CN112941214B - 一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。本发明提供了一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物，由序列1‑序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成。本发明建立的一种针对42中临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因高通量测序技术领域，具体涉及一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。
背景技术
随着测序技术的不断发展，测序成本的不断降低，高通量测序技术逐渐成为生命科学研究及医学检测的常规实验方法。2000年人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的完成给基因组学研究带来了翻天覆地的变化，实现了人类第一次在分子水平上的全面自我认识，构建了第一个基因组图谱。随后，新一代测序技术通过全基因组测序催生了丰富多彩的基因组图谱，加速了测序技术的蓬勃发展。
由于某些科学研究不需要对全基因组进行测序，针对目标区域的测序方法开始广泛运用。扩增子测序是一种针对保存有生物遗传信息的多态性基因区域(如16S、18S、ITS)进行靶向测序的方法。首先针对感兴趣的基因组区域设计相应引物，通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后再进行高通量测序，分析特定基因组区域中的基因变异。扩增子测序是一种高靶向性方法，根据不同的研究需求，一般选择扩增16S高变区来区分环境样品的细菌和古菌群落，ITS区域扩增用以评估真菌群落，原生动物等为主的真核微生物群落研究可通过18S高变区测序来实现。此外，也可通过特定的功能基因(如，抗生素耐药基因)测序等来揭示特定功能相关的环境微生物群落分布。扩增子测序技术对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用，同时广泛应用于系统发育和分类学研究。
自20世纪40年代青霉素、链霉素相继用于治疗细菌引起的感染，人类抗生素时代正式开启。抗生素对于感染性疾病的治疗和控制起到了至关重要的作用，大大延长了人类的寿命。然而，近年来随着临床和畜牧业上抗生素的广泛应用，耐药细菌开始大量出现，四环素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、多肽类、喹诺酮类等常用抗生素均出现了不同程度的耐药情况，病原菌耐药形势日趋严重。更重要的是，新药的开发速度远慢于耐药细菌的进化速度，预示着“后抗生素时代”的提前到来。2016年9月联合国大会上将细菌耐药性问题视为“现代医药最大的威胁之一”，细菌耐药性已成为全球备受关注的问题。
革兰氏阴性菌是临床主要的致病菌，可造成呼吸系统、泌尿系统、血液系统、胸腔、腹腔、创面等多种部位的感染。革兰氏阴性菌的耐药性分为先天获得和后天获得，主要分为外膜通透屏障、细菌主动外排、抗生素作用靶点青霉素结合蛋白的改变、抗生素酶的作用四种耐药机理，了解其病原菌耐药特性对于延缓耐药菌株的产生，控制院内感染具有重要的意义。
相对于全基因组测序(WGS)，靶向重测序技术直接从样品中对感兴趣的基因组区域进行分离测序。这种方法能够更加高效且经济地发挥NGS技术的优势，在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向测序技术能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现地。目前，扩增子测序技术多侧重于肿瘤基因测序、疾病筛查和16S测序，目前尚未有针对耐药基因的相关方法建立。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物。
本发明提供的成套引物，由序列1-序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成。
上述成套引物中，所述成套引物由引物组1和引物组2组成；
所述引物组1由序列1-序列46中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成；
所述引物组2由序列47-序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成。
本发明另一个目的是提供一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；
所述PCR试剂1包括上述中的引物组1，
所述PCR试剂2包括上述中的引物组2。
上述多重PCR试剂中，所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为400nMol/L；
所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为400nMol/L。
本发明还有一个目的是提供一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的多重PCR试剂。
上述的引物组或上述的多重PCR试剂或上述的试剂盒在如下1)-3)中至少一种或者具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)构建革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序文库；
2)革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序；
3)检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因。
本发明还提供了如下方法：
本发明提供了一种检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因的方法，包括如下步骤：
1)用上述多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；
2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；
3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因。
本发明提供了一种对待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因进行测序的方法，包括如下步骤：
1)用上述多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；
2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；
3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因。
上述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tet(X3)和tolC基因。
本发明设计了一种基于Ion S5系统的多重扩增子靶向测序panel，通过直接扩增环境总DNA的特定区域，解释某一特定样本环境抗生素耐药基因分布、丰度变化和组成情况，将环境及人体中细菌耐药基因特性与耐药表型进行关联分析，通过不同样品比较研究耐药基因传播、耐药基因与环境、耐药基因与宿主之间的关系。本发明建立的一种针对42中临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。
附图说明
图1为本扩增子测序方法所设计的抗生素耐药基因分布图。
图2为扩增子测序文库构建的简易流程图。
图3为样品所构建文库Ion S5扩增子测序结果评估图。
图4为16例样品测序数据抗生素耐药基因分析统计热图。
图5为6例样品所建文库上机测序数据与宏基因组测序对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中主要试剂及仪器
表1为主要仪器及试剂
实施例1、革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及扩增子测序方法的建立
一、革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组的制备
参考ResFinder文库，通过统计和分析选出目前较为常见、流行广泛的革兰氏阴性菌耐药基因，共42种，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分别下载基因序列。
图1为本扩增子测序方法所设计的抗生素耐药基因分布图。图2为扩增子测序文库构建的简易流程图。
通过多次设计、分析和比对，基因总体覆盖率为95.92％，扩增子长度范围为125bp-275bp，包括两个引物池(primer pool 1和primer pool 2)，共42对引物，具体见表2所示。
表2为42个革兰氏阴性菌耐药基因的扩增引物
上表中，第3列从上到下的序列的编号依次为序列1至序列84中的单数，第4列从上到下的序列的标号依次为序列1至序列84中的双数。
primer pool 1由aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX和tet(X4)基因的扩增引物(序列1-序列46中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列)组成，primer pool 2由aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tet(X3)和tolC基因的引物组成(序列47-序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列)。
二、扩增子测序方法的建立
1、多重PCR制备扩增子(2primer pools)
提取待测样本的宏基因组DNA，以宏基因组DNA为模板，分别采用primer pool 1和primer pool 2进行2个体系的多重PCR扩增。
多重PCR扩增反应体系配制：5×Ion AmliseqTM HiFi Mix(Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0试剂盒中)5μL，模板(2-100ng)≤7.5μL，无核酸水加至体系为12.5μL。
将上述多重PCR扩增反应体系充分混匀，分别转移5μL至两个PCR管中，随后分别加入5μL的primer pool 1和5μL的primer pool 2，形成2个含有引物的多重PCR扩增反应体系，每个反应体系中各个引物的终浓度均为200nmol/L，且各引物配比一致；分别轻轻涡旋或吹打混匀后简单离心，进行多重PCR扩增，得到primer pool 1多重PCR扩增产物和primerpool 2多重PCR扩增产物。
上述多重PCR扩增的反应程序为：酶激活：99℃，2min；变性：99℃，15s；退火和延伸60℃，4min，21±3个循环。
上述产物若长时间不使用，可保存在-20℃。
2、扩增子文库的构建
1)多重PCR产物连接Adapter
下述步骤所涉及试剂均包含在中Ion XpressTM adapters(美国Thermo公司，4471250)和Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0试剂盒(美国Thermo公司，4480441)中，具体步骤如下：
将上述1得到的primer pool 1多重PCR扩增产物和primer pool 2多重PCR扩增产物小心混合，使得样品产物的总体积为20μL，并向体系中加入2μL FuPa Reagent(IonAmpliSeqTM Library Kit 2.0试剂盒中)消化(合计22μL)，充分混匀，运行下列程序：50℃，10min；55℃，10min；60℃，20min；10℃，最多保持1h。
多重PCR产物消化结束后向上述消化后产物中按顺序依次添加：4μL SwitchSolution(Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0试剂盒中)、2μLIon XpressTM barcodeadapter mix(Ion XpressTM adapters)、2μLDNA连接酶(Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0试剂盒中)，总体积30μL。充分混匀后，放置在PCR仪内，运行下列程序：22℃，30min；68℃，5min；72℃，5min；10℃，最多保持24h。得到连接产物。
2)、扩增子文库纯化
将KAPA Pure Beads(购于美国Beckman公司，005328-13-1)从4℃冰箱内取出，室温环境下放置30min，涡旋使其混匀。
将上述1)得到的连接产物转入新的1.5mL离心管中，加入1.5倍体积(μL)的KAPApure beads，吹打，使DNA与磁珠充分混匀，室温条件下孵育5分钟。再将离心管置于磁力架上静置2-3min，待混合液体变澄清后，小心弃掉上清，注意不要吸到磁珠。加入150μL新配置好的70％乙醇，轻柔地上下颠倒5次后，磁力架上孵育至液体澄清，弃掉上清，重复洗涤一次。吸弃乙醇后，开盖，室温放置约5min，将磁珠晾干。
向晾干的KAPA Pure Beads中加入50μL Low TE(购于美国Thermo公司，4480441)，涡旋使TE与磁珠充分混匀，简单离心，室温条件下静置至少2min。将离心管置于磁力架上，静置至少2min，待溶液完全澄清后，吸取上清液至新的PCR管中，得到扩增子文库。
制备好的文库可长期放置于-20℃。
3、扩增子文库定量和检测
1)、文库定量
采用荧光定量试剂盒Ion Library
Quantitation Kit(购于美国Thermo公司，4468802)测定扩增子文库的浓度，具体步操作骤如下：
(1)标准品梯度稀释：将标准品文库E.coli DH10B(Ion Library
Quantitation Kit内试剂)(-68pM)10倍梯度稀释，稀释后浓度分别为：6.8pM、0.68pM、0.068pM、0.0068pM和0.00068pM。
(2)样品稀释：取制备好的文库，加入198μL无核酸水，稀释成100倍。稀释后的文库可长期放置于-20℃冰箱中。
(3)配制荧光定量反应体系：对于每个样品、标准品和阴性对照，将10μL 2×IonLibrary qPCR Master Mix、1μL Ion Library
Quantitation Assay(20×)和4μL无核酸水彻底混合，取15μL加入96孔板中(2个重复)。
(4)荧光定量PCR反应程序为：95℃预变2min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
(5)扩增子文库浓度计算：依据梯度稀释的标准品构建标准曲线，并计算出待测文库的具体浓度，根据浓度将样品文库定量到40-60pM后上机。
2)扩增子文库测序(Amplicon测序)
将所有待测文库等量混合，最终取25μL进行扩增子测序(Ion S5系统)。
实施例2、高通量扩增子测序的引物组革兰氏阴性菌耐药基因检测中的应用
按照实施例1的二的方法进行：
1、多重PCR制备扩增子(2primer pools)
提取表3所示的20例粪便和环境样本的宏基因组DNA，分别以各个样本的宏基因组DNA为模板，按照实施例1的二的方法扩增，得到primer pool 1多重PCR扩增产物和primerpool 2多重PCR扩增产物。
表3为待测样本信息
2、扩增子文库的构建
与实施例1的方法二相同。
3、扩增子文库定量和检测
与实施例1的方法二相同。
提取上述20例粪便和环境样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，按照实施例1进行扩增子文库的构建，按照实施例1进行文库的定量和测序，通过测序数据结果分析样品中耐药基因及相对应的reads数，使用seqkit软件对原始数据进行质量控制，过滤掉质量值<20或者有>10的不确定核苷酸。ISP Loading率在90％以上，测序片段大小在125-275bp范围内，样品≥Q20(代表错误率＜1％)质量值在90％以上，测序分析结果与耐药基因文库(表1中的耐药基因)的比对率为93％，精确率为98.5％(图3，A：ISP Loading率；B：能够与参考文库比对的比例；C：测序读长分布；D：测序准确度)。
选取表3所示的样品1-16，对本发明方法的测序结果进行分析统计。结果表明，在环境宏基因组样品同时检测出多种耐药基因，各个样品检测出的耐药基因数见表4，不同种类样品、不同个体之间的耐药基因分布情况存在差异显著(图4)。
选取表3所示的样品17-22，利用宏基因组方法与本实验扩增子测序方法进行验证和比对，结果表明本试验测序方法检出的耐药基因数均高于宏基因组测序法，最高能达到40：6(约为7：1)，且宏基因组测序法测出的序列在本方法中均有检出(图5)，说明扩增子测序方法极大地提高了耐药基因的检出率，避免了流行病学及临床分析中重要耐药基因的遗漏。此外，本方法中，样品的平均数据量为0.2G，相对于宏基因组测序5G的数据量，极大地提高了靶向测序效率和测序深度，且耐药基因的reads数也极大幅度的提高，增加了测序的准确性。
综上，本扩增子测序方法上机结果显示，测序质量良好，所有样品均可以正确区分，且各样品数据量比例接近均一。由此说明，本发明所提供的一种构建耐药基因高通量扩增子测序文库的方法成功建立。
表4为测序结果分析
| 序号 | 样品编号 | 检测出耐药基因数 |
| 1 | 11DF1 | 26(61.90％<sup>a</sup>) |
| 2 | 11DT1 | 31(73.81％) |
| 3 | 11BF3 | 27(64.29％) |
| 4 | 11BF2 | 29(69.05％) |
| 5 | 11AT1 | 30(71.43％) |
| 6 | 11AF3 | 27(64.29％) |
| 7 | WM-N7 | 28(66.67％) |
| 8 | WM-H3 | 28(66.67％) |
| 9 | LD-N6 | 24(57.14％) |
| 10 | LD-H2 | 20(47.62％) |
| 11 | DY-N6 | 31(73.81) |
| 12 | DY-H3 | 26(61.90％) |
| 13 | SKX-N6 | 25(59.52％) |
| 14 | SKX-H3 | 28(66.67％) |
| 15 | HF1 | 23(54.76％) |
| 16 | HF2 | 18(42.86％) |
a：检测出的耐药基因数占设计基因数(42)的百分比。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120>一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用
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<170> PatentIn version 3.5
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acctttgcgg cattcacctt 20
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<211> 20
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tcgttcaggg attcctgtcg 20
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tcacgttgag cctctatatg gtgat 25
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<211> 22
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tgtcgtcatc tacggccttt tc 22
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gggctgacat tttagttgaa agtg 24
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ttgaaagaaa atgaagtaaa tatt 24
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ccggatcgaa ccggttgaca 20
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gatctacgac a 11
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ccagtaaatc tggtggcgtg atc 23
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caaaggatca ccctaagttc tgcg 24
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cgcaagtgcg cactgaattt tt 22
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ccgtttattt catgcgcaac ta 22
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attagtggat gaaggtagcc gcc 23
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aaaacgccag caccgaatc 19
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ggcgcgatga tgctctcctt 20
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tgttcacgat agatgacaga acctatc 27
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aagctccttt tgatggtact ataggagatg cttt 34
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<211> 32
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aactttattt tattgattct gttatagatg ct 32
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ccgcaccgtt cgtgaaaaac at 22
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ggattttgga taaagaactg ct 22
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ctatcccgat attgctgagg cgg 23
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ttcaaaagct gaagtcggcg ttgg 24
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acacagaaat cgagcgtatc gc 22
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tggatcacat tgcggcgttc tt 22
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gccctgatgg cggtcttctt 20
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ctacatcctg cttgccttcg 20
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tagtgatgaa ttggaaatct cgttatatgg 30
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tctcctatgg ttatctgaac cattcttttc 30
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aacagcagat ttggttattc ttgccaatgg 30
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cccaataata atggtgcatt gcattttgga a 31
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<211> 31
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ttgagaataa accgagtgaa acagcagatt t 31
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cccaataata atggtgcatt gtatttag 28
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cggaggaatt ctttgacccg gttcctgaac aggatcta 38
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caagcttatc tgggacaaaa agaagatca 29
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aaaaagttac tatccaggga attaaagggt 30
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gtttgatgga agatgatgaa gaatacggca 30
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aatctgacgc tgggtaaagc at 22
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aaagccgtcg cgatgtatta gc 22
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attacaccta tacaagaagt aa 22
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tgcaaatgaa agctggtgat gatattgc 28
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ggtgagctgg tgatatggga ta 22
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tttgatttaa acgtggccaa tatggac 27
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gttttgtttg ccgc 14
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atgaatatgg cttgctgcaa gtgcc 25
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gaaagtatgc ggtcgtaaca cg 22
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aagacttcgc ctctaacata aattatag 28
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gtcgctggat gagcagcg 18
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aatctggcgc agcggct 17
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<211> 22
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<400> 63
gcgcggatga gtatgatgtc ga 22
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<400> 64
ataacggcaa agatatgctg atc 23
<210> 65
<211> 22
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<400> 65
aatatatctt catggcacac ca 22
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gacaatctga ccacacacca ct 22
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ctggtactgg ctatcggtat cg 22
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tgatctcggc catcaactcg 20
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catcaccggc acgttgag 18
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<211> 18
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gtcgtggaac atgttgcg 18
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<211> 21
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<400> 71
taaaaaaggc attgtcgctg c 21
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<400> 72
acctttgccc tgcaggatg 19
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<211> 23
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<400> 73
cgatatggtt gtttgccatg gtg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
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<400> 74
cttgccttct atctgcgatt gga 23
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 75
atactccagg acatgtggat tttatttc 28
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
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<400> 76
acaagaagta tatgatgtag gaagcaaagc 30
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<211> 22
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<213> Artificial sequence
<400> 77
gctcggtggt atctctgctc at 22
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<211> 24
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<400> 78
gcagccctat gggtcatata tggc 24
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<211> 22
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<213> Artificial sequence
<400> 79
cgctcttacg caacttgcgg at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 80
gttttgggca tccataggac tg 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 81
gcagatttgg ttattcttgc caatgg 26
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 82
ttgtatttag gaattagttt taaaac 26
<210> 83
<211> 24
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<400> 83
tgacgatagc aatatgggcc agaa 24
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
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<400> 84
acaaacaagc cgtagtttcc gctcaaa 27
Claims (8)
1.一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物，由序列1-序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
2.根据权利要求1中所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物由引物组1和引物组2组成；
所述引物组1由序列1-序列46中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成；
所述引物组2由序列47-序列84中编号单数序列所示的引物和编号双数序列的反向互补序列所示的引物组成。
3.一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；
所述PCR试剂1由权利要求2所述中的引物组1、5×Ion AmliseqTM HiFi Mix和水组成，
所述PCR试剂2由权利要求2所述中的引物组2、5×Ion AmliseqTM HiFi Mix和水组成；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
4.根据权利要求3所述的多重PCR试剂，其特征在于：所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为200nmol/L；
所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为200nmol/L。
5.一种用于革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒，包括权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的多重PCR试剂；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
6.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的多重PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下1)-3)中至少一种中的应用：
1)构建革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序文库；
2)革兰氏阴性菌耐药基因高通量扩增子测序；
3)检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
7.一种检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因的方法，包括如下步骤：
1)用权利要求3或4所述的多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；
2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；
3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
8.一种对待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因进行测序的方法，包括如下步骤：
1)用权利要求3或4所述的多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；
2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；
3)测序所述扩增子文库，实现对待测样本中革兰氏阴性菌耐药基因进行测序；
所述革兰氏阴性菌耐药基因为如下42种耐药基因：aac6-Ib、aadA1、blaCTX-M-9、blaKPC-1、blaSHV-1、blaTEM-1A、cmlA1、cmx、floR、fosB、gyrA、mcr-3、mcr-5、mdtE、oqxA、RE-cmeA、strB、sul1、sul2、tetA、tetQ、tetX、tet(X4)、aadA2、aph2-Id、blaCTX-M-1、blaOXA-58、catA1、cmr、dfrA1、fosA3、mcr-1、mcr-8、oqxB、qepA、rmtB2、strA、tetBP、tetG、tetW、tetX3和tolC基因。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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