CN106148326A - 宏基因组dna的提取方法 - Google Patents

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract

本发明提供了一种宏基因组DNA的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：先向待测样品中加入缓冲液液和蛋白酶K得到混合液，对混合液加热使缓冲液和蛋白酶K裂解待测样品中的宿主细胞，然后进一步加热使蛋白酶K失活，再经过击打使微生物破壁后，进行DNA提取得到所述宏基因组DNA。本发明先加入裂解液悬浮宿主细胞，然后加入蛋白酶K使宿主细胞的蛋白质降解，DNA游离。由于没有溶菌酶及外力作用，细菌微生物能够保持完整形态。在击打使微生物破壁的过程中，一方面细菌微生物被破壁，另一方面宿主DNA被打断成小片段甚至降解，最后按照常规方法提取宏基因组DNA，就可以减少宿主DNA的背景干扰。

Description

宏基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及宏基因组检测领域，具体地说是一种宏基因组DNA的提取方法。
背景技术
宏基因组(Meta-genome)，又称为元基因组，是指特定环境中全部微生物遗传物质的总和。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。
动物肠道、体液及其他组织中微生物的种类及丰度极大影响着宿主自身生存状态。例如人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和降低自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应。一旦肠道菌群失调，就会产生一系列疾病。因此，动物体内微生物多样性的研究对动物健康研究至关重要。随着高通量测序技术的兴起以及测序成本的进一步降低，通过DNA测序的方法对微生物多样性进行研究也逐渐成为可能。然而，99％的肠道细菌群都不能通过传统方法培养，也就不能通过传统的基因组学方法获取它们的基因信息。宏基因组学技术(Metagenomics)，为我们提供了充分分析动物体内微生物多样性的手段，该技术不需要对菌群进行传统培养，而是直接测序肠道样品中的全部DNA。这种技术测序所得到的不是一种细菌的完整基因，而是动物体内所有菌群的混杂基因，其中大量是以前无法认识的菌种。
对于宏基因组学而言，宏基因组DNA的提取效率是影响实验成功与否的关键步骤。目前提取宏基因组DNA时，一般需要利用裂解液、溶菌酶、蛋白酶K等裂解细胞，然后用玻璃珠进行震荡破壁，再利用酚/氯仿抽提，最后经过乙醇沉淀或者磁珠吸附得到宏基因组DNA。然而相对于宿主DNA，其他微生物菌群DNA的含量一般较少，宿主DNA一方面会大大影响微生物菌群DNA的提取效率，另一方面测序结果中掺入大量宿主DNA的干扰数据，会增加后续信息分析的处理难度，影响分析结果。
为了解决该技术问题，公开日为2013年4月24日，公开号为CN103060309A的中国专利《宏基因组提取方法》公开了一种宏基因组提取方法，该方法利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响，但是该方法步骤复杂，需要预先进行杂交处理，再通过磁珠捕获的方式去除宿主DNA，提高了成本与实验难度。
公开日为2016年4月27日，公开号为CN105525033A的中国专利《检测血液中微生物的方法及装置》公开了一种检测血浆中微生物的方法，该方法先对血液中DNA进行测序，然后去除宿主测序数据，虽然可以去除宿主DNA的干扰，但是测序数据量大，后续信息分析难度大，并且没有从根本上提高宏基因组DNA的提取效率，提取的核酸DNA仍然包括宿主DNA。
公开日为2015年5月20日，公开号为CN104630203A的中国专利《制备昆虫肠道菌群DNA的方法》公开了一种制备昆虫肠道菌群DNA的方法，该方法通过分离出完整的肠道，单独对肠道进行处理获得其内容物来去除宿主DNA。但是这一方法仅能去除肠道外部包裹的昆虫组织DNA，对于存在于肠道内部的宿主细胞无法去除。后续在DNA提取阶段会将这些宿主游离的DNA及小块组织部分一起抽提，得到的仍然是微生物菌群DNA和昆虫DNA的混合物。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种宏基因组DNA的提取方法，该提取方法可以减小宿主DNA的背景干扰。
一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种宏基因组DNA的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：先向待测样品中加入缓冲液和蛋白酶K得到混合液，对混合液加热使蛋白酶K裂解待测样品中的宿主细胞，然后进一步加热使蛋白酶K失活，再经过击打使微生物破壁后，进行DNA提取得到所述宏基因组DNA。
优选的，在55～65℃下加热10～30min使蛋白酶K裂解宿主细胞。
优选的，在80～95℃下加热10～20min使蛋白酶K失活。
作为公知技术，蛋白酶K在适当的温度下可以裂解宿主细胞，蛋白酶K在适当的温度下可以降解宿主细胞膜蛋白等蛋白质，裂解宿主细胞，使宿主DNA充分游离。并且当温度进一步提高时，高温可以使蛋白酶K失活。具体的温度和加热时间可以根据待测样品的种类经过实验确定，一般选择在55～65℃下加热10～30min使蛋白酶K裂解宿主细胞，在80～95℃下加热10～20min使蛋白酶K失活。
更优选的，蛋白酶K的工作浓度为50～100μg/mL。添加的蛋白酶K浓度可以根据常规选择，一般为10～20mg/mL，根据需要向待测样品中加入蛋白酶K后，使蛋白酶K的工作浓度在50～100μg/mL即可。
更优选的，所述缓冲液为DNA裂解液。缓冲液的主要作用是为了给蛋白酶K提供工作环境，因此缓冲液的加入量可以按照本领域常规的提取宏基因组DNA的方法进行。例如利用试剂盒进行DNA提取。按照试剂盒说明书选择具体的缓冲液以及加入量即可，一般为每0.2～0.5g待测样品中加入0.8mLDNA裂解液。所述击打使微生物破壁的过程也可按照试剂盒说明书进行，例如磁珠击打(beads beating)，本发明优选为根据试剂盒说明书在每0.2～0.5g待测样品中加入500mg玻璃珠(glass beads)。
更进一步的，本发明优选的，所述宏基因组DNA的提取利用Mag-Bind Soil DNAKit进行。
优选的，所述宿主包括人或动物。
优选的，所述待测样品包括体液或粪便。
优选的，所述体液包括血液、血清、血浆或唾液。
优选的，所述待测样品包括离体的组织样本。
本发明利用宿主的细胞没有细胞壁，而细菌微生物则有细胞壁的原理，先加入缓冲液悬浮宿主细胞，然后加入蛋白酶K使宿主细胞的蛋白质降解，宿主细胞裂解，宿主DNA充分游离。由于没有溶菌酶及外力作用，细菌微生物能够保持完整形态。在击打过程中，比如磁珠击打(beads beating)使微生物破除细胞壁的过程中，一方面细菌微生物被外力作用破壁，另一方面宿主DNA被打断成小片段甚至降解，因此最后按照常规方法提取宏基因组DNA，就可以减少宿主DNA的背景干扰。并且在后续的磁珠提取宏基因组DNA时，磁珠会优先结合大片段的宏基因组DNA，进一步减少宿主DNA的背景干扰。本发明方法简单，仅需在常规的宏基因组DNA提取方法的基础上加上两步加热处理步骤即可达到基本去除宿主DNA干扰的效果，时间短、成本低，具有很强的实用性。
附图说明
图1为粪便样品的宏基因组DNA的2％琼脂糖凝胶电泳检测胶图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例用于宏基因组DNA提取的试剂盒为OMEGA公司的Mag-Bind Soil DNAKit。
以下实施例用于宏基因组DNA建库的试剂盒为NEXTflexTMRapid DNA SequencingKit。
实施例1粪便样品的宏基因组DNA提取
取两个干净的5ml离心管，称取1号和2号两个不同的粪便样品各1g于离心管中，向两管中分别加入1.6ml缓冲液Buffer SLX Mlus后震荡混合均匀。分别称取500mg glassbeads置于编号为A、B、C、D的4个2mL离心管中，然后分别向编号为A和B的离心管中加入5μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K。再将1号粪便样品分别取1mL加入编号为A、C的离心管中，2号粪便样品分别取1mL加入编号为B、D的离心管中。编号为A、B、C、D的离心管(以下简称A管、B管、C管和D管)中成分如表1所示：
A B C D
粪便样品 1 2 1 2
缓冲液 1.6mL 1.6mL 1.6mL 1.6mL
蛋白酶K 5μL 5μL 0 0
glass beads 500mg 500mg 500mg 500mg
表1编号为A、B、C、D的离心管中成分
将编号为C、D的离心管按照试剂盒Mag-Bind Soil DNA Kit的说明书操作提取宏基因组DNA，将含有宏基因组DNA的溶液置于相应的编号为C、D的离心管中。
将编号为A、B的离心管在65℃下加热10min使蛋白酶K裂解宿主细胞之后，再在95℃下加热10min使蛋白酶K失活。然后再按照试剂盒Mag-Bind Soil DNA Kit的说明书提取宏基因组DNA，将含有宏基因组DNA的溶液置于相应的编号为A、B的离心管中。
分别取上述含有宏基因组DNA的溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测的胶图如图1所示，从左到右依次为宿主DNA、A管得到的宏基因组DNA、B管得到的宏基因组DNA、C管得到的宏基因组DNA、D管得到的宏基因组DNA，所述宿主DNA即人的DNA。从图1可以看出，宏基因组DNA含有较多种类的微生物DNA。经过本发明方法处理后的A、B管得到的宏基因组DNA基本能够去除宿主DNA，而没有经过本发明方法处理后的C、D管得到的宏基因组DNA则明显含有宿主DNA。
对上述提取的A-D管的宏基因组DNA用TBS-380荧光计进行定量检测，结果如表2所示，均达到DNA文库构建的要求。
样品编号 A B C D
浓度(ng/μL) 16.46 16.58 19.04 27.07
总量(ng) 823 829 952 1353.5
体积(μL) 50 50 50 50
表2宏基因组DNA的浓度
对以上提取的A-D管的宏基因组DNA分别进行pair-end 300文库构建，然后使用Hiseq2500平台对以上4个构建后的文库进行测序，分析结果如表3所示：
编号 A B C D
total reads 248258 263452 260032 283587
Homo reads 2 3 11 17
Homo reads比例 0.0008％ 0.0011％ 0.0042％ 0.006％
表3实施例1的宏基因组DNA测序结果
从表3可以看出，没有经过本发明方法处理的C、D管得到的宏基因组DNA中含有宿主DNA的量是经过本发明方法处理后的A、B管得到的宏基因组DNA中含有宿主DNA量的5倍以上。
实施例2血液样品的宏基因组DNA提取
分别取两个不同的血液样品按照实施例1的方法进行宏基因组DNA的提取。其中A、B管中的血液样品加入5μL浓度为15mg/mL的蛋白酶K，在60℃下加热20min使蛋白酶K裂解宿主细胞之后，再在80℃下加热20min使蛋白酶K失活，然后再按照试剂盒说明书操作步骤提取宏基因组DNA。而C、D管中的血液样品直接按照试剂盒说明书操作步骤提取宏基因组DNA。
将以上来自血液样品的宏基因组DNA进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到的胶图与图1类似。然后再进行文库构建以及测序分析，结果如表4所示，没有经过蛋白酶K加热处理后的宏基因组DNA中宿主DNA的含量为经过蛋白酶K加热处理后的6倍左右。
编号 A B C D
total reads 308258 293452 290032 303587
Homo reads 3 3 20 17
Homo reads比例 0.001％ 0.001％ 0.0059％ 0.0056％
表4实施例2的宏基因组DNA测序结果
实施例3组织样品的宏基因组DNA提取
分别取两个不同人的肠道组织样品，按照实施例1的方法进行宏基因组DNA的提取。其中A、B管中的肠道组织样品加入5μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，在55℃下加热30min使蛋白酶K裂解宿主细胞之后，再在90℃下加热15min使蛋白酶K失活，然后再按照试剂盒说明书操作步骤提取宏基因组DNA。而C、D管中的肠道组织样品直接按照试剂盒说明书操作步骤提取宏基因组DNA。
将以上来自肠道组织样品的宏基因组DNA进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到的胶图与图1类似。然后再进行文库构建以及测序分析，结果如表5所示，没有经过蛋白酶K加热处理后的宏基因组DNA中宿主DNA的含量为经过蛋白酶K加热处理后的5～10倍。
编号 A B C D
total reads 228258 233452 210032 223587
Homo reads 3 1 15 13
Homo reads比例 0.0013％ 0.0004％ 0.0071％ 0.0058％
表5实施例3的宏基因组DNA测序结果
通过以上实施例可以看出，经过本发明的蛋白酶K加热处理后的宏基因组DNA中宿主DNA干扰大大降低。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (10)

1.一种宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述提取方法包括如下步骤：先向待测样品中加入缓冲液和蛋白酶K得到混合液，对混合液加热使蛋白酶K裂解待测样品中的宿主细胞，然后进一步加热使蛋白酶K失活，再经过击打使微生物破壁后，进行DNA提取得到所述宏基因组DNA。
2.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：在55～65℃下加热10～30min使蛋白酶K裂解宿主细胞。
3.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：在80～95℃下加热10～20min使蛋白酶K失活。
4.根据权利要求1～3中任一项所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述蛋白酶K的工作浓度为50～100μg/mL。
5.根据权利要求1～3中任一项所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述缓冲液为DNA裂解液。
6.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述宏基因组DNA的提取利用Mag-Bind Soil DNA Kit进行。
7.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述宿主包括人或动物。
8.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述待测样品包括体液或粪便。
9.根据权利要求8所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述体液包括血液、血清、血浆或唾液。
10.根据权利要求1所述宏基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述待测样品包括离体的组织样本。
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