CN105420226A - 一种基于磁珠法的动物组织dna提取试剂盒及其应用 - Google Patents

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孟庆海
黄远福
王炜
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Nanjing Institute of Advanced Laser Technology
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Abstract

本发明公开了一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒及其应用，该试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ和核酸洗脱液，所述裂解液中含有SDS，三种洗涤液中均含有异丙醇；本发明将磁珠法与传统的动物DNA提取中的裂解液相结合，利用蛋白酶K和SDS消化破碎细胞，再利用磁珠法的原理对裂解出的核酸进行纯化，该试剂盒适用于实验室各种规模的动物组织核酸提取，也适用于商业批量生产，具有操作简单快速、使用安全、提取效率高、制造成本低等特点；使用该试剂盒的提取过程既可手工完成，也可在全自动核酸提取仪中自动完成，自动提取时使用96孔反应板可一次性处理1-16个动物组织样本，提取过程中无需其它操作。

Description

一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，可应用于多个物种动物组织DNA提取，也可应用于同个物种不同组织的DNA提取。本发明还涉及应用该试剂盒从动物组织样本中提取DNA的方法。
背景技术
真核生物基因组DNA广泛应用在动植物的遗传育种、基因图谱的构建、品种鉴定、物种形成和系统演化等方面的研究中。无论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子都是这些技术应用所涉及的主要对象，所以DNA的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技术。
目前对于动物全基因组DNA的提取已有很多的研究和报道，但是选取何种方法能够更有效地提取更高质量的基因组DNA，还是一个值得解决的问题。动物DNA的提取通常采用经典提取方法，即酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法，后来许多方法的改进都是在这三种方法的基础上进行的。这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（SDS）消化破碎细胞。采用上述经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种实验的要求，但操作繁琐且用时长，还需要用到多种仪器设备。
相比传统的DNA提取方法，以磁珠为载体的新型分离技术，无需大量检材，也无需接触酚/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操作，基于磁珠法的核酸提取具备传统DNA提取无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向。鉴于DNA提取的技术现状与发展前景，需要研发多种基于磁珠法的新型DNA提取试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有DNA提取技术的不足，提供了一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒及其应用，该技术方案将磁珠法与传统的动物DNA提取中的裂解液相结合，具有操作简单快速、使用安全、提取效率高、实现成本低的特点。为了实现上述技术目的，本发明试剂盒的技术方案为：
一种动物组织DNA提取的试剂盒，试剂包括裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液，所述洗涤液包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ；所述裂解液含有十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和曲拉通X-100；所述结合液含有异丙醇；所述洗涤液Ⅰ含有盐酸胍、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和异丙醇；所述洗涤液Ⅱ含有乙酸钠和异丙醇；所述洗涤液Ⅲ含有异丙醇；所述核酸洗脱液含有三羟甲基氨基甲烷。
优选地，在所述裂解液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5%-3%（m/v），乙二胺四乙酸的浓度为10-40mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为1-5mol/L，曲拉通X-100的浓度为0.5%-3%（v/v），余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐酸调节所述裂解液的pH值为7.0-9.0。更为优选地，所述十二烷基硫酸钠的浓度为2%（m/v），所述乙二胺四乙酸的浓度为20mmol/L、所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L，所述氯化钠的浓度为1.4mol/L，所述曲拉通X-100的浓度为1%（v/v），裂解液的pH值调节为8.0。
优选地，在所述结合液中，所述异丙醇为分析纯，浓度大于99.9%。
优选地，在所述洗涤液Ⅰ中，盐酸胍的浓度为2-10mol/L，乙二胺四乙酸的浓度为10-40mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为1-5mol/L，异丙醇的浓度为50%-70%（v/v），余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐酸调节所述所述洗涤液Ⅰ的pH值为7.0-9.0。更为优选地，所述盐酸胍的浓度为5mol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为20mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L，所述氯化钠的浓度为1.4mol/L，所述异丙醇的浓度为50%（v/v），洗涤液Ⅰ的pH值调节为8.0。
优选地，在所述洗涤液Ⅱ中，乙酸钠的浓度为1-5mol/L，异丙醇的浓度为50%-80%（v/v）。更为优选地，所述乙酸钠的浓度为5mol/L，所述异丙醇的浓度为80%（v/v）。
优选地，在所述洗涤液Ⅲ中，异丙醇的浓度为50%-100%（v/v）。更为优选地，所述异丙醇的浓度为80%（v/v）。
优选地，在所述核酸洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为1-4mmol/L；使用氢氧化钠和盐酸调节所述核酸洗脱液的pH值为7.0-9.0。更为优选地，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为2mmol/L，所述核酸洗脱液的pH值调节为8.0。
本发明还提供两种上述试剂盒的应用方法，方法一的技术方案为，包括如下步骤：
①在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K并匀浆，于56℃水浴孵育30分钟后离心；
②离心后的上清液转移至新的EP管中，加入磁珠和结合液，结合时间10分钟；
③使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去EP管内所有液体；
④在EP管中加入洗涤液Ⅰ，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体；
⑤在EP管中加入洗涤液Ⅱ，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体；
⑥在EP管中加入洗涤液Ⅲ，混匀后，磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体。
⑦在EP管中加入核酸洗脱液，于56℃水浴下洗脱5分钟，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，将洗脱液转移至新的EP管内，在-20℃保存备用；
其中：步骤①中加入的裂解液与动物组织的体积质量比为30μL:1mg-6μL:1mg；步骤②中加入的磁珠与结合液的体积比为1:10-1:20；步骤④、⑤、⑥中加入的洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ分别与裂解液的体积比为1:1-3:1；步骤⑦中加入的核酸洗脱液与裂解液的体积比为1:1-1:5。作为更佳的组成，裂解液与动物组织的体积质量比为6μL:1mg，磁珠与结合液的体积比为1:15优选的，三种洗涤液与裂解液的体积比分别为2:1，核酸洗脱液与裂解液的体积比为1:3。
优选地，所述EP管容量为2mL，加入的试剂为：10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，动物组织50mg，裂解液300μL，磁珠20μL，结合液300μL，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ各600μL，核酸洗脱液100μL。
方法二的技术方案为，包括如下步骤：
①96孔反应板1排加入结合液；
②所述96孔反应板2排加入磁珠和去离子水；
③所述96孔反应板3排加入洗涤液Ⅰ；
④所述96孔反应板4排加入洗涤液Ⅱ；
⑤所述96孔反应板5排加入洗涤液Ⅲ；
⑥所述96孔反应板6排加入核酸洗脱液；
⑦在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K，匀浆后直接离心，将上清液转移至所述96孔反应板1排，所述96孔反应板放入核酸提取仪后开始运行，结束后将所述96孔反应板6排中的核酸洗脱液转移至新的EP管内，在-20℃保存备用；
其中：所述96孔反应板单孔内的液体总体积小于1.0mL，所述EP管容量为2mL；步骤①中加入的结合液为50-200μL；步骤②中加入的磁珠为20-100μL，且用300-600μL去离子水与其混匀；步骤③、④、⑤中加入的洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ分别为500μL-700μL；步骤⑥中加入的核酸洗脱液为50-300μL；步骤⑦中加入的裂解液为200μL-300μL，动物组织为10-50mg。作为更佳的组成，结合液与裂解液的体积比为2:3，三种洗涤液与裂解液的体积比分别为2:1，核酸洗脱液与裂解液的体积比为1:3，裂解液的与动物组织的体积质量比为6μL:1mg。
优选地，所述96孔反应板的7排至12排依次对应1排至6排，在所述7排至12排中进行与1排至6排相同的操作步骤。因96孔反应板为8×12孔，当所述96孔反应板仅使用1排至6排时，最多可一次性处理8个动物组织样本，而同时使用7排至12排时，使用核酸提取仪最多可一次性处理16个动物组织样本。
优选地，所述96孔反应板中加入的试剂为：10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，动物组织50mg，裂解液300μL，磁珠20μL和去离子水600μL，结合液200μL，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ各600μL，核酸洗脱液100μL。
本发明技术方案将磁珠法与传统的动物DNA提取中的裂解液相结合，利用蛋白酶K和SDS消化破碎细胞，再利用磁珠法的原理对裂解出的核酸进行纯化。本发明试剂盒可应用于多个物种动物组织DNA提取，包括人类、啮齿类、鸟类等多种生物，也可应用于同个物种不同组织的DNA提取，如心脏、肝脏、脾脏、肌肉、大脑等；提取过程既可以手工完成，也可以应用于全自动核酸提取仪自动完成；使用本发明试剂盒提取出的动物组织DNA可应用于PCR扩增、基因突变筛查、基因分型、基因测序等科研或法医鉴定或临床诊断的分析。
与传统的动物DNA的提取技术相比，本发明技术方案的有益效果为：
1．结合液异丙醇使得磁珠在高盐的作用下发挥更大的核酸结合能力，尽可能多的吸附组织细胞释放出的核酸，从而获取高浓度的核酸溶液；
2．使用三种洗涤液可以洗去动物组织样本中绝大部分的蛋白、酚类、多糖等杂质，最大限度的减少杂质的污染，从而获得高纯度的核酸溶液；
3．使用本发明的技术方案提取动物组织DNA，可有效的减少提取过程中核酸的损失，大大增加提取效率，且提取过程中不使用有毒试剂和有机溶剂，可大幅降低对实验人员的身体伤害；
4．本发明试剂盒应用于核酸提取仪，可一步完成动物组织DNA的提取，并可同时进行1-16个动物组织样本的DNA提取，实现核酸提取的自动化；
5．使用本发明试剂盒的提取过程简单、快速，所用试剂均为常规试剂，成本低，适用于实验室中各种规模的动物组织核酸提取，也适用于商业公司的试剂盒生产。
附图说明
图1为本发明实施例2中使用方法一提取的小鼠肝脏组织DNA的琼脂糖凝胶电泳条带；
图2为本发明实施例3中使用方法二提取过程中使用的96孔反应板立体图；
图3为图2所示96孔反应板在方法二提取过程中各排注入试剂的示意图；
图4为本发明实施例3中使用方法二提取的大鼠肝脏组织DNA的琼脂糖凝胶电泳条带。
具体实施方式
以下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本发明。
实施例1：动物组织DNA提取试剂盒的试剂配制
(1)裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量去离子水，加入浓度为2%（m/v）的十二烷基硫酸钠、加入浓度为20mmol/L的乙二胺四乙酸、加入浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、加入浓度为1.4mol/L的氯化钠、加入浓度为1%（v/v）的曲拉通X-100，加入去离子水至所需体积，使用氢氧化钠和盐酸调节pH值，使所述裂解液的pH值为8.0，高压蒸汽灭菌10分钟；
(2)结合液的配制：采用无水异丙醇；
(3)洗涤液Ⅰ的配制：加入浓度为10mol/L的盐酸胍、加入浓度为40mmol/L的乙二胺四乙酸、加入浓度为40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、加入浓度为2.8mol/L的氯化钠，以异丙醇体积比1:1进行稀释，使用氢氧化钠和盐酸调节pH值，使所述洗涤液Ⅰ的pH值为8.0，高压蒸汽灭菌10分钟；
(4)洗涤液Ⅱ的配制：配制80%异丙醇，以该溶液配制浓度为5mol/L的乙酸钠；
(5)洗涤液Ⅲ的配制：采用80%异丙醇；
(6)核酸洗脱液的配制：加入浓度为2mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，使用氢氧化钠和盐酸调节pH至8.0，高压蒸汽灭菌10分钟；
除上述所配制试剂外，应用本试剂盒还需要蛋白酶K、纳米磁珠及无水异丙醇，试剂盒中配备蛋白酶K及磁珠，试剂盒蛋白酶K保存于-20℃，其余保存于室温，有效期为1年。
实施例2：使用方法一应用实施例1中的试剂盒提取小鼠肝脏DNA
取同一只小鼠的肝脏样本8份，每份50mg。应用的具体操作为：
(1)取2mLEP管8只，各管中加入小鼠肝脏，裂解液300μL，20mg/mL蛋白酶K10μL，匀浆后56℃水浴孵育30分钟后离心；
(2)取8只新的2mLEP管，离心后的上清液转移至该管，加入磁珠20μL，结合液300μL，结合时间10分钟；
(3)用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内液体；
(4)加入洗涤液Ⅰ600μL混匀，用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内液体；
(5)加入洗涤液Ⅱ600μL混匀，用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内液体；
(6)加入洗涤液Ⅲ600μL混匀，用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内液体；
(7)加入核酸洗脱液100μL，并于56℃的水浴锅中洗脱5分钟，磁铁将磁珠吸附至管壁，将洗脱液转移至新的EP管内，-20℃保存备用。
提取完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，步骤如下：
(1)准确称量琼脂糖干粉0.4g，加至三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液40mL；在短时间内，用微波炉加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60℃，加入一滴荧光染料溴化乙锭，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
(2)室温下30-45分钟后凝胶完全后，小心拔出梳子，将5μLMarker加入加样孔内，取洗脱液样品5μL，加入6x样品缓冲液1μL，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
(3)接通电源，90V电压，电泳40～60min即可，根据指示剂电泳带的位置，判断是否终止电泳，电泳完毕，关上电源。打开凝胶成像系统及电脑上的系统软件，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，拍照并存储，并与核酸分子量标准Marker比较核酸的大小。
图1显示的是琼脂糖凝胶电泳检测方法一提取的小鼠肝脏DNA的电泳图。
实施例3：使用方法二应用实施例1中的试剂盒提取大鼠肝脏DNA
取同一只大鼠的肝脏样本8份，每份50mg。应用的具体操作为：
(1)96孔反应板1排加入结合液200μL；
(2)96孔反应板2排加入磁珠20μL和去离子水600μL；
(3)96孔反应板3排加入洗涤液Ⅰ600μL；
(4)96孔反应板4排加入洗涤液Ⅱ600μL；
(5)96孔反应板5排加入洗涤液Ⅲ600μL；
(6)96孔反应板6排加入核酸洗脱液100μL；
(7)取2mLEP管8只，管中加大鼠肝脏50mg、裂解液300μL和20mg/mL蛋白酶K10μL，匀浆后直接离心。上清液转移至96孔反应板1排，运行核酸提取仪，结束后将96孔反应板6排中的核酸洗脱液转移至新的EP管内，-20℃保存备用。
如图2为使用的96孔反应板的立体图，一个96孔反应板最多可一次性处理16个动物组织样本，另外8份样本在96孔反应板的7排至12排按照上述1排至6排的操作方法进行提取，图3为1排至12排均加入试剂后的96孔反应板侧视示意图。
提取完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，操作步骤同实施例2，图4为琼脂糖凝胶电泳检测方法二提取的大鼠肝脏DNA得到的电泳图。
以下对前述实施例2和实施例3中分别提取到的小鼠、大鼠肝脏DNA核酸进行定量及纯度检测。
取实施例2和实施例3中提取的动物组织DNA洗脱液各2μL作为样本，以实施例1中的洗脱液为空白，使用One-DropOD-1000仪测定样本A230、A260及A280的值，及波长为230nm、260nm及280nm的吸光光度值，利用比值A260/A280及A260/230评估所提取的核酸的纯度，利用A260×50ng/μL计算核酸的浓度，结果如下：
表一：使用方法一提取得到的小鼠肝脏核酸纯度和浓度
ID Type 260nm 280nm 230nm 260/280 260/230 C:ng/μL
1 DNA-50 2.201 1.201 1.104 1.83 1.99 110.053
2 DNA-50 4.263 2.298 2.198 1.86 1.94 213.198
3 DNA-50 4.724 2.563 2.512 1.84 1.88 236.239
4 DNA-50 3.545 1.926 1.79 1.84 1.98 177.258
5 DNA-50 5.199 2.8 2.751 1.86 1.89 259.954
6 DNA-50 5.114 2.764 2.648 1.85 1.93 255.703
7 DNA-50 5.221 2.802 2.631 1.86 1.98 261.089
8 DNA-50 5.012 2.715 2.598 1.85 1.93 250.626
表二：使用方法二提取得到的大鼠肝脏核酸纯度和浓度
ID Type 260nm 280nm 230nm 260/280 260/230 C:ng/μL
1 DNA-50 6.623 3.549 3.487 1.87 1.9 331.164
2 DNA-50 7.344 3.969 4.153 1.85 1.77 367.223
3 DNA-50 7.562 4.076 4.289 1.86 1.76 378.102
4 DNA-50 7.294 3.936 3.954 1.85 1.84 364.725
5 DNA-50 7.523 4.082 4.462 1.84 1.69 376.182
6 DNA-50 7.362 4 4.157 1.84 1.77 368.136
7 DNA-50 7.525 4.073 4.33 1.85 1.74 376.299
8 DNA-50 6.957 3.759 3.701 1.85 1.88 347.861
表一和表二的结果显示，采用发明中的试剂盒提取动物组织DNA的浓度和纯度均较高，其中：使用方法一提取的动物组织DNA，其A260/A280的值约为1.85，说明几乎没有蛋白和酚类物质的污染；其260/230的值大于1.94，说明没有盐类、多糖及有机溶剂的污染，50mg动物组织提取的核酸的浓度约为220.5ng/μL。使用方法二提取的动物组织DNA，其A260/A280的值为1.85，说明没有蛋白和酚类物质的污染；其A260/230的值约为1.79，说明没有盐类、多糖及有机溶剂的污染，50mg动物组织提取的核酸的浓度约为363.7ng/μL。上述结果说明本发明提供的试剂盒能有效的提取动物组织中的DNA，满足科研、法医鉴定及临床检测样本的需求。
应理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于供本领域技术人员了解本发明的内容并据以实施，并非具体实施方式的穷举，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，所述试剂盒中的试剂包括裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液，其特征在于：
所述裂解液含有十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和曲拉通X-100；
所述结合液含有异丙醇；
所述洗涤液包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ，其中：所述洗涤液Ⅰ含有盐酸胍、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和异丙醇；所述洗涤液Ⅱ含有乙酸钠和异丙醇；所述洗涤液Ⅲ含有异丙醇；
所述核酸洗脱液含有三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，其特征在于：在所述裂解液中，十二烷基硫酸钠的质量体积比浓度为0.5%-3%，乙二胺四乙酸的浓度为10-40mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为1-5mol/L，曲拉通X-100的体积比浓度为0.5%-3%，余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐酸调节所述裂解液的pH值为7.0-9.0；
在所述结合液中，异丙醇浓度大于99.9%。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，其特征在于：在所述洗涤液Ⅰ中，盐酸胍的浓度为2-10mol/L，乙二胺四乙酸的浓度为10-40mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为1-5mol/L，异丙醇的体积比浓度为50%-70%，余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐酸调节所述洗涤液Ⅰ的pH值为7.0-9.0。
4.根据权利要求1所述的基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，其特征在于：在所述洗涤液Ⅱ中，乙酸钠的浓度为1-5mol/L，异丙醇的体积比浓度为50%-80%；在所述洗涤液Ⅲ中，异丙醇的体积比浓度为50%-100%。
5.根据权利要求1所述的基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，其特征在于：在所述核酸洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为1-4mmol/L；使用氢氧化钠和盐酸调节所述核酸洗脱液的pH值为7.0-9.0。
6.权利要求1-5任一项所述基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒的应用，其特征在于包括以下步骤：
①在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K并匀浆，于56℃水浴孵育30分钟后离心；
②离心后的上清液转移至新的EP管中，加入磁珠和结合液，结合时间10分钟；
③使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去EP管内所有液体；
④在EP管中加入洗涤液Ⅰ，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体；
⑤在EP管中加入洗涤液Ⅱ，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体；
⑥在EP管中加入洗涤液Ⅲ，混匀后，磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体；
⑦在EP管中加入核酸洗脱液，于56℃水浴下洗脱5分钟，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，将洗脱液转移至新的EP管内，在-20℃保存备用；
其中：加入的裂解液与动物组织的体积质量比为30μL:1mg-6μL:1mg；加入的磁珠与结合液的体积比为1:10-1:20，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ分别与裂解液的体积比为1:1-3:1，核酸洗脱液与裂解液的体积比为1:1-1:5。
7.根据权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于：所述EP管容量为2mL，加入的试剂为：10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，动物组织50mg，裂解液300μL，磁珠20μL，结合液300μL，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ各600μL，核酸洗脱液100μL。
8.权利要求1-5任一项所述基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒的应用，其特征在于包括以下步骤：
①96孔反应板1排加入结合液；
②所述96孔反应板2排加入磁珠和去离子水；
③所述96孔反应板3排加入洗涤液Ⅰ；
④所述96孔反应板4排加入洗涤液Ⅱ；
⑤所述96孔反应板5排加入洗涤液Ⅲ；
⑥所述96孔反应板6排加入核酸洗脱液；
⑦在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K，匀浆后直接离心，将上清液转移至所述96孔反应板1排，所述96孔反应板放入核酸提取仪后开始运行，结束后将所述96孔反应板6排中的核酸洗脱液转移至新的EP管内，在-20℃保存备用；
其中：所述96孔反应板单孔内的液体总体积小于1.0mL，所述EP管容量为2mL；加入的裂解液为200μL-300μL，动物组织为10-50mg；加入的磁珠为20-100μL，且用300-600μL去离子水与其混匀；加入的结合液为50-200μL，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ分别为500μL-700μL，核酸洗脱液为50-300μL。
9.根据权利要求8所述的试剂盒的应用，其特征在于：所述96孔反应板的7排至12排依次对应1排至6排，在所述7排至12排中进行与1排至6排相同的操作步骤。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒的应用，其特征在于：加入的试剂为：10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，动物组织50mg，裂解液300μL，磁珠20μL和去离子水600μL，结合液200μL，洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ各600μL，核酸洗脱液100μL。
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