JP2019517783A - 肝疾患を検出するためのマイクロバイオーム(microbiome)プロファイルの使用 - Google Patents
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Abstract
対象における、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の鑑別診断のための方法が提供される。方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。
Description
関連出願の相互参照
[0001] この出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられた、2016年4月20日に出願された米国仮特許出願第62/325,334の利益を主張する。
[0001] この出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられた、2016年4月20日に出願された米国仮特許出願第62/325,334の利益を主張する。
[0002] 本明細書に記載された主題は、対象由来の試料を分析して、細菌種の存在、非存在、または相対存在量(relative abundance)についてのそれのマイクロバイオームシグネチャー(signature)を決定することによる、肝線維症の検出、ならびに非アルコール性肝疾患の検出および/または鑑別のための方法に関する。
[0003] ヒト腸管微生物叢(microbiota)は、ヒトゲノムに存在するものより100倍を超える遺伝子を有する、150〜200個のよく見られる細菌種および1000個のあまり一般的ではない細菌種を含む、何兆個もの微生物からなる(Quigleyら、J. Hepatology、58:1020-1027(2013))。腸管微生物叢は、主に細菌で構成されるが、古細菌、原生動物、およびウイルスもまた含有する。微生物叢は、食物処理、複雑な不消化多糖の消化、およびビタミンの合成を含む、健康維持に必要不可欠な重要な機能を実施し、病原体の阻害、毒性化合物の代謝から宿主代謝の調節まで及ぶ多様な機能を有する生物活性代謝物を分泌する(Quigley、同上)。
[0004] 乱された微生物叢は、乳幼児における壊死性腸炎から、成人における肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、過敏性腸症候群、および炎症性腸疾患まで、ヒトにおける様々な障害に関与している。いくつかのヒト障害の発病における微生物叢の役割は認識されているが、肝疾患における腸マイクロバイオームについての役割に関する確固たる科学的根拠はまだ現れつつある段階である。例えば、腸微生物叢は、ある特定の肝疾患の発病または進行において役割を果たしているのではないかと疑われており、その肝疾患には、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、完全静脈栄養/腸管不全合併肝疾患、ならびに原発性硬化性胆管炎が挙げられる(Quigley、同上)。個体に存在する微生物叢を容易に、かつ正確にアセスメントするための方法、ならびに特定の微生物の存在、非存在、または相対存在量を、特定の疾患および状態、ならびに/またはそれを発症するリスクと関連づけるための方法が必要とされている。
[0005] NAFLDに関して、およそ8千万〜1億人の米国人が、肥満およびインスリン抵抗性に一般的に関連した、メタボリックシンドロームの肝臓症状である、NAFLDを有すると推定される(Carding, S.ら、Microb. Ecol. Health Dis.、26:26191(2015); Zhu, L.ら、Hepatology、57(2):601-609(2013); Kakiyama, G.ら、J. Hepatol.、58(5):949-955(2013))。NAFLDは、NAFLDの非進行性サブタイプである、非アルコール性脂肪肝(NAFL)と呼ばれる良性脂肪症から、硬変、肝細胞癌、および肝臓関連死へ進行し得るNAFLDの進行性サブタイプである、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)まで及ぶ一連の肝疾患である(Qin, N.ら、Nature、513(7516):59-64(2014))。NAFLおよびNASHは、典型的には、肝生検により区別され、これらの障害の検出のための、およびそれらの区別のための代替の方法、好ましくは非侵襲性方法が望まれる。
[0006] 前述の、関連分野の例およびそれに関係した限界は、例証であって、排他的ではないことを意図される。関連分野の他の限界は、本明細書を読み、かつ本図面を研究すれば、当業者に明らかになるだろう。
[0007] 下に記載され、例証された以下の態様およびその実施形態は、例示的かつ例証的であることを意図され、範囲を限定することを意図するものではない。
[0008] 一態様において、対象において肝線維症を検出するための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して(inspect)、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。
[0009] 別の態様において、対象において、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在もしくは非存在を検出する工程、および/または腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するか、存在しないかを決定する工程であって、nが少なくとも2であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2に同定された少なくともn個の細菌種の存在もしくは非存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む。
[0010] 一実施形態において、分析する工程は、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種を検出する試験パネルに生物学的試料を適用することを含む。一実施形態において、nは少なくとも2である。
[0011] 別の実施形態において、分析する工程は、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在もしくは非存在により、腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む。
[0012] 他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有さない対象の集団から得られた参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比較される。
[0013] 一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有する対象の集団から得られた参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比較される。
[0014] 別の実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、進行性肝線維症を有する対象の集団から得られる。
[0015] さらに他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値から決定される。
[0016] なお別の実施形態において、生物学的試料を分析する工程は、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される試料を含む。
[0017] 他の実施形態において、精査に基づいて、肝線維症の病期が決定される。
[0018] 一実施形態において、精査に基づいて、進行性線維症の病期が決定される。
[0019] 他の実施形態において、精査に基づいて、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断が決定される。
[0020] いくつかの実施形態において、nは、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)、八(8)、九(9)、十(10)、十一(11)、十二(12)、十三(13)、十四(14)、十五(15)、十六(16)、十七(17)、十八(18)、十九(19)、および二十(20)からなる群から選択される。
[0021] さらに他の実施形態において、nは、約1〜30、約1〜25、約5〜30、約5〜25、約10〜30、および約10〜25からなる群から選択される。
[0022] なお他の実施形態において、nは、一(1)より大きい、二(2)より大きい、三(3)より大きい、四(4)より大きい、五(5)より大きい、六(6)より大きい、七(7)より大きい、八(8)より大きい、九(9)より大きい、十(10)より大きい、十一(11)より大きい、十二(12)より大きい、十三(13)より大きい、十四(14)より大きい、十五(15)より大きい、十六(16)より大きい、十七(17)より大きい、十八(18)より大きい、十九(19)より大きい、および二十(20)より大きい数からなる群から選択される。一実施形態において、nは、40未満、または37未満、または35未満、または30未満である。
[0023] 一実施形態において、nは、少なくとも8であり、かつA群における細菌種(Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae)で構成される。
[0024] 別の実施形態において、A群細菌種で構成された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるA群細菌種の相対存在量の少なくとも2倍のシグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する。
[0025] 別の実施形態において、nは少なくとも9であり、追加として、B群における細菌種(Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis)の1個または複数を含む。
[0026] 一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種の相対存在量の多くとも2分の1の相対存在量を有する。
[0027] 別の実施形態において、nは、C群における細菌種(gathobacter rectalis (Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8)で構成される。
[0028] なお別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるC群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるC群細菌種の相対存在量の多くとも2分の1の相対存在量を有する。
[0029] いくつかの実施形態において、分析する工程は、表2、表3、表4、および/または表5に示された1個もしくは複数の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて、生物学的試料を分析すること含む。
[0030] 一実施形態において、核酸は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、またはrRNAである。
[0031] 別の実施形態において、分析する工程は、核酸増幅技術を用いて生物学的試料を分析することを含む。
[0032] さらに別の実施形態において、核酸増幅技術は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応から選択される。
[0033] 別の実施形態において、核酸増幅技術は、等温核酸増幅技術である。
[0034] なお別の実施形態において、分析する工程は、核酸シーケンシングを用いて生物学的試料を分析することを含む。
[0035] 別の実施形態において、核酸シーケンシングは、全DNAシーケンシング、もしくは完全な16S rRNA遺伝子のシーケンシング、または非限定的にV6領域を含む、16S rRNA遺伝子の超可変領域のシーケンシングを含む。次世代シーケンシング(NGS)が、いくつかの実施形態において、生物学的試料を分析するために用いられる。
[0036] 一実施形態において、核酸シーケンシングは、ピロシーケンシングまたはサンガーシーケンシングによるDNAシーケンシングを含む。一実施形態におけるピロシーケンシングは、マルチタグシーケンシングである。
[0037] 他の実施形態において、分析する工程は、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、免疫学的アッセイ、および培養に基づいたアッセイから選択される方法を用いて分析することを含む。
[0038] 別の態様において、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種が、対象の腸管マイクロフローラにおいて存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロフローラにおける、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法。
[0039] 別の態様において、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法が、提供される。その方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期3〜4期線維症の診断が、以下の基準:
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(iii)(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/または0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(iii)(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/または0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
[0040] 一実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、(a)と(b)の両方、(a)と(c)の両方、(a)と(d)の両方、(b)と(c)の両方、または(b)と(d)の両方により示される。
[0041] 別の実施形態において、(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.7より大きく、および/または0.7以上である。
[0042] 別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも2倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(a)に列挙された細菌種の少なくとも2個により示される。
[0043] なお別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(b)または(c)に列挙された細菌種の少なくとも2個により示される。
[0044] さらに別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Oscillibacter_sp._CAG.241、Firmicutes_bacterium_CAG.129、Firmicutes_bacterium_CAG.170、Ruminococcus_obeum、Bacteroides_pectinophilus、Holdemania_filiformis、およびFirmicutes_bacterium_CAG.83からなる群から選択される。
[0045] 別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、さらに、参照マイクロバイオームに対する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるE. coliの存在量の増加により示される。
[0046] 別の態様において、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す。
[0047] 別の態様において、(I)表2、表3、表4、および/もしくは表5に同定された少なくともn個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、および/もしくは表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が肝硬変への進行のリスクを示す、工程、または(II)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量より少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、および(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量より多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、ならびに(iii)(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量および(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量を、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから決定する工程であって、ジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示される、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法。
[0048] 一実施形態において、nは少なくとも2である。
[0049] さらに別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象において非アルコール性脂肪肝(NAFL)を非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)から区別するためのアッセイ方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2に同定された少なくともn個の細菌種が前記シグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2で同定された少なくともn個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む。
[0050] 一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝(NAFL)を示す。
[0051] 別の実施形態において、nは、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)、八(8)、九(9)、十(10)、十一(11)、十二(12)、十三(13)、十四(14)、十五(15)、十六(16)、十七(17)、十八(18)、十九(19)、および二十(20)からなる群から選択される。
[0052] 別の実施形態において、nは、1より大きくかつ30未満、1より大きくかつ25未満、5より大きくかつ30未満、5より大きくかつ25未満、10より大きくかつ30未満、および10より大きくかつ25未満からなる群から選択される。
[0053] さらに他の実施形態において、腸管マイクロフローラは、対象由来の生物学的試料から得られ、試料が、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される。
[0054] 一実施形態において、腸管マイクロフローラに存在する細菌種は、表2、表3、表4、および/または表5に示された細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて決定される。
[0055] 別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物または腸管マイクロフローラにおけるタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーは、代謝産物またはタンパク質から決定される。
[0056] 別の実施形態において、決定することまたは精査することは、ノンパラメトリック多変量解析、ランダムフォレスト解析、サポートベクターマシン、相関ネットワーク解析、相関差異ネットワーク解析、ベイズモデル、線形モデル、および教師あり機械学習ツールからなる群から選択される方法論の使用を含む。
[0057] 本方法の追加の実施形態は、以下の説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかであろう。前述および以下の説明から認識できるように、本明細書に記載されたありとあらゆる特徴、およびそのような特徴の2つ以上のありとあらゆる組合せは、そのような組合せに含まれる特徴がお互いに矛盾しないという条件で、本開示の範囲内に含まれる。加えて、任意の特徴または特徴の組合せは、本発明の任意の実施形態から特定的に排除され得る。本発明の追加の態様および利点は、特に添付の実施例および図面と共に考慮されれば、以下の説明および特許請求の範囲に示されている。
1.定義
[0060] 様々な態様が、ここで、以下により完全に記載される。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形で具体化され得、本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではない;むしろ、これらの実施形態は、この開示が、綿密で、完全であり、かつ当業者へそれの範囲を十分に伝えるように提供される。
[0060] 様々な態様が、ここで、以下により完全に記載される。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形で具体化され得、本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではない;むしろ、これらの実施形態は、この開示が、綿密で、完全であり、かつ当業者へそれの範囲を十分に伝えるように提供される。
[0061] 値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間にある各値、およびその提示された範囲における任意の他の、提示され、または間にある値が、本開示内に包含されることが意図される。例えば、1μm〜8μmの範囲が提示されている場合には、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、および7μm、加えて、1μm以上の値の範囲および8μm以下の値の範囲もまた明確に開示されていることが意図される。
[0062] 単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに別なふうに規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、1つの「ポリマー」への言及は、単一のポリマー、加えて、2つ以上の同じ、または異なるポリマーを含み、1つの「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤、加えて、2つ以上の同じ、または異なる賦形剤、などを含む。
[0063] 数値の直前にある場合の語「約」は、その開示の文脈が別なふうに指示せず、または以下のような解釈と矛盾しない限り、その値のプラスまたはマイナス10%の範囲を意味し、例えば、「約50」は45〜55を意味し、「約25,000」は22,500〜27,500を意味するなどである。例えば、「約49、約50、約55」などの数値のリストにおける、「約50」は、その前の値と次の値の間の間隔の半分未満まで拡張される範囲、例えば、49.5より大〜52.5未満を意味する。さらに、句「約〜未満」または「約〜より大きい」(「〜」はある一つの値)は、本明細書に提供された用語「約」の定義を考慮して、理解されるべきである。
[0064] 「腸管(intestinal tract)」または形容詞として用いられる場合の「腸管の(intestinal)」は、個体の胃、結腸、小腸、大腸、盲腸、および直腸を指す。同義語には、腸(gut)および胃腸管(gastrointestinal tract)が挙げられる。
[0065] 「微生物叢」は、腸などのある特定の位置を占める微生物の集合的集団を記載するために用いられる。
[0066] 「マイクロバイオーム」は、微生物叢の集合的ゲノムを指す。
[0067] 範囲により、または任意の類似した様式で主張することができる、群内の任意の部分的範囲または部分的範囲の組合せを含む任意のそのような群の任意の個々のメンバーを排除または除外する権利を留保することにより、この開示の完全な基準に満たないものが、任意の理由によって主張することができる。さらに、任意の個々の置換体、類似体、化合物、リガンド、構造、もしくはそれらの群、または主張された群の任意のメンバーを排除または除外する権利を留保することにより、この開示の完全な基準に満たないものが、任意の理由によって主張することができる。
[0068] この開示を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が参照されている。これらの特許、特許出願、および刊行物の全体としての開示は、この開示の日付時点の状態としてその当業者に知られているような当技術分野の状態をより完全に記載するために、参照によりこの開示へ組み入れられている。引用された特許、特許出願、および刊行物とこの開示との間に何か矛盾がある場合、この開示が支配する。
[0069] 便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲に用いられるある特定の用語は、ここに集められている。他に規定がない限り、この開示に用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示の属する当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
II.検出および診断のための方法
[0070] 肝線維症の検出、ならびに非アルコール性脂肪性肝疾患の検出および/または鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査する工程を含む。これらの方法の裏付けとして行われる研究は、実施例1を参照してここに記載される。
[0070] 肝線維症の検出、ならびに非アルコール性脂肪性肝疾患の検出および/または鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査する工程を含む。これらの方法の裏付けとして行われる研究は、実施例1を参照してここに記載される。
[0071] 実施例1に詳述された研究において、86人の個体のコホートを選択した。そのコホートにおいて、14人の個体が、肝生検で確認された進行性肝線維症を有した。個体のコホートからの糞便試料を取得し、DNA分析および全ゲノムショットガンシーケンシングにより分析した。シーケンシングデータを、NCBIからの細菌、古細菌、ウイルス、および真核生物のゲノムから構築されたデータベースにおけるマイクロバイオーム配列データへマッピングした。細菌の相対存在量を、種、属、科、目、綱、および門へ分類学的に分類して、訓練データセットを形成した。訓練データセットには、各対象の年齢、性別、人種、および体格指数(BMI)と共に、試料多様性および試料豊富度(richness)も含まれた。
[0072] その研究における個体を、線維症の重症度に基づいて2つの群にカテゴリー化した。個体の第1の群(群1)は、線維症をもたず(病期0期)、または中等度の線維症(病期1期および2期)を有した。第2の群(群2)は、肝臓が生検によって線維症の進行期(病期3期および4期)を確認された患者からなった。大部分の患者(72人)は、群1であり、14人の患者は、群2に属した。表1.1(下記の実施例1内)は、進行性線維症状態により分類されたコホート全体の個体群統計学的、臨床的、生化学的、および代謝的プロファイルを示す。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたないものより、年齢が高く、ヒスパニックで、糖尿病患者であり、かつより高いALT、より高いAST、より低い血小板数、およびより高いHbA1cを有する可能性がより高かった。加えて、その2つの群は類似したBMIを有したが、進行性線維症を有する患者はより高い胴囲を有した。表1.2(下記の実施例1内)は、進行性線維症状態により分類された研究コホートにおける詳細な組織学的差異を提供する。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたないものより、より重篤な小葉ならびに門脈の炎症および風船様膨化(ballooning)を有する可能性がより高かった。
[0073] 実施例1に詳述されているように、患者の腸マイクロバイオーム組成を、彼らの糞便試料から抽出されたDNAの全ゲノムショットガンシーケンシングを用いて決定した。86個の糞便試料は、(低品質の塩基を切り取り、ヒト配列を除去した後)試料あたり平均6.58×109塩基を生じた。循環代謝物およびそれらの微生物機能への関連性もまた研究し、実施例1に記載されているように、コホートのサブセット(56人の患者)から収集された血清試料から生化学的プロファイルを作成した。
[0074] 表1に示されているように、腸マイクロバイオーム組成の分析により、軽度/中等度NAFLD対進行性線維症の間に、糞便由来のメタゲノムの分類学的組成の差があることが明らかにされた。
[0075] 表1に見られるように、門レベルにおいて、両方の群における腸マイクロバイオームは、FirmicutesおよびBacteroidetesのメンバー、続いて、よりずっと少ない存在量でProteobacteriaおよびActinobacteriaのメンバーによって支配された。さらに、FirmicutesとProteobacteriaの両方は、2つの群に渡って示差的に大量であり(p値<0.05)、Firmicutesが軽度/中等度NAFLD(G1)においてより多く、一方、Proteobacteriaは進行性線維症(G2)においてより多かった。種レベルにおいて、Eubacterium rectale(2.5% 相対存在量中央値)およびBacteroides vulgatus(1.7%)が軽度/中等度NAFLD(G1)において最も大量にある生物体であり、一方、B. vulgatus(2.2%)およびEscherichia coli(1%)が進行性線維症(G2)において最も大量であった。Ruminococcus obeum CAG:39、R. obeum、およびE. rectaleは、軽度/中等度NAFLDより進行性線維症において有意に、より少なかった。
[0076] 進行性線維症の検出のための糞便由来のメタゲノムプロファイルを利用するモデルを開発した。軽度/中等度NAFLDおよび進行性線維症に属する試料を区別する能力があるモデルを構築するために、ランダムフォレスト(RF)を用いるカスタム機械学習プロセスを使用した。モデル構築のためのインプットフィーチャ(feature)のセットは、メタゲノムフィーチャおよび患者メタデータフィーチャからなった。メタゲノムデータからのフィーチャは、152個の構成種の数(豊富度)および相対存在量、ならびにマイクロバイオーム多様性(シャノン多様性)からなった。患者メタデータは、年齢、性別、人種、およびBMIからなった。RFモデルを構築することにおける第1のステップは、300個のRFを訓練し、その後、最高性能モデルから上位フィーチャを選択することからなった。訓練されたRFの性能を最適化するためにフィーチャ削除ステップを行い、最も重要なフィーチャとしてシャノン多様性、年齢、およびBMIと一緒に37個の種を選択した。訓練段階におけるRFのほとんど全部において、年齢が最高予測子(predictor)であることが観察された。選択されたフィーチャの統計学的有意性を、40個のランダムに選択されたフィーチャにおいてそれぞれ訓練された10,000個のモデルを用いるモンテカルロシミュレーションによりアセスメントした(p値<0.006)。
[0077] 40個の選択されたフィーチャを用いて、50個のRFを訓練し、最良性能モデルを最終モデルとして選択した。このモデルは、AUC 0.936のロバストかつ統計学的に有意な診断精度を有した。図1A〜1Bは、軽度/中等度群(G1)における試料を進行性線維症群(G2)における試料から区別するために用いられるランダムフォレストモデルに選択された37個の種の相対存在量の箱型図である。試料多様性ならびに患者年齢およびBMIもまた、ランダムフォレストモデルによりフィーチャとして選択された(箱型図は未呈示)。(50個のRFから導かれた)AUC推定値についての範囲は0.779〜0.936の間であった。
[0078] 表2は、RFモデルを用いて同定された37個の種を要約する。表2はまた、G2およびG1におけるジニ指数の平均減少量および種存在量中央値のログ比を提供する。最適化されたモデルにより選択された37個の種から、8個の種が、軽度/中等度NAFLD(G1)と比較して進行性線維症(G2)において2倍より多く大量であったが、22個の種は、進行性線維症(G2)と比較して軽度/中等度NAFLD(G1)において2倍より多く大量であった。具体的には、8個の種(Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、Clostridium bolteae)の種存在量中央値は、群1試料においてより群2において2〜4倍、大量であった。これらの8個の種は、まとめてA群と呼ばれる。進行性線維症(G2)と比較して軽度/中等度NAFLD(G1)において2倍より多く大量であった22個の種は、本明細書でまとめてB群と呼ばれる。表2はまた、ゲノムデータベースのキュレーションにより同定された6個の種を要約し、それらの種は、表2においてC群種により示されている。
[0079] したがって、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期3〜4期線維症の診断が以下の基準:
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/もしくは0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/もしくは0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
[0080] 病期3〜4期線維症の診断は、いくつかの実施形態において、(a)と(b)の両方により示され、または代替として、病期3〜4期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも2倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するA群の細菌種の少なくとも2個により示される。
[0081] 病期3〜4期線維症の診断はまた、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するB群の細菌種の少なくとも2個により示され得る。
[0082] 病期3〜4期線維症の診断はまた、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1、または多くとも2.5分の1である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するC群の細菌種の少なくとも1個または少なくとも2個により示され得る。
[0083] 他の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、(a)と(b)の両方、(a)と(c)の両方、(a)と(d)の両方、(b)と(c)の両方、もしくは(b)と(d)の両方、(a)、(b)、(c)、および(d)のうちの3つ、または(a)、(b)、(c)、および(d)の全部により示される。
[0084] 病期3〜4期線維症の診断はまた、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され得、細菌種が、Oscillibacter_sp._CAG.241、Firmicutes_bacterium_CAG.129、Firmicutes_bacterium_CAG.170、Ruminococcus_obeum、Bacteroides_pectinophilus、Holdemania_filiformis、およびFirmicutes_bacterium_CAG.83からなる群から選択される。
[0085] 病期3〜4期線維症の診断はまた、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1、または多くとも2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され得、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8(C群)からなる群から選択される。
[0086] 別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法は、本明細書に記載されているように、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種がジニ係数の平均減少量を有し、かつ細菌種の少なくともn個についてのジニ係数の平均減少量の合計が0.5以上であることが、NASHを示す、工程を含む。
[0087] 別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断のための方法は、本明細書に記載されているように、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種がジニ係数の平均減少量を有し、かつ細菌種の少なくともn個についてのジニ係数の平均減少量の合計が0.5以上であることが、進行性(病期3〜4期)肝線維症を示す、工程を含む。
[0088] 別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法が企図され、提供される。その方法は、一実施形態において、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから、(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を決定する工程を含む。(i)および(ii)における少なくとも2個の細菌種についてのジニ係数の平均減少量が得られ、または決定される。(i)および(ii)における細菌種のそれぞれについてのジニ係数の平均減少量の合計が決定され、ジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示されている。
[0089] ジニ係数の平均減少量の総和が腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける1つまたは複数の種について決定される方法の実施形態において、総和値が、0.25より大きく、0.3より大きく、0.4より大きく、0.5より大きく、0.6より大きく、0.7より大きく、0.8より大きく、0.9より大きく、もしくは1.0より大きくあり得、または0.25以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、もしくは1.0以上であり得る。さらに、ジニ係数の平均減少量の総和が腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける1つまたは複数の種について決定される方法の実施形態において、1つもしくは複数の種、またはnの値は、本明細書に示されたnの範囲または値のいずれかであり得、ある特定の実施形態においては、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。
[0090] 軽度/中等度NAFLDの群(G1)と進行性線維症の群(G2)とを区別するためのシグネチャーの存在をさらに検証するために、線形サポートベクターマシン(SVM)に基づいた直交機械学習方法を用いて、同じインプットフィーチャセットから分類器を構築した;これは、最終フィーチャセットが、RFに基づいたモデルにおけるフィーチャと高度の一致を有し、かつ同様に高いAUCを有するモデルを生じた。実施例1は、モデルを詳細に記載する。訓練されたSVMは予測子として18個の種を選択し、それらは、表3に示されている。その種のうちの12個は、ランダムフォレスト方法により選択された種と重複し、これらの重複する種は表3において太字で識別されている。
[0091] 線形SVMにより同定された種(表3)のうちの12個は、ランダムフォレスト方法により選択された種(表2)と重複し、その12個の共通の種は、下記の表4に列挙されている。表4に列挙された12個の種のうち、4個の種(Bacteroides finegoldii、Clostridium sp. 7_3_54FAA、Clostridium symbiosum、およびStreptococcus parasanguinis)は、2つの群間のそれらの存在量中央値のログ倍数変化(表2の最後の列)に基づいて群2試料においてより大量であることが観察された。群2においてより群1において、2〜16倍、大量であるおおよそ20個の種がある。
[0092]進行性線維症を線維症なしまたは中等度線維症から区別する、データベースキュレーションにより同定された種は、表5に同定された。表5に見られるように、同定された種は、線維症なしまたは中等度線維症を有する患者に対して、進行性線維症を有する患者において多くとも約2分の1、または多くとも約2.5分の1である。表5におけるこれらの種は、細菌のFirmicutes門のClostridiales目に属する。
[0093] データの2つの供給源を用いて、進行性線維症を進行性線維症なしから区別するための、メタゲノム導出モデル(metagenome derived model)の性能を検証した。(i)年齢は、両方のマイクロバイオーム、加えて進行性線維症の主要な効果変更子(modifier)である。メタゲノム導出モデルが年齢によって偏っていなかったことを調べるために、RFモデルを、以前に発表され、かつ十分表現型検査された双子コホートデータセット(Loomba, R.ら Gastroenterology、149(7):1784-1793(2015))に適用した。先験的に、60歳以上で、かつMRI PDFF<5%により決定された場合の脂肪肝なしの正常な肝臓脂肪含量(NAFLDなし)およびMRE<3 Kpaにより決定された場合の線維症の非存在(線維症なし)に基づいて健康であったペアの双子から単一の双子(双子は、有意に共有されたマイクロバイオームを有することが知られているため)を選択した。これらの固有的に十分特徴づけられた28人の健康で年齢の高い方の双子の個体からのデータへ、訓練されたRFによりなされた予測のAUCは、一貫し、かつロバストのままであり、0.89のAUC(p値<0.0001、並べ替えクラス(permuted class)ラベルを用いるモンテカルロシミュレーション)を有した。
[0094] 患者の独立した群におけるフレームワークのさらなる検証を、NAFLD硬変を有する患者の年齢均衡のとれた群および線維症をもたない患者の年齢均衡のとれた群を確立することにより行い、その検証において、全てがNAFLD硬変(N=14)かまたは線維症なし(N=16)のいずれかで、60歳を超える、ほぼ同数の患者が研究された。このNASH硬変試料および対照試料からの患者データおよび種存在量を用いて、0.80のAUCを有する別のRFモデルを訓練した。表6に示された、このモデルにより選択された9個の微生物種から、7個が、最初のRFモデルにより選択された37個の種と重複している(p値<0.0008)。表6はまた、G2およびG1におけるジニ係数の平均減少量および種存在量中央値のログ比を示す。
[0095] したがって、例えば、マイクロバイオーム由来のバイオマーカーのパネルの検出のための診断試験を用いて、患者試料においてマイクロバイオームシグネチャーを決定することにより、NAFLDによる進行性線維症を診断するための方法が企図される。その方法は、糞便試料などの胃腸管由来の試料を用いる、進行性線維症の非侵襲性検出、および進行性線維症または硬変のスクリーニングを提供する。NAFLDにおける腸マイクロバイオームは、FirmicutesおよびBacteroidetesのメンバー、続いて、より少ない存在量でProteobacteriaおよびActinobacteriaのメンバーによって支配されている(上記の表1)。その疾患が、軽度/中等度NAFLDから進行性線維症へ進行するにつれて、ProteobacteriaがFirmicutesに取って代わり、Firmicutesが、進行性線維症への移行期において役割を果たし得、いったん進行性線維症が始まったならば、Proteobacteriaが優位になることを示唆する。
[0096] 種レベルにおいて、E. rectale(2.5%相対存在量中央値)およびB. vulgatus(1.7%)は軽度/中等度NAFLDにおいて大量の生物体であったが、B. vulgatus(2.2%)およびE. coli(1%)が進行性線維症において大量であった。進行性線維症を有する患者の誰も、腹水も肝臓代償不全のいかなる証拠ももたなかったが、高いE. coli存在量をまだなお有した。進行性線維症におけるE. coliのこの存在量の増加は、臨床上の意義を有する可能性がある。これらのデータは、E. coli優位が、線維症進行の病期のかなり早期に生じることを示唆し、かつ腸内毒素症が門脈圧亢進症の発生に先行し得るという仮説を支持する。
[0097] したがって、一実施形態において、対象において、肝線維症を検出するための方法、および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、E. coli、および表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種で構成されるマイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症または非アルコール性脂肪性肝炎を示す、工程を含む。
[0098] 本明細書に記載されたデータは、肝線維症の検出へのアプローチとして、16S rDNA遺伝子シーケンシングよりむしろ、メタゲノミクスシーケンシングの使用を確立する。十分表現型検査されたNAFLDコホートからの糞便メタゲノムの分析から、データは、その疾患の異なる病期に異なって存在する37個の微生物種を明らかにする。微生物バイオマーカーは、代謝性および線維性疾患を診断するために用いることができ、肝疾患の病期を決定するためのツールを提供する。メタゲノミクスシグネチャーはまた、線維症、進行性線維症、および硬変を検出するために、他の非侵襲性の血清/血漿または画像診断に基づいた試験と共に用いられ得る。
[0099] したがって、対象において肝線維症を検出するための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。
[0100] 対象において非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法もまた提供される。一つの方法において、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種が、対象の腸管マイクロフローラに存在するかどうかが決定され、腸管マイクロフローラにおける表2、表3、表4、または表5に同定された前記少なくともn個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す。別の方法において、対象の腸管マイクロフローラが、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定するために分析され、腸管マイクロバイオームシグネチャーが、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定するために精査される。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す。
[0101] 対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法であって、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種が対象の腸管マイクロフローラに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロフローラにおける表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む、方法。
[0102] 一実施形態において、nは少なくとも8であり、A群における細菌種(Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae)で構成される。場合によっては、A群細菌種で構成される腸管マイクロバイオームシグネチャーは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるA群細菌種の相対存在量の少なくとも2倍の、シグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する。
[0103] 別の実施形態において、nは少なくとも9であり、加えて、B群における細菌種(Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis)の1つまたは複数を含む。場合によっては、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種の相対存在量の多くとも2分の1の相対存在量を有する。
[0104] 別の実施形態において、nは少なくとも2であり、C群における細菌種(Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8)の1つまたは複数を含む。
[0105] 別の実施形態における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための本明細書に企図された方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期3〜4期線維症の診断が以下の基準:
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/または0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;または
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1、もしくは多くとも約2.5分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに/または
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きく、および/または0.5以上である
の1つまたは複数により示される、工程を含む。
[0106] 病期3〜4期線維症の診断は、いくつかの実施形態において、(a)と(b)の両方により示され、または代替として、病期3〜4期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも2倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(a)に列挙された細菌種の少なくとも2個により示される。
[0107] なお別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1である、対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(b)に列挙された細菌種の少なくとも2個、および/または参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1もしくは2.5分の1である、対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(c)に列挙された細菌種の1個もしくは複数により示される。
[0108] さらに別の実施形態において、病期3〜4期線維症の診断は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Oscillibacter_sp._CAG.241、Firmicutes_bacterium_CAG.129、Firmicutes_bacterium_CAG.170、Ruminococcus_obeum、Bacteroides_pectinophilus、Holdemania_filiformis、およびFirmicutes_bacterium_CAG.83からなる群から選択される。
[0109] 別の態様において、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す。
[0110] 別の態様において、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、肝硬変への進行のリスクを示す、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法。
[0111] さらに別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象において非アルコール性脂肪肝(NAFL)を非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)から区別するためのアッセイ方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む。
[0112] 分析される対象由来の試料は、糞便試料、腸管粘膜試料、または腸管内容物の試料であり得る。糞便試料の使用は、非侵襲性方法の利点を提供する。
[0113] 試料は、Sekirov, I.ら Physiol. Rev、90:859〜904(2010)に記載されたものなど、当業者に公知の様々な技術のいずれかにより、分析されて、それのマイクロバイオームシグネチャーが確認される。例えば、一実施形態において、生物学的試料を、細菌種を検出する試験パネルに適用し、一実施形態において、その試験パネルは、表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の検出のための試験パネルである。試験パネルは、培養に基づいたパネル、細菌16SリボソームRNA同定を用いる分子に基づいたパネル、完全長16S rRNAシーケンシングパネル(サンガーシーケンシングによる)、DNAマイクロアレイパネルなどの培養非依存的技術であり得る。例えば、合成によるシーケンシング(sequencing by synthesis)(SBS)ケミストリー、イオン半導体(ion torrent)シーケンシング、ピロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、および当業者に公知の他の方法などの次世代シーケンシング技術を用いる、メタゲノムシーケンシングもまた、マイクロバイオームシグネチャーを決定するために用いることができる。ラージスケールショットガン型メタゲノムシーケンシングが用いられ得、標的化メタゲノムシーケンシングもまた適している。一実施形態において、マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種は、マルチタグピロシーケンシングなどのピロシーケンシングを用いて同定される。他の分析方法には、変性ゲル電気泳動、末端制限断片長多型、リボソーム遺伝子間スペーサー分析、FISH、およびqPCRが挙げられる。FISHおよびqPCRは、標的とされる細菌種に固有の16S rRNA配列へハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる。分析技術は、組み合わせて、例えば、FISHとqPCRを、用いることができる。他の同定技術には、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、および免疫学的アッセイが挙げられる。
[0114] 試料の分析から決定されるマイクロバイオームシグネチャーは、同定された各種の絶対量、または同定された種の相対存在量に基づくことができる。一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量は、シグネチャーを定義するために用いられ、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する、試料における各細菌種の存在量中央値が用いられる。
[0115] 別の実施形態において、分析する工程は、表2、表3、表4、および/もしくは表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在または非存在により腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む。
[0116] マイクロバイオームシグネチャーを決定した後、それは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて分析され、それと比べて精査され、またはそれと比較される。参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、診断されるべき障害によって異なり得、一実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有さない対象の集団から得られる。別の実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有する対象の集団から得られる。一実施形態において、対象の集団は、進行性肝線維症を有し、他の実施形態において、対象の集団は、非アルコール性脂肪肝(NAFL)または非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を有する。得られた腸管マイクロバイオームシグネチャーの参照シグネチャーとの比較は、例えば、進行性肝線維症などの肝線維症の病期の診断を可能にする。肝線維症が、独立した疾患ではなく、いくつかの疾患に存在する組織学的変化であることは認識されているだろう。例えば、慢性ウイルス性B型およびC型肝炎は、肝線維症の一般的な原因である。肝線維症の重症度は、典型的には、S0、S1、S2、S3、およびS4と名付けられた5つの病期に分類される。S0は線維症なしである。S4は硬変である。中間において、S1は門脈域における軽度線維症である;S2は、小葉構造の破壊がない、門脈域間の線維症の中等度病期である。S3は、門脈域間および門脈域と中心静脈との間の線維性架橋により観察される、重度の線維症である。S4において、S2の所見に加えて、形成された偽小葉がある。
[0117] 他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーの精査に基づいて、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断が決定される。腸管マイクロバイオームシグネチャーが決定され、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを確認するように精査される。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す。あるいは、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種の非存在が非アルコール性脂肪肝(NAFL)を示す。
[0118] 試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表2に同定されたn個の細菌種を含有し得、nが、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)、八(8)、九(9)、十(10)、十一(11)、十二(12)、十三(13)、十四(14)、十五(15)、十六(16)、十七(17)、十八(18)、十九(19)、および二十(20)からなる群から選択される。あるいは、nは、約1〜30、約1〜25、約5〜30、約5〜25、約10〜30、および約10〜25からなる群から選択される。あるいは、nは、一(1)より大きい、二(2)より大きい、三(3)より大きい、四(4)より大きい、五(5)より大きい、六(6)より大きい、七(7)より大きい、八(8)より大きい、九(9)より大きい、十(10)より大きい、十一(11)より大きい、十二(12)より大きい、十三(13)より大きい、十四(14)より大きい、十五(15)より大きい、十六(16)より大きい、十七(17)より大きい、十八(18)より大きい、十九(19)より大きい、および二十(20)より大きい数からなる群から選択される。あるいは、nは、少なくとも一(1)、少なくとも二(2)、少なくとも三(3)、少なくとも四(4)、少なくとも五(5)、少なくとも六(6)、少なくとも七(7)、少なくとも八(8)、少なくとも九(9)、少なくとも十(10)、少なくとも十一(11)、少なくとも十二(12)、少なくとも十三(13)、少なくとも十四(14)、少なくとも十五(15)、少なくとも十六(16)、少なくとも十七(17)、少なくとも十八(18)、少なくとも十九(19)、および少なくとも二十(20)からなる群から選択される。あるいは、nは、表2のA群および/またはB群および/またはC群における種に対応する。
[0119] 試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表3に同定されたn個の細菌種を含有し得、nが、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)、八(8)、九(9)、十(10)、十一(11)、十二(12)、十三(13)、十四(14)、十五(15)、十六(16)、十七(17)、十八(18)、十九(19)、および二十(20)からなる群から選択される。あるいは、nは、約1〜30、約1〜25、約5〜30、約5〜25、約10〜30、および約10〜25からなる群から選択される。あるいは、nは、一(1)より大きい、二(2)より大きい、三(3)より大きい、四(4)より大きい、五(5)より大きい、六(6)より大きい、七(7)より大きい、八(8)より大きい、九(9)より大きい、十(10)より大きい、十一(11)より大きい、十二(12)より大きい、十三(13)より大きい、十四(14)より大きい、十五(15)より大きい、十六(16)より大きい、十七(17)より大きい、十八(18)より大きい、十九(19)より大きい、および二十(20)より大きい数からなる群から選択される。
試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表4に同定されたn個の細菌種を含有し得、nが、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、六(6)、七(7)、八(8)、九(9)、十(10)、十一(11)、および十二(12)からなる群から選択される。あるいは、nは、約1〜12、約1〜11、約1〜10、約1〜9、約1〜8、約1〜7、約1〜6、約1〜5、約1〜4、約1〜3、および約1〜2からなる群から選択される。あるいは、nは、表4における種の5〜12、5〜11、5〜10、および5〜9からなる群から選択される。
[0120] 試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表5に同定されたn個の細菌種を含有し得、nが、一(1)、二(2)、三(3)、四(4)、五(5)、および六(6)からなる群から選択される。あるいは、nは、約1〜6、約1〜5、約1〜4、約1〜3、および約1〜2からなる群から選択される。あるいは、nは、表5における種の6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、またはちょうど1個からなる群から選択される。
[0121] 別の実施形態において、試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、(i)Bacteroides finegoldiiおよびBacteroides sp. 1_1_30の少なくとも1個;(ii)Blautia sp. CAG:37;(iii)Clostridium sp. 7_3_54FAA、Clostridium sp. CAG:43、およびClostridium symbiosumの少なくとも1個;(iv)Eubacterium rectale;(v)Firmicutes bacterium CAG:129;(vi)Oscillibacter sp. CAG:241;(vii)Ruminococcus obeum CAG:39およびRuminococcus sp. CAG:90の少なくとも1個;および(viii)Streptococcus parasanguinisを含む。
[0122] マイクロバイオームシグネチャーを決定するために用いられる試験パネルまたは技術は、そのn個の細菌種の検出のために、それに応じて、設計される。n個の細菌種の検出のための試験パネルに適した技術は上記で言及されている。1つの例において、表2、表3、表4、または表5に示されたn個の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイが提供される。核酸はDNA、cDNA、RNA、mRNA、またはrRNAである。別の例において、その単位複製配列の検出のために、n個の細菌種由来の核酸が単離され、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅などにより増幅される。別の例において、試験パネルは、サンガーシーケンシングまたはピロシーケンシングを含む核酸シーケンシングを用いて、n個の細菌種の存在または非存在を同定する。核酸シーケンシングは、全DNAシーケンシング、または完全な16S rRNA遺伝子のシーケンシング、またはV6領域などの16S rRNA遺伝子の超可変領域のシーケンシングであり得る。
[0123] 別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物、または腸管マイクロフローラ内のタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーは、代謝産物またはタンパク質から決定される。
[0124] 本明細書に記載された方法が、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2、表3、表4、および/または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、肝硬変への進行のリスクを示す、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法を提供することは理解されるだろう。
[0125] 記載された技術および方法はまた、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象において非アルコール性脂肪肝(NAFL)を非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)から区別するためのアッセイ方法を提供する。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む。一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2、表3、表4、または表5に同定された少なくともn個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝(NAFL)を示す。
メタボローム分析
[0126] メタゲノムおよびメタボロームデータを用いる微生物機能の分析も行った。NAFLDにおける進行性線維症のメタゲノムから導かれた腸微生物叢プロファイルの妥当な機能を探索した。メタゲノムデータを用いて、2つの群に関連した微生物群集の機能的および代謝的潜在力を、試料におけるタンパク質ファミリーおよび酵素の相対存在量の定量化、ならびにアセンブルされたデータから生じた種のビンから再構築された経路の相対存在量によって、アセスメントした。これらのデータを、血清代謝物データと統合して、微生物代謝を評価した。
[0126] メタゲノムおよびメタボロームデータを用いる微生物機能の分析も行った。NAFLDにおける進行性線維症のメタゲノムから導かれた腸微生物叢プロファイルの妥当な機能を探索した。メタゲノムデータを用いて、2つの群に関連した微生物群集の機能的および代謝的潜在力を、試料におけるタンパク質ファミリーおよび酵素の相対存在量の定量化、ならびにアセンブルされたデータから生じた種のビンから再構築された経路の相対存在量によって、アセスメントした。これらのデータを、血清代謝物データと統合して、微生物代謝を評価した。
[0127] 血清試料中に検出された代謝物は、内因性、または微生物起源であるものを含む(Guo, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、112(35):E4901-E4910(2015))。微生物起源である可能性があるそれらの代謝物をさらに評価するために、56個の血清試料から検出された代謝物の完全セットを、糞便メタゲノムデータから再構築された微生物経路から予想される代謝物のセットと交差させた。この比較により、89個の代謝物が生じ、それは、宿主と微生物の両方により産生されることが知られた数個を含んだ。微分解析(differential analysis)により、存在量(ピーク強度)が、軽度/中等度NAFLD(G1)と進行性線維症(G2)との間で有意に異なる11個の代謝物が同定され(FDRおよびα=0.05について補正されたウィルコクソンの順位和)、これらの11個の代謝物は、下記の実施例1において表1.4に示されている。このセットにおいて、(ヌクレオシド代謝に関連した)2個の代謝物が、軽度/中等度NAFLD(G1)において豊富であり、一方、(アミノ酸および炭素の代謝に関連した)9個の代謝物が、進行性線維症(G2)において豊富であった。それの存在量の差異は統計学的に有意ではなかったが、進行性線維症(G2)において最も高い倍数で増加した代謝物は、嫌気性細菌により産生される代謝物である、3−フェニルプロパノエート(Wikoff, W.R.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、106(10):3698-3703(2009); Moss, C.W.ら、Appl. Microbiol.、19(2):375-8(1970))であった。
[0128] 軽度/中等度NAFLD(G1)および進行性線維症(G2)に渡っての存在量の差異が統計学的に有意である、経路もタンパク質ファミリーも酵素も同定されなかった(多重検定補正後)。しかしながら、経路存在量の調査は、進行性線維症(G2)が、炭素代謝および解毒に関連した経路の存在量の増加があり、一方、軽度/中等度NAFLD(G1)は、ヌクレオチドおよびステロイド分解と関連した経路の存在量の増加があったことを示した。これらの所見は図2に示されている。短鎖脂肪酸(SCFA)産生に関連したタンパク質ファミリーおよび酵素の評価は、軽度/中等度NAFLD(G1)が、乳酸、酢酸、およびギ酸に関連した酵素のより高い存在量を有し、一方、進行性線維症(G2)は、酪酸、D−乳酸、プロピオン酸、およびコハク酸についての酵素のより高い存在量を有することを示唆した(図2)。G1またはG2におけるエタノール代謝酵素の存在量についての傾向は、それほど明らかではなく、酵素EC 1.1.1.1(アルコールデヒドロゲナーゼ)がG2において増加し、一方、酵素EC 1.1.1.2(アルコールデヒドロゲナーゼNADP(+))がG1において増加した。
[0129] 以下の実施例は、本来、例証であり、決して、限定することを意図するものではない。
実施例1
ヒト腸微生物叢の分析
[0130] 生検診断によるNAFLDを有する86人の個体(女性56%)のコホートを以下の2つの群へ分類した:病期0〜2期線維症を有する72人の患者を有する群1は軽度/中等度NAFLDとして分類され、病期3〜4期線維症を有する14人の患者を有する群2は進行性NAFLDとして分類された。表1.1は、群1および群2における個体の概要を提供する。
ヒト腸微生物叢の分析
[0130] 生検診断によるNAFLDを有する86人の個体(女性56%)のコホートを以下の2つの群へ分類した:病期0〜2期線維症を有する72人の患者を有する群1は軽度/中等度NAFLDとして分類され、病期3〜4期線維症を有する14人の患者を有する群2は進行性NAFLDとして分類された。表1.1は、群1および群2における個体の概要を提供する。
[0131] 進行性線維症状態により分類された研究コホートにおける組織学的特徴および差異は、表1.2に示されている。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたない患者より重篤な小葉および門脈の炎症ならびに風船様膨化を有する可能性が高かった。
[0132] 群1および群2における個体由来の糞便試料を入手して、その試料の腸マイクロバイオーム組成を、以下のように、抽出されたDNAの全ゲノムショットガンシーケンシングを用いて決定した。
[0133] DNA抽出。溶解バッファー(20mM Tris-HCl pH8.0、2mM EDTAナトリウム、1.2% Triton X-100)3mL体積を、糞便試料0.5グラムに加え、試料をホモジナイズされるまでボルテックスした。ホモジナイズされた試料1.2mL体積およびプロテイナーゼK(Sigma Aldrich、PN. P2308)酵素15μLを、ガーネットビーズを含む1.5mLチューブ(Mo Bio PN. 12830-50-BT)へ分注した。その後、ビーズチューブを、65℃で10分間、その後、95℃で15分間、インキュベートした。その後、チューブをVortex Genie 2内に置いて、15分間、ビーズビーティングを実施し、続いて、試料をEppendorf遠心機5424において回転させた。その後、上清800μLをディープウェルブロックへ移し、DNAを抽出し、製造会社のプロトコールに従い、Chemagic MSM I(Perkin Elmer)を用いて精製した。その後、製造会社の使用説明書(Zymo Research PN. D6035)に従い、Zymo Onestep阻害剤除去キットを実施した。その後、DNA試料を、Eppendorf AF2200プレートリーダーにおいてQuant−iTを用いて定量化した。
[0134] ライブラリー調製およびシーケンシング。Nextera XTライブラリーを、製造会社のプロトコール(Illumina、PN. 15031942)に従って、手作業で調製した。簡単に述べれば、試料を、AF2200プレートリーダー(Eppendorf)上でQuant−iT picogreenアッセイシステム(Life Technologies、PN. Q33120)を用いて、ライブラリーあたり0.2ng/μL DNA材料へ正規化し、その後、タグ付き断片化(tagmentation)により、断片化し、タグ付けした。Veriti 96ウェルPCR(Applied Biosystems)により増幅を実施し、続いて、AMPure XPビーズクリーンアップ(Beckman Coulter、PN. A63880)を行った。全てのライブラリーについての断片サイズを、Labchip GX Touch Hi Sensを用いて測定した。シーケンシングを、Illumina HiSeq 2500上でSBSキットV4ケミストリーを用いて実施した。
[0135] メタゲノムデータアノテーション:マイクロバイオーム配列データを、Jones, M.B.ら、Proc Natl Acad Sci USA、112(45):14024〜14029(2015)に以前に記載されているように、処理した。アノテーションパイプラインは、試料中の構成微生物の相対的ゲノム存在量推定値、およびタンパク質ファミリー(COGs、Pfams、TIGRFAMs、およびEC)の相対存在量を生じた。アノテーション処理の一部として、各メタゲノム試料からのデータをまたアセンブリして、コンティグアセンブリを作製した。コンティグを、生物分類学に割り当て、種のビンへ組織化した。その後、アノテーション情報を用いて、経路ツール(Pathway Tool)(Karp, P.D.ら、Bioinformatics、18 補遺1:S225-S232.(2002))を用いるアセンブリされた種の代謝の再構築を行った。ORFを、MetaGeneを用いて、アセンブリされたデータおよびシングルトンリードから作成した。タンパク質ファミリーの相対存在量は、ORF存在量の合計である。経路の相対存在量は、その経路が再構築された全ての種の相対存在量の合計であると定義される。
[0136] ランダムフォレスト:ランダムフォレストアルゴリズムを以下の2つの目的のために用いた:1)肝線維症の微生物シグネチャーのモデルを作ること;および2)肝線維症の進行に最も大きく寄与し得る重要な種を選択すること。フィーチャとも呼ばれる、種の相対存在量および患者データを、R(Breiman, L. Machine learning 45、no. 1、5-32(2001); Liaw, A.ら、R news 2、no. 3、18-22(2002))におけるランダムフォレストパッケージを用いて解析した。フォレストは、各試料の予測される結果が期待される結果と同じであるように、フォレストにおける各木が、1セットのランダムに選ばれたフィーチャについて理想的なスプリットを見出す、教師あり学習により訓練される。フォレストにおける木ごとにより見出されるデータ分割が、試料の予測される全体的な結果を票決するために用いられる。ランダムフォレストの投票戦略は、各木によるフィーチャのランダムサンプリングによりデータのオーバーフィッティングを回避すると文献で立証されている。結果を票決するためにあらゆる木を用いることは、データを記憶した可能性がある任意の単一の木が支配的な予測をするのを防ぐ。
[0137] 結果は、疾患または疾患なしである。AUC、または受診者動作特性曲線下面積は、訓練されたフォレストの精度を測定した。AUCは、真陽性予測率および偽陽性予測率の広く用いられている推定量である。最高AUCを有するそれらのフォレストからの変数または種重要度リストを、さらなる解析のために選択した。
[0138] 訓練データ:データセットは、登録コホートにおける患者から収集された86個の糞便試料中に検出された試料多様性、試料豊富度、および種の相対ゲノム存在量からなった。各患者の年齢、性別、人種、およびBMIもまた訓練セットに含まれた。この研究について、個体を、線維症の重症度に基づいて2つの群へカテゴリー化した。個体の第1の群(群1)は、線維症をもたず(病期0期)、または軽度/中等度の線維症(病期1期および2期)を有した。第2の群(群2)は、肝臓が生検によってそれらの線維症の進行期(病期3期および4期)を確認された患者からなった。大部分の患者(72人)は、群1であり、14人の患者は、群2に属した。線維症の異なる病期に関しての患者プロフィール、年齢、人種、BMI、および性別が表1.1に示されている。相対存在量データに存在する可能性があるノイズのレベルを低減させるために、10−4未満である存在量はゼロに設定され、種は、患者糞便試料の70%より多くにおいて存在しなければならない。
[0139] 階層的クラスタリング:相関したデータが訓練に生じ得る効果を低減させるために、存在量データをさらに、階層的クラスタリングによりフィルタリングした。Rにおけるcor関数を用いて、種存在量データからスピアマン相関係数を計算した。相関行列を非類似度行列へ変換し、その後、非類似度行列の完全連結クラスタリングについてhclust関数を用いた。corおよびhclust関数は、R STATSパッケージの一部である。クラスタリングから生じた木を、0.1の高さでカットし、クラスター内の全ての他の種に最も近い種を、そのクラスターを代表する種として選んだ。この手順を、152個の種の最初のセットに適用した場合、それは、136個の代表種を生じ、それらを、その後、訓練段階に用いた。作成された種クラスターのリストは表1.3に示されている。
[0140] ランダムフォレストの最初の訓練:AUCとして報告される、分類の最良全体的精度を有するランダムフォレストを訓練する一連の工程が開発された。それぞれ1001個の木を含有する300個のフォレストが、前に記載されているように、存在量および普及率のフィルタリングを通過した種の相対ゲノム存在量を用いて訓練された。加えて、各試料のシャノン多様性指数および豊富度、ならびに各患者の年齢、BMI、性別、および人種もまた、訓練セット内に含まれた。群1と比較して群2における患者の少ない数のため、各群由来の同数の試料からのフィーチャがランダムにサンプリングされ、各木を訓練するために用いられる、層化サンプリングで訓練を行った。訓練されたフォレストは、ジニ係数の平均減少量に基づいた変数重要度リストを生じる。データセットについて、変数重要度リストは、あらゆる試料の正しい分類もしくは正しい群割当に最も多く寄与した、種、試料指数、または患者測定値のリストである。最高AUCを有するフォレストからの種重要度リストが、(下に記載された)反復フィーチャ削除(Iterative Feature Elimination)のために選択された。この工程における訓練されたフォレストの性能の有意性を決定するために、並べ替えクラス値を用いた追加の10,000個のフォレストが訓練されるモンテカルロシミュレーションを用いた。
[0141] 反復フィーチャ削除(IFE)およびフォレスト/フィーチャ選択:前のセクションに記載されたフィーチャ重要度リストからのフィーチャ(種、試料指数、および患者データ)を、試料分類の最高全体的精度を有するフォレストを訓練する1セットのフィーチャを見出すために反復的に削除した。フィーチャ重要度リストを、ジニ係数の平均減少量の最高から最低へ順序づけ、重要度の最も低い種を除去した。ランダムフォレストを、フィーチャ重要度リストにおける残りのフィーチャで訓練し、AUCを計算する。重要度の最も低いフィーチャを除去すること、フォレストを残りのフィーチャで訓練すること、およびAUCを計算することを、重要度リストからフィーチャの全部が除去されるまで、続けた。最高AUCを有するフォレストを訓練するために用いられたフィーチャを、最終のフィーチャ重要度リストとして用いた。最高AUCを有する2つ以上のフォレストがある場合、フィーチャの数が最も多いフォレストを選んだ。フィーチャ削除工程後、最高AUCを有するフォレストを訓練した種が、最終モデルにおいて報告される。
[0142] 種選択の有意性:最終の種重要度リストの有意性を決定するために、モンテカルロシミュレーションアプローチが用いられ、ランダムに選ばれたフィーチャにおいて訓練されたフォレストからのAUCのゼロ分布が作成された。ランダムに選ばれたフィーチャの数は、前のセクションで記載されているような反復フィーチャ削除工程により見出されたフィーチャの数と同じである。AUCを、ランダムに選択されたフィーチャにおいて訓練された10,000個のフォレストについて計算し、それを用いて、ゼロ分布を形成し、反復フィーチャ削除により選択された上位フィーチャ(IFEフィーチャ)の有意性に対して比較した。IFEフィーチャに関連したp値は、ランダムに選択されたフィーチャのセットにおいて訓練されたフォレストのAUCが、IFEフィーチャにより訓練されたフォレストのAUCより高い、回数の率である。
[0143] 線形サポートベクターマシン:線形サポートベクターマシン(線形SVM)が以下の2つの手順のために用いられる:(1)フィーチャ選択、すなわち、重要な患者データおよび微生物種の選択、ならびに(2)選択されたフィーチャでの分類器訓練。フィーチャ選択は、L1ノルム正則化を用いて行われ、分類器訓練は、L2ノルム正則化を用いて行われる。線形SVMのために用いられるデータセットは、ランダムフォレスト分類についてと同じである。軽度/中等度線維症を有する群1は、クラスラベル「−1」に割り当てられ、進行性線維症を有する群2は、クラスラベル「1」に割り当てられた。フィーチャセットは、性別、年齢、BMI、人種(白人、アジア人、ヒスパニック)を含み、かつメタデータと呼ばれる患者データ、および登録コホートにおいて86個の試料の70%より多くに存在する微生物種からなる。線形SVMモジュールsklearn.svm。Pythonからの線形SVMが適用され、最良推定量パラメータを選び出すために、2−5〜25の範囲でのペナルティパラメータCについてのグリッド検索が実施された。層別2倍クロスバリデーションが用いられ、訓練および試験データセットが設定された。スコアリング方法としてROC−AUCが用いられ、試験データセットに関する分類器の精度が評価された。
[0144] L1ノルムでのフィーチャ選択:L1ノルムペナルティを有する線形SVMを、数値メタデータ(年齢、BMI)、バイナリメタデータ(女性、ヒスパニック、アジア人、白人)、および152個の微生物種のログ変換相対存在量を含有するフィーチャセットにおけるフィーチャ選択のために用いた。L1正則化下で非ゼロ係数を有する24個のフィーチャが選択され、4個のメタデータ(年齢、女性、アジア人、ヒスパニック)および20個の微生物種を含む。これらの選択されたフィーチャを、線形SVM分類器の次の工程の訓練のための新しいフィーチャセットとして用いた。
[0145] SVM選択されたフィーチャセットの有意性:選択されたフィーチャのセットの有意性を決定するために、ROC−AUCスコアのゼロ分布を、以下の手順で作成した:(1)152個の種のリストから20個の微生物種をランダムに選ぶ、(2)4個のメタデータと20個のランダムな微生物種を新しいフィーチャセットとして組み合わせる、(3)その新しいフィーチャセットを用いて、L2ノルムを有する線形SVMを訓練する、(4)層別2倍クロスバリデーションを用いてAUCを計算する、(5)ランダムな種選択を10,000回、繰り返して、ゼロ分布を形成する。p値は、選択されたフィーチャセットのAUCをゼロ分布と比較することにより得られた(データ未呈示)。
[0146] 生検診断によるNAFLDコホートにおけるRFモデルとSVMモデルの一致:訓練されたSVMは予測子として18個の種を選択し(表3)、それらの種のうち12個が、ランダムフォレスト方法により選択された種と重複した(表3において太字フォントにより識別され、表4に示されている)。
[0147] 相対存在量における差異についての統計学的検定:ウィルコクソン順位和検定を用いて、存在量の差異をアセスメントした。適切な場合、多重検定補正を用い、検定を、0.05の有意レベルでのfalse discovery rateについて制御した。
[0148] 年齢均衡のとれたデータセット:生検診断による登録コホート(コホートA、86人の患者)からの線維症の進行期(病期3期および4期)における全ての患者は、60歳以上であった。年齢における歪みは、より幅広い範囲の年齢が病期0期、1期、または2期のいずれかである患者について観察されたように群1における患者についての極値ではなかった。進行性線維症を有する患者についての年齢の観察された歪みに対処するために、複数のコホートから全員が60歳以上である患者の、コホートBと呼ばれる、第2のコホートを作成した。コホートBにおける49人の患者は、コホートAからの31人の患者、双子のコホートからの16人の健康な患者(各ペアからの単一の双子)、および家族性硬変研究からの2人の生検診断による硬変患者からなる。
[0149] 代謝物プロファイル:血清試料のメタボロンの質量分析に基づいた代謝プロファイリングを用いて、代謝物を同定した(Guo, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、112(35):E4901-E4910(2015))。56人の個体(群1由来の50人および群2由来の6人)由来の血清試料を用いて、代謝物プロファイルを作成した。有意な代謝物およびそれらのp値は表1.4に示されている。
[0150] いくつかの例示的な態様および実施形態は上記で論じられているが、当業者は、それらのある特定の改変、並べ替え、付加、およびサブコンビネーションを認識しているだろう。したがって、以下の添付された特許請求の範囲、および今後、導入される特許請求の範囲は、全てのそのような改変、並べ替え、付加、およびサブコンビネーションを、それらの真の精神および範囲内であるとして含まれると解釈されることが意図される。
Claims (38)
- 対象における、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法であって、
対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャー(microbiome signature)を決定する工程、および
腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在もしくは非存在を検出する工程、または
腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表2に同定された少なくともn個の細菌種がシグネチャーに存在するか、存在しないかを決定する工程であって、nが少なくとも2であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表2に同定された少なくともn個の細菌種の存在もしくは非存在が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を示す、工程を含む、方法。 - 分析する工程が、表2に同定された少なくともn個の細菌種を検出する試験パネルに生物学的試料を適用することを含み、nが少なくとも2である、請求項1に記載の方法。
- 分析する工程が、表2に同定された少なくともn個の細菌種の存在または非存在により腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 参照腸管マイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症を有さない対象の集団から得られる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- 参照腸管マイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症を有する対象の集団から得られる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- 対象の集団が進行性肝線維症を有する、請求項5に記載の方法。
- 腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に基づいて決定される、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的試料を分析する工程が、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される試料を分析することを含む、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- 精査する工程に基づいて、肝線維症の病期が決定される、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 精査する工程に基づいて、進行性線維症の病期が決定される、請求項9に記載の方法。
- nが、約1〜30、約1〜25、約5〜30、約5〜25、約10〜30、および約10〜25からなる群から選択される、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- nが、二(2)より大きい、三(3)より大きい、四(4)より大きい、五(5)より大きい、六(6)より大きい、七(7)より大きい、八(8)より大きい、九(9)より大きい、十(10)より大きい、十一(11)より大きい、十二(12)より大きい、十三(13)より大きい、十四(14)より大きい、十五(15)より大きい、十六(16)より大きい、十七(17)より大きい、十八(18)より大きい、十九(19)より大きい、および二十(20)より大きい数からなる群から選択される、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- nが、少なくとも8であり、かつA群における細菌種(Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae)で構成される、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- A群細菌種で構成された腸管マイクロバイオームシグネチャーが、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるA群細菌種の相対存在量の少なくとも2倍のシグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する、請求項13に記載の方法。
- nが、少なくとも9であり、追加として、B群における細菌種(Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis)の1個または複数を含む、請求項13または14に記載の方法。
- 腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるB群細菌種の相対存在量の多くとも2分の1の相対存在量を有する、請求項15に記載の方法。
- nが、C群における細菌種(gathobacter rectalis (Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8)で構成される、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるC群細菌種が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるC群細菌種の相対存在量の多くとも2分の1の相対存在量を有する、請求項17に記載の方法。
- 分析する工程が、表2に示された1個または複数の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて、生物学的試料を分析すること含む、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 核酸が、DNA、cDNA、RNA、mRNA、またはrRNAである、請求項13に記載の方法。
- 分析する工程が、核酸増幅技術を用いて生物学的試料を分析することを含む、請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅技術が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応から選択される、請求項21に記載の方法。
- 核酸増幅技術が等温核酸増幅技術である、請求項21に記載の方法。
- 分析する工程が、核酸シーケンシングを用いて生物学的試料を分析することを含む、請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 核酸シーケンシングが、メタゲノムDNAシーケンシング、または16S rRNA遺伝子のシーケンシングを含む、請求項24に記載の方法。
- 核酸シーケンシングが、次世代シーケンシングまたはサンガーシーケンシングによるDNAシーケンシングを含む、請求項24に記載の方法。
- 次世代シーケンシングが、ピロシーケンシング、合成によるシーケンシング、イオン半導体によるシーケンシング、またはライゲーションによるシーケンシングを含む、請求項26に記載の方法。
- 分析する工程が、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、免疫学的アッセイ、および培養に基づいたアッセイから選択される方法を用いて分析することを含む、請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 対象における非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の型の鑑別診断のための方法であって、
対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期3〜4期線維症の診断が、以下の基準:
(a)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteaeからなる群(A群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;
(b)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2−50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformisからなる群(B群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;
(c)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Agathobacter rectalis(Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter(属)、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8からなる群(C群)から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー;ならびに
(d)(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、および(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、かつ(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量と(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きい、腸管マイクロバイオームシグネチャー
の1つまたは複数により示される、工程を含む、方法。 - 病期3〜4期線維症の診断が、(a)と(b)の両方、(a)と(c)の両方、(a)と(d)の両方、(b)と(c)の両方、または(b)と(d)の両方により示される、請求項29に記載の方法。
- 病期3〜4期線維症の診断が、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも2倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種の存在量を有する、(a)に列挙された細菌種の少なくとも2個により示される、請求項29に記載の方法。
- 病期3〜4期線維症の診断が、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも2分の1である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、(b)または(c)に列挙された細菌種の少なくとも2個により示される、請求項29に記載の方法。
- 病期3〜4期線維症の診断が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも2分の1である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Oscillibacter_sp._CAG.241、Firmicutes_bacterium_CAG.129、Firmicutes_bacterium_CAG.170、Ruminococcus_obeum、Bacteroides_pectinophilus、Holdemania_filiformis、およびFirmicutes_bacterium_CAG.83からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 病期3〜4期線維症の診断が、参照マイクロバイオームに対する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるE. coliの存在量の増加により追加して示される、請求項29に記載の方法。
- 腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法であって、
表2に同定された少なくともn個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、nが少なくとも2であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2に同定された少なくともn個の細菌種の存在が肝硬変への進行のリスクを示す、工程;または
(i)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量より少なくとも2倍である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、および(ii)参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2中の少なくとも2個の細菌種の相対存在量より多くとも2分の1である同じ少なくとも2個の細菌種の相対存在量、ならびに(iii)(i)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量および(ii)における少なくとも2個の細菌種のジニ係数の平均減少量を、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから決定する工程であって、ジニ係数の平均減少量の合計が0.5より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示される、工程
を含む、方法。 - 腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表2に同定された少なくともn個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝(NAFL)を示す、請求項1または35に記載の方法。
- 腸管マイクロバイオームシグネチャーが、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物または腸管マイクロフローラにおけるタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーが、代謝産物またはタンパク質から決定される、請求項35に記載の方法。
- 決定する工程または精査する工程が、ノンパラメトリック多変量解析、ランダムフォレスト解析、サポートベクターマシン、相関ネットワーク解析、相関差異ネットワーク解析、ベイズモデル、線形モデル、および教師あり機械学習ツールからなる群から選択される方法論の使用を含む、請求項1から37までのいずれか一項に記載の方法。
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