中的盐浓度，使蛋白质、基因组DNA和RNA发生盐析沉淀。加入快速沉淀缓冲液后，大部分蛋白质、基因组DNA和RNA都以不溶物状态存在，离心1分钟后即可将所有不溶物沉淀到管底，上清即可进行下一步操作。因此使质粒总核糖核酸的提取过程具有高效、快速、简洁的特点，可以直接从大肠杆菌培养液中分离纯化总核糖核酸，例如本发明方法的实施例1和实施例2中从1～3毫升大肠杆菌培养液中提取总核糖核酸，由传统的20分钟缩短到6分钟左右。
2、使用本发明方法提取质粒核糖核酸，具有高效、快速、简洁的特点，纯化的质粒核糖核酸可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。
3、本发明的提取质粒DNA方法，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。
附图说明
图1是本发明方法的实施例1，从1.5毫升大肠杆菌培养液中提取高拷贝质粒pBS的电泳检测图。
其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerⅣ）。泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
图2是本发明方法的实施例2，从1.5毫升大肠杆菌培养液中提取低拷贝质粒pBR322的电泳检测图。
其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerⅣ）。泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
具体实施方式
本发明提出的快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下各步骤：
（1）对1～3毫升培养12～16小时的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1分钟，取出离心分离的沉淀物；
（2）向步骤（1）的沉淀物中加入75微升悬浮液，悬浮液的成分为：50毫摩尔葡萄糖、25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10毫摩尔乙二胺四乙酸，涡旋振荡至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
（3）向上述第一溶液中加入75微升碱裂解液，碱裂解液的成分为：200毫摩尔氢氧化钠和重量体积比为1%的十二烷基硫酸钠，上下翻转6～8次，使步骤（2）中所得到的菌体充分裂解，得到第二溶液；
（4）向第二溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，上下翻转6～8次，充分混匀，对混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟，
所述的快速沉淀缓冲液中各组分的质量为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，并使混合液体积为100毫升；
（5）将步骤（4）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，吸附离心的转速为13000转/分钟，吸附离心时间为30秒，倒去废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及体积百分比为75%的无水乙醇，漂洗液的pH值为7.5，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液；
（7）在步骤（6）的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脱缓冲液，洗脱缓冲液为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，洗脱缓冲液的pH值为8，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到高纯度质粒DNA。
以下介绍本发明方法的实施例：
实施例1：从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pBS。
（1）对2毫升培养15小时的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1min，取出离心分离的沉淀物；
（2）向上述沉淀物中加入75微升悬浮液，悬浮液的组成为：50毫摩尔葡萄糖，25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，以及10毫摩尔乙二胺四乙酸；涡旋振荡至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
（3）向上述第一溶液中加入75微升碱裂解液，碱裂解液的组成为：200毫摩尔氢氧化钠和重量/体积为1%的十二烷基硫酸钠，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，得到第二溶液；
（4）向上述第二溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀。然后对该混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟。其中的快速沉淀缓冲液，其制备方法是：将异硫氰酸胍4克、盐酸胍10克、乙酸钾4g、月桂酰基肌氨酸钠0.2克和乙酸3毫升混合，加去离子水，得到混合液，并使混合液体积为100毫升。
（5）将步骤（4）中上清液转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为13000转/分钟，离心吸附时间为30秒，倒去废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及体积百分比为75%的无水乙醇，漂洗液的pH值为7.5，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液。
（7）在步骤（6）的硅膜吸附柱中加入60微升洗脱缓冲液，洗脱缓冲液为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，洗脱缓冲液的pH值为8，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到高纯度质粒DNA。
图1所示是实施例1中从1.5毫升大肠杆菌培养液中提取高拷贝质粒pBS的电泳检测图，图中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerⅣ），泳道2：使用本发明方法纯化的质粒DNA。
实施例2：从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒pBR322。
（1）对3毫升培养13小时的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1min，取出离心分离的沉淀物；
（2）向上述沉淀物中加入75微升悬浮液，悬浮液的组成为：50毫摩尔葡萄糖，25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及10毫摩尔乙二胺四乙酸，涡旋振荡至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
（3）向上述第一溶液中加入75微升碱裂解液，裂解液的组成为：200毫摩尔氢氧化钠和重量/体积为1%的十二烷基硫酸钠，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，得到第二溶液；
（4）向上述第二溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀。然后对该混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟。其中的快速沉淀缓冲液，其制备方法是：将异硫氰酸胍4克、盐酸胍10克、乙酸钾4g、月桂酰基肌氨酸钠0.2克和乙酸3毫升混合，加去离子水，得到混合液，并使混合液体积为100毫升。
（5）将步骤（4）中上清液转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为13000转/分钟，离心吸附时间为30秒，倒去废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及体积百分比为75%的无水乙醇，漂洗液的pH值为7.5，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液。
（7）在步骤（6）的硅膜吸附柱中加入80微升洗脱缓冲液，洗脱缓冲液为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，洗脱缓冲液的pH值为8，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到高纯度质粒DNA。
图2所示是实施例1中从1.5毫升大肠杆菌培养液中提取低拷贝质粒pBR322的电泳检测图，图中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerⅣ），泳道2：使用本发明方法纯化的质粒DNA。
Claims (1)
1.一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤：
（1）对1～3毫升培养12～16小时的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1分钟，取出离心分离的沉淀物；
（2）向步骤（1）的沉淀物中加入75微升悬浮液，悬浮液的成分为：50毫摩尔葡萄糖、25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10毫摩尔乙二胺四乙酸，涡旋振荡至沉淀完全溶解，得到第一溶液；
（3）向上述第一溶液中加入75微升碱裂解液，碱裂解液的成分为：200毫摩尔氢氧化钠和重量体积比为1%的十二烷基硫酸钠，上下翻转6～8次，使步骤（2）中所得到的菌体充分裂解，得到第二溶液；
（4）向第二溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，上下翻转6～8次，充分混匀，对混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟，
其中的快速沉淀缓冲液中各组分的质量为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，并使混合液体积为100毫升；
（5）将步骤（4）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，吸附离心的转速为13000转/分钟，吸附离心时间为30秒，倒去废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液，漂洗液的成分为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐以及体积百分比为75%的无水乙醇，漂洗液的pH值为7.5，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液；
（7）在步骤（6）的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脱缓冲液，洗脱缓冲液为10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，洗脱缓冲液的pH值为8，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到高纯度质粒DNA。
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