CN108060245A - 基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组。所述引物组为用于特异性扩增肠道微生物16S rDNA V4区的上游引物及下游引物。本发明涉及一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物的PCR多重扩增反应液。本发明还涉及一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的方法。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有一步扩增完成文库构建优势、灵敏性高、特异性好、通量高、检测时间快速的优点。

Description

基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，特别的，涉及一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，成人肠道内的微生物数量高达10 14，接近人体体细胞数量的10倍；质量达到1.2kg，接近人体肝脏的质量；其包含的基因数目约是人体自身的100倍，具有人体自身不具备的代谢功能。作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物本身及其代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用。研究发现，肠道菌群与肥胖、糖尿病、心脑血管疾病、炎症性肠炎、胃肠道癌症和自身免疫性疾病等具有一定的相关性。
在健康人体的胃肠道细菌中，拟杆菌门和厚壁菌门多于90％，包括拟杆菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属、梭状芽孢杆菌、柔嫩梭菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属和乳杆菌属等。其他丰度较少的门类有放线菌门(双歧杆菌属和产气柯林斯菌属)、变形菌门(肠杆菌科细菌、幽门螺杆菌、华徳萨特菌)、疣微菌门和产甲烷古菌等。新一代高通量基因测序的快速发展，为研究人体肠道菌群的组成和结构提供了新的思路。
新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina的Hiseq、Miseq系列和Life公司的Ion Torren系列测序仪为代表，已广泛应用于各类生物学研究和医学检测。其中Miseq在微生物多样性分析、宏基因组测序、微生物组测序等方面已成为行业最准确且最易用的台式测序仪，此外，Miseq DX系统是首个经过FDA批准的体外诊断(IVD)测序平台。
目前，采用Illumina仪器进行16s宏基因组文库制备一般需要进行DNA制备、质检、V4区扩增、扩增产物纯化及质检、PCR导入测序接头、文库纯化及质检、上机前文库定量及pooling、文库变性、稀释上机等诸多步骤，需要花费4-5小时，在纯化和质检步骤多次涉及到开盖，文库易被污染，文库损失率高，整个流程成本较高。
因此，有必要提供一种新的基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法来克服上述缺陷。
发明内容
为了解决上述进行16s宏基因组文库制备时存在步骤繁琐、文库易被污染、文库损失率高、整个流程成本较高及时间较长的技术问题，本发明提供一种通过一步扩增完成文库构建、步骤简单、文库不易被污染、整个流程成本降低及时间缩短、准确性高及敏感性高且基于高通量二代测序法的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及其方法。
本发明提供了一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组，包括用于特异性扩增肠道微生物16S rDNA V4区的上游引物及下游引物，其中：
16S rDNA V4上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA(SEQ ID NO.1)，
16S rDNA V4下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCTCCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACGGGTATCTAATCCGGACTACHVGGGTKTCTAAT(SEQ ID NO.2)。
本发明提供了一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的试剂盒，包括含有上述的上游引物及下游引物的PCR多重扩增反应液，所述PCR多重扩增反应液包括：AmpliSeqHiFi Mix、上述的上游引物及下游引物等比混合组成的AmpliSeq Primer Pool及无核酸酶水。
在本发明提供的所述基于高通量测序的肠道微生物基因检测的试剂盒一较佳实施例中，所述PCR多重扩增反应液的终成分为：2×AmpliSeq HiFi Mix 10μl、AmpliSeqPrimer Pool 2μl、目标基因组DNA 40ng-70ng、其余无核酸酶水补足至20μl；其中AmpliSeqPrimer Pool为所述上游引物及下游引物按摩尔比1:1混合组成。
本发明还提供了一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的方法，包括如下步骤：
步骤一：取待检测粪便样本抽提的DNA，作为PCR的模板；
步骤二：提供上述的试剂盒，对所述模板进行PCR多重扩增，并在扩增产物两端接上合适的接头，完成16S rDNA V4区测序文库构建；
步骤三：对所述测序文库进行质检，进而对样本的肠道微生物16S rDNA V4区进行高通量测序分析，根据测序的结果进行肠道菌群多样性、种类、有益菌及有害菌的分析。
在本发明提供的所述基于高通量测序的肠道微生物基因检测的方法一较佳实施例中，所述步骤二中PCR多重扩增反应程序为：99℃2min；25cycles，99℃15sec，60℃4min。
相较于现有技术，本发明提供的基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：
一、通过设计特异性高的引物组，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再设计出科学合理的多重PCR反应体系，使得本发明具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，实现对肠道微生物16S rDNA V4区的快速及准确测量。
二、通过设计用于特异性高的引物组，通过将接头序列、测序引物序列、Barcode、目标片段扩增引物序列这四种序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物能够通过一步扩增完成文库构建，不仅提高了甲基化测序文库质量和建库的效率，而且构建所得的测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列及测序引物序列，使得测序文库具有常规测序所用的测序试剂和引物进行测序。本发明相同的样本具有相同的barcode，不同的样本具有不同的barcode。一次可以对多个样本多个基因进行测序分析，相比一代测序提高了测序的速度。
附图说明
图1为16S rDNA V4区测序文库结构示意图；
图2为肠道微生物菌群种属分类结果构成示意图；
图3为拟杆菌门与厚壁菌门比例及对应饮食摄入示意图；
图4为肠道微生物菌群中有害菌检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：试剂盒的制备
一、用于特异性扩增16S rDNA V4区的引物组设计与合成
本发明的特异性PCR引物组，是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的微生物16S rDNA V4区序列，使用Primer Premier3.0设计与合成。
特异性引物组序列，如下表所示：
备注：其中Barcode序列为下划线部分且非唯一，不同的样本具有不同的Barcode。
通过将接头序列、测序引物序列、Barcode、目标片段扩增引物序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物能够通过一步扩增完成文库构建，不仅提高了甲基化测序文库质量和建库的效率，而且构建所得的测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列及测序引物序列，使得测序文库具有常规测序所用的测序试剂和引物进行测序。
二、PCR反应液组成
包括含有上述特异性引物组的PCR多重扩增反应液，所述PCR多重扩增反应液包括：AmpliSeq HiFi Mix、上述的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2引物等比混合组成的AmpliSeqPrimer Pool及无核酸酶水；
所述PCR多重扩增反应液的终成分为：2×AmpliSeq HiFi Mix 10μl、AmpliSeqPrimer Pool 2μl、目标基因组DNA 40ng-70ng、其余无核酸酶水补足至20μl；其中AmpliSeqPrimer Pool为将引物干粉溶解成100uM，将SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示两条引物按摩尔比1:1混合组成。
其中，所述AmpliSeq HiFi Mix、AmpliSeq Primer购自Thermo Fisher公司；高通量测序相关的接头、Barcode、测序试剂均购自Illumina公司；所述无核酸酶水为(Nuclease-Free Water)用DEPC(Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水。
实施例2：利用上述试剂盒进行肠道微生物基因检测的方法
一、检测方法
步骤一：取待检测粪便样本抽提的DNA，作为PCR的模板；
其中，DNA提取试剂盒为金麦格生物公司的粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)。采用的样本材料均来自0-3岁的婴幼儿粪便。
步骤二：提供上述的试剂盒，对所述模板进行PCR多重扩增，并在扩增产物两端接上合适的接头，完成16S rDNA V4区测序文库构建；
其中，PCR多重扩增反应程序为：99℃2min；25cycles，99℃15sec，60℃4min。
步骤三：对所述测序文库进行质检，进而对样本的肠道微生物16S rDNA V4区进行高通量测序分析，根据测序的结果进行肠道菌群多样性、种类、有益菌及有害菌的分析。
具体检测方法，如下：
一)提取细菌基因组DNA：
提取样本细菌基因组DNA所用的试剂成分均来自金麦格生物公司的粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)，具体操作请参照说明书。
二)目标区域富集流程
1、使用的PCR仪器为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(购自Life Tech(applied biosystems公司)，反应体系为20μl；
2、PCR反应体系配制及条件，如下表所示：
PCR反应体系：
成分 反应体积
2×AmpliSeq HiFi Mix 10ul
AmpliSeq Primer Pool 2ul
目标基因组DNA(20ng/ul) 总含量40ng-70ng
无核酸酶水 补足余量
总量 20ul
3、上机检测，按照各荧光PCR仪说明书进行操作，设置PCR程序，PCR程序如下：
PCR反应程序：
三)Illumina配套试剂进行高通量测序和生物信息分析
在得到测序文库后，对文库进行质检。检测所构建文库的片段大小是否合适，并根据浓度决定上机使用的量。本发明构建的文库可以利用Illumina Miseq配套试剂进行高通量测序。
试剂盒检测结果满足质控要求，根据检测结果对样本进行判断。Q30>80％或测序深度小于30000reads/样本，则样本不足或有抑制物存在PCR反应无效或失败，需重复实验或采样。
四)肠道微生物检测结果示例
肠道微生物菌群多样性统计结果：
样本号码 样本编号ID 菌群多样性差异值 确认的菌种数值
1 Sample-A101 3.046 314
2 Sample-A102 4.703 388
3 Sample-A103 2.845 304
肠道微生物菌群种属分类构成统计结果：
对于有助于理解本发明的示意图，请参阅图1-图3。其中图1为16S rDNA V4区测序文库结构示意图，图2为肠道微生物菌群种属分类结果构成示意图，图3为拟杆菌们与厚壁菌门比例及对应饮食摄入示意图，图4为肠道微生物菌群中有害菌检测结果示意图。
本发明提供的基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：
一、通过设计特异性高的引物组，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再设计出科学合理的多重PCR反应体系，使得本发明具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，实现对肠道微生物16S rDNA V4区的快速及准确测量。
二、通过设计用于特异性高的引物组，通过将接头序列、测序引物序列、Barcode、目标片段扩增引物序列这四种序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物能够通过一步扩增完成文库构建，不仅提高了甲基化测序文库质量和建库的效率，而且构建所得的测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列及测序引物序列，使得测序文库具有常规测序所用的测序试剂和引物进行测序。本发明相同的样本具有相同的barcode，不同的样本具有不同的barcode。一次可以对多个样本多个基因进行测序分析，相比一代测序提高了测序的速度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 韩林志
<120> 基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组、试剂盒及方法
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag gtgccagcmg ccgcggtaa 89
<210> 2
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agataggctc cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacaggact acgggtatct aatccggact achvgggtkt ctaat 105

Claims (5)

1.一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的引物组，其特征在于，包括用于特异性扩增肠道微生物16S rDNA V4区的上游引物及下游引物，其中：
16S rDNA V4上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA，
16S rDNA V4下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCTCCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACGGGTATCTAATCCGGACTACHVGGGTKTCTAAT。
2.一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的上游引物及下游引物的PCR多重扩增反应液，所述PCR多重扩增反应液包括：AmpliSeq HiFi Mix、如权利要求1所述的上游引物及下游引物等比混合组成的AmpliSeqPrimer Pool及无核酸酶水。
3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的肠道微生物基因检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR多重扩增反应液的终成分为：2×AmpliSeq HiFi Mix 10μl、AmpliSeq PrimerPool 2μl、目标基因组DNA 40ng-70ng、其余无核酸酶水补足至20μl；其中AmpliSeq PrimerPool为所述上游引物及下游引物按摩尔比1:1混合组成。
4.一种基于高通量测序的肠道微生物基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取待检测粪便样本抽提的DNA，作为PCR的模板；
步骤二：提供如权利要求3所述的试剂盒，对所述模板进行PCR多重扩增，并在扩增产物两端接上合适的接头，完成16S rDNA V4区测序文库构建；
步骤三：对所述测序文库进行质检，进而对样本的肠道微生物16S rDNA V4区进行高通量测序分析，根据测序的结果进行肠道菌群多样性、种类、有益菌及有害菌的分析。
5.根据权利要求4所述的基于高通量测序的肠道微生物基因检测的方法，其特征在于，所述步骤二中PCR多重扩增反应程序为：99℃2min；25cycles，99℃15sec，60℃4min。
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