CN110468240A - 从生物样品中快速获取多种生物信息的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,包括以下步骤:(1)从生物样品提取总DNA,使用总DNA作为模板,利用引物组扩增得到含有扩增产物的核酸混合物;(2)对核酸混合物进行处理以使至少扩增产物上添加测序标签,得到处理后的核酸混合物;和(3)采用纳米孔技术对处理后的核酸混合物进行测序,获得测序结果。本发明的方法可以更加经济、方便、准确和广谱性地获取微生物的信息,实现对宿主内微生物生态群体在不同门、纲、目、科、属和种的聚类和动态分析。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域,具体地涉及从生物样品中快速获取多种生物信息的方法。
背景技术
微生物生态群体是指机体内的微生物群体组成的结构和比例。这些信息与机体的状况有着密切的关系。虽然如此,但是由于机体与微生物群体之间关系的复杂性,目前仍不能根据由多种微生物组成的群体信息来对机体的状况进行预测或判断。
在宫颈中存在众多的微生物,包括定居状态存在的多种细菌以及潜在的人乳头瘤病毒等微生物。已知宫颈微环境中微生物群落及其菌群随着宫颈状况的变化而改变。因此,研究微生物群落及其菌群所体现的信息可能会有助于理解与其疾病的关系。目前,微生物生态群体与宫颈状态的关系研究受到越来越多的关注。
实验室研究一般通过采集宫颈口分泌物选择常规细菌诊断试剂盒、革兰氏染色、镜检或细菌显色培养基进行相关细菌的鉴定。也有相关研究通过采集受试者的阴道分泌物,提取其中细菌基因组DNA,对细菌基因组16S rRNA的V3或V4可变区基因片段进行扩增,并采用例如Illumina测序平台对扩增的PCR产物进行测序后对微生物群落进行表征,例如文献[Dareng E O,B.M A,Famooto A O,et al.Prevalent high-risk HPV infection andvaginal microbiota in Nigerian women[J].Epidemiology and Infection,2016,144(1):123-137]。研究结果表明,高危人乳头瘤病毒(hrHPV)与阴道微生物种群的变化存在相关性,越来越多的研究也发现,宫颈癌病人及早期癌前病变的病人阴道的微生物菌群结构有明显变化。但是这种相关性的具体情况仍不清楚,仍需要进一步的深入研究。
到目前为止,HPV DNA检测及分型有大量的不同方法,但相应实验操作时间均较长,一般均需要1-2天时间才能得到结果,而且对仪器的依赖较高。基于对HPV的基础研究、有效的筛查和相关疫苗的研制,HPV的发病率持续降低,但是,在临床应用中针对HPV更加经济、方便、准确和广谱性的微生物检测,实现对HPV相关微生物不同门、纲、目、科、属和种的聚类和动态分析仍是需要解决的问题。目前,还未有适用于临床的方法可以同时对包括HPV病毒和细菌的种类进行鉴定的报道。
发明内容
基于现有技术中存在的问题,本发明通过结合多重PCR和三代测序技术将HPV DNA和微生物菌群16s rDNA进行扩增后测序,通过数据分析,可以在最短20分钟内获得HPV感染及重要优势细菌在样本中的存在状况信息,从而构建了能够快速获取宿主来源的生物样品中的微生物群体信息。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的一方面,提供一种从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其包括以下步骤:
(1)从生物样品提取总DNA,使用所述总DNA作为模板,利用引物组扩增得到含有扩增产物的核酸混合物,其中所述引物组包括第一引物对和第二引物对,其中第一引物对为针对多种细菌的通用引物对,第二引物对为针对HPV基因的引物对,所述第一引物对的扩增产物的长度为1500-2000bp,所述第二引物对的扩增产物的长度为500bp-800bp;
(2)对所述核酸混合物进行处理以使至少扩增产物上添加测序标签,得到处理后的核酸混合物;
(3)采用纳米孔技术对所述处理后的核酸混合物进行测序,获得测序结果;
(4)基于所述测序结果获取所述生物样品中的微生物生态群体信息。
在某些示例性的实施方案中,所述生物样品为脱落的宫颈上皮细胞。
在某些示例性的实施方案中,所述微生物生态群体信息包括HPV和细菌的菌群信息,其中所述菌群信息指细菌在种分类水平上的信息。
在某些示例性的实施方案中,所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,进一步包括基于所述测序结果获取微生物与宿主之间的关系的信息。
在某些示例性的实施方案中,所述多种细菌至少包括梭杆菌、乳酸杆菌、加德纳菌、沙眼衣原体、加氏乳杆菌、肠球菌、葡萄球菌、普世菌、拟杆菌、链球菌和消化链球菌等。
在某些示例性的实施方案中,所述第一引物对为针对细菌16S rRNA基因的引物对,特别是全长16S rRNA基因的引物对。
在某些示例性的实施方案中,所述第一引物对为SEQ ID No.1和2。其中SEQ IDNo.1序列为AGRGTTYGATYMTGGCTCAG,SEQ ID No.2的序列为GACGGGCGGTGWGTRCA,其中,R表示A或G;Y表示C或T;M表示A或C;W表示A或T。在某些示例性的实施方案中,所述第二引物对为针对HPV的E6-E7基因的引物对。
在某些示例性的实施方案中,所述第二引物对为SEQ ID No.3和4,其中SEQ IDNo.3的序列为HPV16 E6-E7-F:AGGACCCACAGGAGCGA CCCAGAAAGTTAC,SEQ ID No.4的序列为HPV16 E6-E7-R:CAGGTCT TCCAAAGTACGAATGTCTACG。本发明的另一方面,提供试剂在制备用于从生物样品中快速获取多种生物信息的诊断剂中的用途。其中所述试剂包括引物组,且所述引物组包括第一引物对和第二引物对,其中第一引物对为针对多种细菌的通用引物对,第二引物对为针对HPV基因的引物对,所述第一引物对的扩增产物的长度为1500-2000bp,所述第二引物对的扩增产物的长度为500bp-800bp。
在某些实施方案中,本发明的试剂是指引物组,此时试剂在制备用于从生物样品中快速获取多种生物信息的诊断剂中的用途可以理解为引物组在制备用于从生物样品中快速获取多种生物信息的诊断剂中的用途。
本发明采用多重PCR(特别是使用具有通用性的引物组)和三代测序技术对包括HPV和细菌的微生物菌群同时进行检测,建立了一套从实验方法建立到准确地进行微生物菌群分析的方法。通过数据分析,可以在最短20分钟内获得样品中HPV及重要优势细菌的存在状况信息,实现对HPV及其相关微生物更加快速、有效和广谱性的检测。本发明的方法能够对相关微生物在不同门、纲、目、科、属和种的聚类和动态分析,与传统二代测序相比准确性更高。
附图说明
图1本发明一种示例性实施例的多重PCR产物的凝胶电泳图。
图2本发明一种示例性实施例的纳米孔测序Q值分布图。
图3本发明一种示例性实施例的纳米孔测序长度分布图。
图4本发明的方法与传统二代测序方法在不同分类水平(从门到属)的分类比较图。其中图4a表示门级、图4b表示纲级、图4c表示目级、图4d表示科级和图4e表示属级。
图5基于不同数据库绘制的venu图。
图6通过LAST-NCBI方法对注释物种构建的系统发育树。
图7Sanger验证的HPV-LRP1B整合位点的PCR产物凝胶电泳图,其中B、C分别代表两个整合位点的PCR扩增产物。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
目前对HPV和微生物菌群的确定一般通过Sanger测序和二代测序的方法。已知16SrRNA基因内含有保守和可变区,一般使用该基因内的保守区片段来区分不同的细菌。二代测序读长短,尤其是对具有复杂微生物种群结构的HPV感染样品,检出可信度较低。现有技术中一般针对微生物基因组中V4或V3V4可变区,而V1和V9区域通常通过PCR进行扩增。因此可用于反映亲缘关系的位点数有限。本发明通过研究发现,采用特定的引物组的设计并结合纳米孔测序能够完成同时测序HPV的E6E7片段和全长16S rRNA,实现微生物生态群体的检测,并且具有更加经济、方便、准确和广谱性的特点。
本发明的方法一般包括以下步骤:(一)从生物样品提取总DNA,使用所述总DNA作为模板,利用引物组扩增得到含有扩增产物的核酸混合物;(二)对所述核酸混合物进行处理以使至少扩增产物上添加测序标签,得到处理后的核酸混合物;(三)采用纳米孔技术对所述处理后的核酸混合物进行测序,获得测序结果;和(四)基于所述测序结果获取所述生物样品中的微生物生态群体信息。下面详细说明各步骤。
步骤(一):
本发明的步骤(一)为从生物样品提取总DNA,使用所述总DNA作为模板,利用引物组扩增得到含有扩增产物的核酸混合物的步骤。其中生物样品是指宿主来源或受试者来源的生物样品,与微生物样品不同。本发明中,总DNA包括生物样品中存在全部生物体来源的DNA,其包括受试者来源的DNA、潜在的病毒来源的DNA和细菌来源的DNA等。本文中的核酸混合物为多种不同核酸的混合物,其中包括从生物样品直接提取得到的微生物基因组和受试者的基因组,还包括由微生物基因组作为模板扩增得到的扩增产物(有时称作扩增片段)。优选地,核酸混合物中含有相对高含量的扩增产物,例如,90%以上的核酸为扩增产物。
本发明的方法使用特定的引物组,其包括针第一引物对,其为针对多种细菌的通用引物。本发明收集了在宫颈中存在的多种细菌,并经过进一步分析发现可以设计针对这些细菌的通用引物。其中,本发明所述的多种细菌包括来自不同状态下受试者的细菌,包括来源于正常状态受试者的细菌,也包括来源于不同病况,例如宫颈癌受试者的细菌。细菌类型包括好氧类型的细菌,也包括厌氧类型的细菌。多种细菌的实例包括但不限于梭杆菌、乳酸杆菌、加德纳菌、沙眼衣原体、加氏乳杆菌、肠球菌、葡萄球菌、普世菌、拟杆菌、链球菌和消化链球菌等。
在示例性实施方案中,第一引物对的扩增产物的长度为1500-2000bp,优选地,1500bp-1700bp,更优选地,扩增产物的长度为1500bp。第一引物对的序列为SEQ ID No.1和2所示。本发明发现使用SEQ ID No.1和2作为第一引物对能够扩增不同状态受试者的宫颈中存在的多种细菌,特别是梭杆菌、乳酸杆菌、加德纳菌、沙眼衣原体、加氏乳杆菌、肠球菌、葡萄球菌、普世菌、拟杆菌、链球菌和消化链球菌等。第二引物对的扩增产物的长度为500bp-800bp,优选地,650bp-780bp,更优选地,扩增产物的长度为750bp。第二引物对的序列优选为SEQ ID No.3和4所示。
本发明的受试者一般为哺乳动物或人,优选为人。生物样本一般为宫颈相关的样本,包括宫颈脱落细胞,优选为宫颈上皮组织。
本发明的基因组总DNA提取方式可采用已知手段。这些手段可参考已知的教科书,例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。
步骤(二):
步骤(二)得到的核酸混合物进行处理以使至少扩增产物上添加测序标签,得到处理后的核酸混合物的步骤。需要说明的是,此处的核酸混合物是指包含扩增产物及来源于生物样品的DNA的混合物。此步骤包括在不对扩增后得到的扩增产物进行分离的情况下,直接对含扩增产物的核酸混合物连接天然条形码和接头,然后进行纳米孔测序。天然条形码和接头连接可以通过已知方法合成或购于已知商品,例如使用Barcode模块试剂盒,优选地,采用Oxford Nanopore Technology公司的产品型号为EXP-NBD103试剂盒中提供的天然条形码和产品型号为SQK-LSK108试剂盒进行接头连接,其天然条形码和接头为适配于本发明方法中纳米孔测序机器和后续的生物信息学流程分析。
步骤(三):
步骤(三)为采用纳米孔测序技术对所述处理后的核酸混合物进行测序,获得测序结果。需要说明的是,步骤(三)中的测序对象为处理后的核酸混合物,而非对核酸混合物进行纯化后得到的扩增产物。本发明的测序步骤依据已知方法进行。在示例性实施方案中,本发明的方法包括将制备好的核酸、测序运行缓冲液和上样颗粒(LLB)组合加载至纳米孔测序平台的SpotON样品端口中进行测序,在具体实施例中,纳米孔测序平台采用OxfordNanopore测序仪进行。
另外,通过将受试者提取到的基因组DNA用作模板扩增全长16S rRNA,可选地,采用提取到的gDNA作为模板。本发明的方法扩增得到的扩增产物不仅包括V4高变区还包括其他区域的信息。
步骤(四):
步骤(四)为基于测序结果获取生物样品中的微生物生态群体信息,包括细菌在种分类水平上的信息和可选地其与宿主之间的关系等信息。步骤(四)的获取过程包括生物信息分析流程,具体来说,信息分析流程包括对原始测序数据进行质控,除去噪音数据,得到待分析数据,质控流程不做特别限定。在示例性实施方案中,本发明的信息分析步骤为:按照Oxford Nanopore Technologies公司版本号为v.2.59.1896509的EPI2ME agentBarcoding分析流程进行质控,质控结果以过滤后的1D reads数(Qscore≥7)评价测序质量和长度分布;使用fastxtool将获得的数据文件格式转换为fasta文件;通过LAST将含有过滤后的1D reads的fasta比对到HPV基因组数据库上;获得non-HPV reads、HPV reads和HPV类型信息后过滤其reads长度小于1.2K且大于1.6K的non-HPV reads;使用QIIME在Greengenes数据库中以从门到属的水平90%的相似性并注释经过滤后得到的non-HPVreads;为了比较并获得更好的物种注释结果,使用LAST aligner对Greengenes数据库的子集和NCBI数据库进行比对分析,并且基于来自NCBI数据库的一些物种(reads≥5)的16SrRNA全长序列构建系统发育树,对三种不同分析方法重叠的10个属进行鉴定;使用MEGA X(https://www.megasoftware.net)可视化构建系统发育树。
在示例性的实施方案中,Illumina和纳米孔测序数据的比较采用R统计软件包版本v.3.6.0(https://www.r-project.org)比较测序数据,并使用vegan包进行Spearman相关性测试。使用R软件包中的ggplot2包生成Heatmaps和Venn图。
为了验证本发明的方法的可行性和可靠性,本发明采用Illumina测序作为二代测序的对比。二代测序的方法在本领域是已知的。本发明中,使用常规DNA文库试剂盒制备二代测序文库,获得测序结果后与纳米孔测序结果进行进一步的比较。这里构建文库步骤依据已知方法进行,在具体实施例中,采用NEB公司产品型号为E6609L的Multiplex Oligosfor Illumina试剂盒,构建的后的文库采用Illumina平台,如Illumina NextSeq MidOutput平台和具有NextSeq 500/550Mid Output v2试剂盒的快速运行模式对文库进行双末端测序。Illumina测序的分析步骤为:使用FastQC版本为v.0.11.8进行Illumina测序数据质控;使用FLASH-1.2.11(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)设置最小overlap为10对得到的reads进行快速拼接;采用QIIME对Qscore<Q20且读取长度<265bp进行过滤,通过使用QIIME中的pick_otus.py对过滤后得到的高质量raads进行聚类,使用UCLUST贪婪算法,相似性阈值为97%。
在示例性的实施方案中,本发明的方法还包括对HPV整合位点测序和分析。具体地,使用HPV探针富集整合的HPV序列,并对捕获的片段进行测序,从而获取HPV整合位点信息。在示例性实施方案中,本发明使用Integrated DNA Technology公司的HPV探针富集整合的HPV序列,并使用用于Illumina公司产品型号为E7370L的NEB Next UltraIITM DNA文库制备试剂盒和产品型号为E6609L的NEB Next Multiplex Oligos试剂盒构建Illumina测序文库,采用HPVDetector用于整合位点分析。
在优选实施方案中,本发明进一步包括对获取的整合位点信息进行验证的步骤。例如,使用Sanger测序进行整合位点的验证。在示例性实施方案中,采用Primer Premier5.0设计引物,其具有两个高检测频率的融合位点,其靶向产生200-300bp的扩增子片段大小。基于HPV序列设计正向引物,并基于人类基因组序列设计反向引物。
在不影响本发明的目的的情况下,本发明的方法除了上述步骤之外,还可包括其他步骤。这些步骤在本领域内是已知的。
本发明通过多重PCR和三代测序技术,将HPV DNA和微生物菌群16s rDNA进行扩增后测序,通过数据分析,可以在最短20分钟内获得HPV感染及重要优势细菌在样本中的存在状况信息,能够有效的应用于临床第HPV及其微生物菌群的检测。
实施例
本实施例用于示例性说明本发明方法。
一、样本信息
选择受试者脱落的宫颈上皮细胞样品,并使用ThinPrep液基细胞学检测(TCT)诊断为上皮内病变或恶性肿瘤(NILM)阴性,通过使用荧光HPV基因分型试剂盒(BioperfectusTechnologies,Jiangsu,China)测定样品为HPV16阳性。
二、实验步骤
1、基因组DNA提取
使用TIANamp Micro DNA Kit(Tiangen,Beijing)从脱落的宫颈上皮细胞中提取基因组DNA(gDNA)。最初收集样品并储存在4℃的1.5ml灭菌管中。然后,将细胞沉淀物以5000rpm离心5分钟,并提取DNA。通过Qubit dsDNA HS Assay Kit和Nanodrop 2000(ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)定量双链DNA浓度。
2、二代测序:扩增16S V4和Illumina测序文库构建
2.1将分离的gDNA用作模板以扩增16S rRNA基因的V4高变区。PCR以20μL的总体积进行,其中含有10μL的KAPAHiFi HotStart Ready Mix(KAPA Biosystems,Wilmington,MA,USA)、0.5μL各引物(10nM)和20ng DNA。扩增条件如下:94℃,3min、94℃,30s,5个循环、45℃,20s、65℃,30s、94℃,30s,10个循环、50℃,30s、72℃,30s、94℃,30s,15个循环、55℃,30s、72℃,30s和72℃,5min。
2.2使用1.6×的Agencourt AMPure XP珠(BeckmanCoulter Genomics,Brea,CA,USA)纯化扩增的PCR产物,然后使用2%琼脂糖凝胶电泳验证。使用NEB Next UltraIITMDNA文库制备试剂盒(E7370L;New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)和NEB NextMultiplex Oligos for Illumina(E6609L),将纯化的DNA用于构建Illumina文库。
2.3使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和Qubit3.0荧光计(Invitrogen)定量文库,并通过Agilent 2100TapeStation(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)鉴定。根据标准Illumina测序操作流程,使用Illumina NextSeq MidOutput平台和具有NextSeq 500/550Mid Output v2试剂盒(300个循环)的快速运行模式对文库进行双端末端(2×150bp)测序。
3、本发明的方法:HPV和16S rRNA扩增
使用gDNA作为模板,通过特异性引物SEQ ID No.1和2扩增全长16S基因,序列分别为:SEQ ID No.1:AGRGTTYGATYMTGGCTCAG和SEQ ID No.2:GACGGGCGGTGWGTRCA,使用HPV16E6-E7扩增HPV16基因组,引物对为SEQ ID No.3和4,序列分别为:SEQ ID No.3:HPV16 E6-E7-F:AGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTAC和SEQ ID No.4:HPV16E6-E7-R:CAGGTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACG。PCR反应在25μL的总体积中进行,含有12.5μL2×GC缓冲液I(TaKaRa,Shiga,Japan)、2μLdNTPs(2.5μM)、各0.5μL正向和反向引物(10μM)、0.5μL含GC缓冲液(TaKaR a;125U)、2μL模板DNA(20ng)和1.0μL无核酸酶水(不含DEPC处理)。扩增条件如下:94℃,4min、94℃,30s,30、50℃,40s、72℃,90s、72℃,15min。通过凝胶电泳验证PCR产物,并用AMPure XP珠(Beckman Coulter,Miami,FL,USA)清洗。使用Qubit3.0荧光计(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)定量,并使用1000ng扩增产物构建文库。
4、扩增子DNA文库制备和ONT测序
使用具有天然条形码扩增(EXP-NBD103,ONT)的连接测序试剂盒(SQK-LSK108,Oxford Nanopore Technologies)制备扩增子文库。将制备的文库与35μL测序运行缓冲液(RBF)、25.5μL上样颗粒(LLB,ONT)和12μLDNA文库混合,并加载到纳米孔测序平台的SpotON样品端口中用于测序过程。
5、使用Sanger测序进行整合位点验证
使用Primer Premier 5.0设计引物,其具有两个具有高检测率的融合位点,其靶向产生200-300bp的扩增子片段大小。基于HPV序列设计正向引物,并基于人类基因组序列设计反向引物。反应体系总体积20μL,包括:0.2μL的PhoenixTMHot Start Taq DNAPolymerase(500U)、4μL的5×Phoenix Hot Start Taq反应缓冲液、2μL的dNTP(2.5μM)、各0.5μL正向和反向引物(10μM)的PCR反应混合物中扩增序列、1μL模板DNA(10ng)和12.3μL无核酸酶水(未经DEPC处理)。PCR扩增条件如下:95℃,5min、94℃,30s,35个循环、60℃,60s、72℃,60s和72℃,1min。通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物,并使用AMPure XP珠(BeckmanCoulter,Miami,FL,USA)进行纯化。
三、数据分析
6.1纳米孔测序数据分析
使用EPI2ME界面(v.2.59.1896509)调用纳米孔测序结果。通过过滤后的1D reads数(Qscore≥7)用于评价测序质量和长度分布。使用fastxtool将获得的fastq文件转换为fasta文件。通过LAST将含有过滤后的1D reads的fasta比对到HPV基因组数据库上。获得non-HPV reads、HPV reads和HPV类型信息后过滤其reads长度小于1.2K且大于1.6K的non-HPV reads。使用QIIME在Greengenes数据库中以从门到属的水平90%的相似性并注释经过滤后得到的non-HPV reads。为了比较并获得更好的物种注释结果,使用LAST aligner对Greengenes数据库的子集和NCBI数据库进行比对分析,并且基于来自NCBI数据库的一些物种(reads≥5)的16S rRNA全长序列构建系统发育树,对三种不同分析方法重叠的10个属进行鉴定,使用MEGA X可视化构建系统发育树。
6.2Illumina测序数据分析
使用FastQC版本为v.0.11.8进行Illumina测序数据质控;使用FLASH-1.2.11(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)设置最小overlap为10对得到的reads进行快速拼接;采用QIIME对Qscore<Q20且读取长度<265bp进行过滤,通过使用QIIME中的pick_otus.py对过滤后得到的高质量raads进行聚类,使用UCLUST贪婪算法,相似性阈值为97%。
6.3 Illumina和Nanopore测序数据的比较
使用R统计软件包版本v.3.6.0(https://www.r-project.org)比较测序数据,并使用vegan包进行Spearman相关性测试,使用R软件包中的ggplot2包生成Heatmaps和Venn图。
6.4 HPV整合位点测序和分析
通过使用HPV探针(Integrated DNA Technology,IDT)富集整合的HPV序列,并使用用于Illumina公司产品型号为E7370L的NEB Next UltraIITM DNA文库制备试剂盒和产品型号为E6609L的NEB Next Multiplex Oligos试剂盒构建Illumina测序文库,使用HPVDetector用于整合位点分析。
四、实验结果
7.1纳米孔测序多重HPV E6E7和全长16S rRNA PCR产物
如图1所示,根据本发明的方法获得的全长16S rRNA和HPV16 E6E7扩增子分别为750bp和1,500bp(16SrRNA)的片段。构建纳米孔测序文库后,使用Nanopore测序仪测序,为了获得高质量的reads,使用Metrichore 1D过滤原始数据,提高平均质量分数和总读数准确度。如图2和表1所示,结果显示过滤后获得总共145605个reads,质量分数从7到17,平均值为12.65。如图3所示。读取长度范围为88至15068bp,平均读取长度为854bp。
表1-二代测序和本发明测序数据结果
7.2基于纳米孔测序的HPV感染和微生物组分析结果
通过对测序结果进行,使用LAST(http://lastweb.cbrc.jp)评估了HPV基因组和NCBI 16S核糖体RNA(细菌和古细菌)数据库,遵循质量分数Q≥7过滤。结果显示匹配到HPV16基因组的reads数为71276个,占1D reads数的48.9%,如表-2所示,表明该样品具有较高的扩增效率和高病毒载量。
为了更准确地分析微生物组数据,使用QIIME在从门到属的所有分类水平上分配分类标注。如图4所示,在门的水平(图4a),确定了4个门,包括厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门,其中厚壁菌门最丰富,为98.9%。进一步,在纲的水平(图4b)确定7个纲,包括芽孢杆菌纲、梭菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲,芽孢杆菌纲是最丰富的,为96.6%。此外,鉴定了8个目(图4c)和15个科(图4d),其中乳杆菌科和肠球菌科分别是最丰富的。在属的水平共鉴定出21属(图4e),其中肠球菌属最丰富,为94.1%。还检测了与细菌性阴道病(BV)相关的细菌,并鉴定了六个属,包括拟杆菌属、普氏菌属、肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属和消化链球菌属。
表-2基于纳米孔测序LAST比对结果
7.3基于二代测序和本发明方法16S全长结果的分类标注比较
为了评估纳米孔测序结果的准确性,通过PCR扩增相同样品的16S rRNA V4区域并使用Illumina二代测序仪测序。如表1所示,当使用Illumina测序平台时,总共获得1453612个Raw reads,共1453363个clean reads,共217.3Mb,在过滤后共有1284004个(88.35%)reads数。测序质量范围为19至35,平均为32。保留了大约4%(27123)的测序reads用于进一步的微生物群落分析。
如表3和表4所示,通过比较Illumina和纳米孔测序在门、纲、目、科和属级别上的对比,两个测序平台均能鉴定出4门、7纲、10目、15科和20属,且两个平台都鉴定出p_Firmicutes、c_Bacilli、o_Lactobacillales、f_Enterococcaceae和g_Enterococcus优势菌群,Illumina和本发明方法的菌群相对丰度结果分别为85%和94%,本发明的方法鉴定出一个较为独特属漫游球菌属(Vagococcus),为0.035%,基于Illumina测序平台和本发明的方法,在微生物种群分类中有80%的且占前10位的优势菌群重叠被检出,但是针对高丰度分类单元结果,Illumina显示在门的水平上,占前5位的优势菌群中没有检测出独特的菌门,在纲的水平上,占前10位的优势菌群中仅检测出3个独特菌纲,在目的水平上,占前10位的优势菌群中仅检测出2个独特菌目,在属和科的水平上,占前15和20位的优势菌群中均没有检测出独特菌属和菌科。这些结果表明,使用基于二代测序方法鉴定的大多数独特分类单元的菌群丰度较低。
表-3基于二代测序和本发明方法16S全长结果的分类标注比较
表-4基于二代测序和本发明方法使用QIIME分类分析结果比较
7.4使用不同分析方法和数据库时的物种注释结果比较
使用QIIME和LAST,基于GreenGenes数据库在物种水平上进一步对Nanopore测序结果进行注释,并将该方法命名为QIIME_GreenGenes和LAST_GreenGenes。如图5所示,其中QIIME_GreenGenes方法显示注释23个属的3个种,而LAST_GreenGenes方法鉴定了53个属,注释19个种,由于大多数属没有特定的物种注释,因此利用LAST_NCBI数据库可以得到更好的注释结果。通过使用该方法,所有127个属(reads≥2)都可以用至少一种特定物种注释,如表5所示,得到共197种特定物种,包括属于10个重叠属的70个种。当比较所有分析方法时,只有肠球菌属和葡萄球菌属这两个属在所有三种方法中都有物种注释,当使用LAST_NCBI方法时,10个重叠属中的7个种被鉴定注释,尤其是肠球菌,在33个特定种中超过90%被鉴定出,33个特定种具体见表6所示。
表5-应用不同分析方法对10个重叠属对物种的鉴定结果
表6-应用不同分析方法33个特定种的结果
使用LAST_NCBI方法注释这些细菌菌株(reads≥5)并用于构建系统发育树,如图6所示。系统发育树显示菌株分为五个独立的组,在单独的外部分支中具有放线菌(Actinomyces turicensis)。肠球菌属是最丰富的属,有27种不同的物种(reads≥5)。第二组和第三组包括葡萄球菌属(6个种)和苍白杆菌属(2个种,reads≥5)。第四组包括厌氧球菌属(n=3)、芬戈尔德菌属(n=1)、毛螺旋菌属(n=1)和嗜胨菌属(n=4)菌株。第五组包括卟啉单胞菌属(n=3)和普氏菌属(n=2)两个属。
7.5基于本发明的方法的临床样本病原体测出的最短时间结果
为了评估HPV16和微生物菌群的完全检测所需的最小测序时间,将总测序读数的不同百分比按5%、10%、15%、20%、25%和30%提取四次,并且将微生物种群与完整的测序结果进行比较,比较结果如表7所示,结果显示,当从总测序reads数中提取最少至4459个reads数时,纳米孔测序平台可以利用测序结果检测鉴定到位于丰度在前10的物种。统计和相关系数分析表明,在鉴定细菌种类方面,使用reads数子集或reads总数时没有显著差异。因此,基于本发明的纳米孔测序方法可以在15分钟内鉴定HPV和微生物物种。
表7-不同时间提取纳米孔测序数据结果
7.6HPV整合位点的检测和验证
通过探针捕获和Illumina测序进一步富集HPV整合序列并测序,采用HPVDetector分析整合位点,结果显示了检测出一系列的整合位点,其中HPV16 E1和L2(HPV16,NC_001526.4)在人类基因组(GRCh37/hg19)的2号染色体的LRP1B基因上显著富集。如表8所示,在LRP1B基因中,发现4个位点与HPV16 E1或L2整合,HPVDetector鉴定出至少10个位点。通过Sanger测序验证这些鉴定的高度整合位点,并LRP1B基因中两个独特的HPV16整合位点进行验证,验证结果如图7所示。
表8-经HPV鉴定的LRP1B整合位点(n>10)
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述,但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 元码基因科技(北京)股份有限公司
<120> 从生物样品中快速获取多种生物信息的方法
<130> 1
<141> 2019-09-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> r=a/g
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> y=c/t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> y=c/t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> y=a/c
<400> 1
agrgttygat ymtggctcag 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> w=a/t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> r=a/g
<400> 2
gacgggcggt gwgtrca 17
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggacccaca ggagcgaccc agaaagttac 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtcttcc aaagtacgaa tgtctacg 28
Claims (10)
1.一种从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)从生物样品提取总DNA,使用所述总DNA作为模板,利用引物组扩增得到含有扩增产物的核酸混合物,其中所述引物组包括第一引物对和第二引物对,第一引物对为针对多种细菌的通用引物对,第二引物对为针对HPV基因的引物对,所述第一引物对的扩增产物的长度为1500-2000bp,所述第二引物对的扩增产物的长度为500bp-800bp;
(2)对所述核酸混合物进行处理以使至少扩增产物上添加测序标签,得到处理后的核酸混合物;
(3)采用纳米孔技术对所述处理后的核酸混合物进行测序,获得测序结果;
(4)基于所述测序结果获取所述生物样品中的微生物生态群体信息。
2.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述生物样品为脱落的宫颈上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述微生物生态群体信息包括HPV和细菌的菌群信息,其中所述菌群信息包括细菌在种分类水平上的信息。
4.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,基于所述测序结果进一步获取微生物与宿主之间的关系的信息。
5.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述多种细菌包括梭杆菌、乳酸杆菌、加德纳菌、沙眼衣原体、加氏乳杆菌、肠球菌、葡萄球菌、普世菌、拟杆菌、链球菌和消化链球菌。
6.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述第一引物对为针对细菌16S rRNA基因的引物对。
7.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述第一引物对为SEQ ID No.1和2。
8.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述第二引物对为针对HPV的E6-E7基因的引物对。
9.根据权利要求1所述的从生物样品中快速获取多种生物信息的方法,其特征在于,所述第二引物对为SEQ ID No.3和4。
10.试剂在制备用于从生物样品中快速获取多种生物信息的诊断剂中的用途,其中所述试剂包括引物组,且所述引物组包括第一引物对和第二引物对,其中第一引物对为针对多种细菌的通用引物对,第二引物对为针对HPV基因的引物对,所述第一引物对的扩增产物的长度为1500-2000bp,所述第二引物对的扩增产物的长度为500bp-800bp。
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