CN109913525B - 丁酸弧菌属在鉴别和/或区分高原地区汉族人群和藏族人群中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微生物在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用，所述的微生物为丁酸弧菌属，所述不同民族为藏族和汉族，优选为高原地区的藏族和汉族。本发明还提供了一种鉴别和/或区分不同民族个体的方法，检测所述个体的粪便或肠道中微生物的相对丰度，将所述相对丰度与预定值进行比较，判断所述个体的民族。

Description

丁酸弧菌属在鉴别和/或区分高原地区汉族人群和藏族人群 中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种丁酸弧菌属在鉴别和/或区分高原地区汉族人群和藏族人群中的应用。

背景技术

人体肠道中存在大量的共生菌群，其数量超过1000万亿个，大约是人体细胞总数的 10 倍。同时肠道内微生物基因的数量约为 300 万个，大约是人类基因组基因数量的100 多倍，如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，形成与人体密不可分的共生关系。

丁酸弧（Butyrivibrio）菌属属细菌硬壁菌门，厌氧生长，最适生长温度为37℃，长期存在于人体肠道内，能够分离于哺乳动物的粪便。丁酸弧菌属发酵葡萄糖产生丁酸，丁酸进而合成短链脂肪酸，短链脂肪酸能够保护肠道上皮结构形态和功能稳定，还具有抑制炎症的功能。因此，丁酸弧菌属的存在能够提高肠道免疫力，广谱抗菌，抑制炎症反应，其在抗肿瘤方面也有作用，丁酸弧菌属在医疗方面有广泛的应用。例如，专利CN200580048371.6提供了包含具有产生丁酸能力的溶纤维丁酸弧菌细胞、其培养物或其提取物的新细菌细胞组合物、以及使用其抑制癌发生的方法、免疫刺激的方法、预防或治疗病原体的方法、预防或治疗炎性肠病的方法和预防或治疗变应性疾病的方法。

不同遗传背景和生活习惯的居民体内肠道菌群组成存在较大差异，例如拟杆菌属是西方居民肠道中相对含量最多且个体间差异最大的细菌属，韩国居民则是栖粪杆菌属。目前我国不同民族人群体内的肠道菌群结构差异对比的研究数据尚不足。青藏高原地区平均海拔3000米以上，高原地区的藏族居民是全球主要的高海拔人群，他们对高原地区的低氧、低气压环境进行了长期的生理和遗传适应，低氧环境下肺血管收缩反应性降低，具备更好的运动能力。研究表明，丁酸弧菌属代谢产生的丁酸具有抑制心脏和血管负性重构的作用，可防治肺动脉高压造成的动脉血管扩张，以及右心室肥厚甚至扩大等结构变化，对防治高原心脏病有积极作用。

本发明人通过创造性劳动，第一次发现，高原地区居民粪便中丁酸弧菌属的相对丰度在不同民族人群中具有差异。

发明内容

本发明提供了一种微生物在鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体中的应用，所述的微生物为丁酸弧菌属（Butyrivibrio），所述丁酸弧菌属包括溶纤维丁酸弧菌种、瘤胃假丁酸弧菌。

本发明还提供了一种鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的方法。

本发明还提供了一种检测微生物相对丰度的产品在鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体中的应用。

本发明还提供了一种用于鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的产品。

本发明提供的一种微生物在鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体中的应用利用的方法为本发明提供的一种鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的方法。

所述个体为长期生活在高原地区的个体，所述高原地区为高原环境，优选的，所述高原环境为海拔2000m以上、2500以上或4500m以上，具有低压、缺氧的条件。

优选的，所述长期为大于或等于3个月。

本发明提供的一种鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的方法，所述方法检测所述个体的粪便或肠道中微生物的相对丰度，将所述相对丰度与预定值进行比较，所述微生物为丁酸弧菌属。

优选的，所述方法包括：

1）收集待检测个体的粪便或肠道中微生物的DNA；

2）DNA目的片段的扩增；

3）测序；

4）计算微生物的相对丰度；

5）微生物的相对丰度与预定值进行比较。

所述预定值为本发明进行的大量实验研究后得出的合理数值，所述实验研究是选取了大量的实验个体，并按照所述方法的步骤1）-4）和绘制ROC曲线（receiver operatingcharacteristic curve）后，评估丁酸弧菌属的相对丰度对区别高原地区汉族人群和藏族人群的敏感性和特异性，计算界值，规定P＜0.05为差异有统计学意义，在可得到最大的约登指数＞0.95时，选取的丁酸弧菌属的相对丰度数值为预定值。所述预定值为2.65×10^-5。

所述步骤1）中包括DNA提取，所述DNA提取包括以下步骤：

1）样品细胞加热裂解；

2）去除蛋白质和RNA；

3）离心与洗涤；

4）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

所述DNA提取的步骤1）中加入溶菌酶，加热温度为50-70℃，优选的，加热温度为65℃。

所述DNA提取的步骤2）中加入酚、氯仿和异戊醇，使样品中的蛋白质溶解。

所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为1-30：1-30：1，优选的，所述体积比为20-30:20-30:1，更优选的，所述体积比为25:24:1。

所述DNA提取的步骤3）中加入乙醇和蒸馏水，洗涤去除杂质。

所述步骤2）中的目的片段的扩增为使用特异引物和高效高保真酶（TransFast®Taq DNA Polymerase）进行PCR扩增，所述特异引物为带 Barcode的16SrDNA-V4特异引物515F和806R。

本发明提供的一种检测微生物相对丰度的产品在鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体中的应用，所述微生物为丁酸弧菌属，所述应用利用的方法为本发明提供的一种鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的方法。

本发明提供的一种用于鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的产品，所述产品为检测微生物的相对丰度的产品，所述产品利用的方法为本发明提供的一种鉴别和/或区分高原地区的藏族和汉族个体的方法。

所述产品选自探针组、引物组、试剂盒或基因芯片，优选的，所述产品为试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测微生物相对丰度的试剂或装置，所述微生物为丁酸弧菌属。

所述试剂盒中包括检测微生物的引物组，在本发明的一个具体实施方式中，所述的引物组包括带Barcode 的16SrDNA-V4区特异引物515F和806R。

本发明所述试剂盒还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。更优选的，所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、NaOH溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液和/或TE缓冲液。

本发明所述的515F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

本发明所述的806R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：高原地区汉族人群和藏族人群的粪便标本中丁酸弧菌属的相对丰度。

图2：ROC曲线显示丁酸弧菌属的相对丰度区别高原地区人群汉藏来源的敏感性和特异性，图中ROC曲线下的面积（AUC）为0.975，准确度为0.968，特异度为0.989，敏感度为0.947，F1分数为0.968。

图3：为藏族士兵组（Zang）粪便中群落组成。

图4：汉族士兵（Han）组粪便中群落组成。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 鉴别和/或区分高原地区汉族人群和藏族人群的方法

1、材料与方法：

1.1实验设计

根据STROBE声明设计对照研究实验，选择在中国某部队服役128个习服海拔3500米高原以上的藏族男性士兵组成实验组，根据实验组藏族士兵的年龄，匹配选择128个平原汉族士兵组成对照组。严格控制实验组和对照组的士兵进行相同的中国部队饮食，同时保持海拔3500米相同的训练环境和训练强度，持续3个月戒烟、戒酒，实验排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病的士兵，避免影响实验结果。

1.2 粪便收集

每一个研究对象在实验开始前均收到一个马桶粪便收集器。每一个研究对象排出大便后将大便装入粪便收集管，立刻保存在-20℃的冰箱中，次日将粪便标本转运至-80℃的冰箱中保存，统一进行检测。

1.3 丁酸弧菌属的DNA提取

吸取1000ul CTAB裂解液移至2.0ml EP管中，并加入溶菌酶，再加入500ul左右的样品，EP管浸入65℃水浴中，期间颠倒混匀数次，使样品充分裂解。裂解后，离心并取上层清液，按照25：24：1的体积比，在上层清液中加入酚 （Ph为8.0）、氯仿、异戊醇，震荡混合均匀。以转速12000rpm离心10min后，取上层清液，按照24:1的体积比，在上层清液中加入氯仿、异戊醇，震荡混合均匀。以转速12000rpm离心10min后，吸取上层清液至1.5mL的离心管中，加入异丙醇，震荡混合均匀，在-20℃下沉淀。以转速12000rpm离心10min后，倒出液体，注意不要倒出沉淀，用1ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后吸出。将超净工作台吹干或者室温晾干，加入双蒸水溶解DNA样品，加入1ul RNase A消化RNA，37℃放置15min。然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量DNA样本到离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。

1.4 PCR扩增、混样和纯化

以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域6S V3-V4，选择使用带 Barcode的特异引物：

515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2），

使用高效高保真酶（New England Biolabs 公司的 Phusion® High-FidelityPCR Master Mix with GC Buffer）进行PCR，确保扩增效率和准确性。

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE缓冲液浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒为Thermo Scientific 公司GeneJET 胶回收试剂盒。

1.5 文库构建和上机测序

使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。

1.6数据分析

1.6.1 测序数据处理

使用Cutadapt（V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先对reads进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列，初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads序列通过与物种注释数据库进行比对、检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

1.6.2 OTU聚类和物种注释

利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性，将序列聚类成为OTUs（OperationalTaxonomic Units），同时选取OTUs的代表性序列，依据算法原则，筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1），获得分类学信息并分别在属的水平统计汉族士兵组、藏族士兵组的群落组成（见图3、4）。

1.6.3 丁酸弧菌属的相对丰度计算和差异比较

丁酸弧菌属的相对丰度使用丁酸弧菌属OTU值/检测样本，检测到的所有菌属以OTU值表示，由于样本非正态分布采用Mann-Whitney检验进行差异比较。绘制ROC曲线，评估丁酸弧菌属的相对丰度对高原地区汉族人群和藏族人群的区别诊断敏感性和特异性，并计算界值，P＜0.05为差异有统计学意义，采用SPSS22.0软件包进行统计学处理。

实验结果

2.1高原地区汉族人群和藏族人群的粪便标本中丁酸弧菌属的相对丰度差异

如图1所示，高原地区汉族人群中丁酸弧菌属的相对丰度为2.30×10^-5（0，3.02×10^-4），高原地区藏族人群中丁酸弧菌属的相对丰度为1.51×10^-4（3.03×10^-4，5.03×10^-3），以上相对丰度表示形式为中位数（四分位数），藏族人群的丁酸弧菌属相对丰度显著高于汉族人群。

丁酸弧菌属的相对丰度用于区别高原地区人群汉藏来源的敏感性和特异性

如图2所示，ROC曲线显示丁酸弧菌属的相对丰度区别高原地区人群汉藏来源的AUC值为0.983，在丁酸弧菌属的相对丰度为2.65×10^-5时，可得到最大的约登指数为0.936。

上述实验结果表明，利用16SrRNA测序检测人类粪便标本丁酸弧菌属的相对丰度，可以区别高原地区人群的汉藏来源，当相对丰度大于2.65×10^-5可判定为来源为藏族。

实施例2 验证实验

任意选取一位长期生活在高原地区的志愿者，该志愿者的民族已知，按照实施例1中的材料与方法，检测志愿者的粪便样品中丁酸弧菌属的相对丰度，验证该志愿者的民族。

1、实验设计

任意选取一位长期生活在高原地区（海拔3500米）的志愿者，该志愿者的民族已知，持续3个月戒烟、戒酒，实验排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病的情况，避免影响实验结果。

2、粪便收集

该志愿者在实验开始前收到一个马桶粪便收集器，并且排出大便后将大便装入粪便收集管，立刻保存在-20℃的冰箱中，次日将粪便标本转运至-80℃的冰箱中保存，等待统一检测。

3、 丁酸弧菌属的DNA提取

吸取1000ul CTAB裂解液移至2.0ml EP管中，并加入溶菌酶，再加入500ul左右的样品，EP管浸入65℃水浴中，期间颠倒混匀数次，使样品充分裂解。裂解后，离心并取上层清液，按照25：24：1的体积比，在上层清液中加入酚 （Ph为8.0）、氯仿、异戊醇，震荡混合均匀。以转速12000rpm离心10min后，取上层清液，按照24:1的体积比，在上层清液中加入氯仿、异戊醇，震荡混合均匀。以转速12000rpm离心10min后，吸取上层清液至1.5mL的离心管中，加入异丙醇，震荡混合均匀，在-20℃下沉淀。以转速12000rpm离心10min后，倒出液体，注意不要倒出沉淀，用1ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后吸出。将超净工作台吹干或者室温晾干，加入双蒸水溶解DNA样品，加入1ul RNase A消化RNA，37℃放置15min。然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量DNA样本到离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。

4、 PCR扩增、混样和纯化

以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域6S V3-V4，选择使用带 Barcode的特异引物：

515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’（SEQ ID NO：1），

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（SEQ ID NO：2），

使用高效高保真酶（New England Biolabs 公司的 Phusion® High-FidelityPCR Master Mix with GC Buffer）进行PCR，确保扩增效率和准确性。

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE缓冲液浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒为Thermo Scientific 公司GeneJET 胶回收试剂盒。

5、 文库构建和上机测序

使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。

6、数据分析

6.1 测序数据处理

使用Cutadapt（V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先对reads进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列，初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads序列通过与物种注释数据库进行比对、检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

6.2 OTU聚类和物种注释

利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性，将序列聚类成为OTUs（OperationalTaxonomic Units），同时选取OTUs的代表性序列，依据算法原则，筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1），获得分类学信息并分别在属的水平统计汉族士兵、藏族士兵的群落组成（见图3、4）。

6.3 丁酸弧菌属的相对丰度计算和差异比较

丁酸弧菌属的相对丰度使用丁酸弧菌属OTU值/检测样本，检测到的所有菌属以OTU值表示，由于样本非正态分布采用Mann-Whitney检验进行差异比较。绘制ROC曲线，评估丁酸弧菌属的相对丰度对高原地区汉族人群和藏族人群的区别诊断敏感性和特异性，并计算界值，P＜0.05为差异有统计学意义，采用SPSS22.0软件包进行统计学处理。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院

<120> 丁酸弧菌属在鉴别和/或区分高原地区汉族人群和藏族人群中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgccagcmg ccgcggtaa 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (4)

1.微生物在鉴别和/或区分高原地区的藏族和高原地区的汉族个体中的应用，其特征在于，所述的微生物为丁酸弧菌属，所述丁酸弧菌属包括溶纤维丁酸弧菌种、瘤胃假丁酸弧菌，所述的高原为海拔3500m以上，其中，将丁酸弧菌属的相对丰度与预定值进行比较，所述的预定值为2.65×10^-5，当所述的丁酸弧菌属的相对丰度大于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的藏族，当所述丁酸弧菌属的相对丰度小于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的汉族，所述的相对丰度用“丁酸弧菌属OTU（Operational Taxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。

2.鉴别和/或区分高原地区的藏族和高原地区的汉族个体的方法，其特征在于，检测所述个体的粪便或肠道中微生物的相对丰度，所述的微生物为丁酸弧菌属，将所述相对丰度与预定值进行比较，所述的预定值为2.65×10^-5，当所述的丁酸弧菌属的相对丰度大于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的藏族，当所述丁酸弧菌属的相对丰度小于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的汉族，其中，所述丁酸弧菌属包括溶纤维丁酸弧菌种、瘤胃假丁酸弧菌，所述的高原为海拔3500m以上，所述的相对丰度用“丁酸弧菌属OTU（OperationalTaxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)提取待测个体的粪便或肠道中微生物的DNA；

2)DNA目的片段的扩增；

3)测序；

4)计算微生物的相对丰度；

5)微生物的相对丰度与预定值进行比较。

4.检测微生物相对丰度的产品在鉴别和/或区分高原地区的藏族和高原地区的汉族个体中的应用，所述微生物为丁酸弧菌属，所述丁酸弧菌属包括溶纤维丁酸弧菌种、瘤胃假丁酸弧菌，所述的高原为海拔3500m以上，其中，将丁酸弧菌属的相对丰度与预定值进行比较，所述的预定值为2.65×10^-5，当所述的丁酸弧菌属的相对丰度大于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的藏族，当所述丁酸弧菌属的相对丰度小于2.65×10^-5时，判定个体为高原地区的汉族，所述的相对丰度用“丁酸弧菌属OTU（Operational Taxonomic Unit）值”/“检测样本检测到的所有菌属OTU值”表示。

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