CN110751985B - 与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物 - Google Patents

与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物。所述标记物分别为Barnesiella属中的Barnesiella viscericola菌种和Bacteroides属中的Bacteroides sp.AF14‑46菌种。该标记物在体重高的鸡只肠道中显著富集，参与鸡只能量代谢等功能，为饲料微生态制剂的研发提供了参考，另外也可用于鸡只体重发育潜力的预测。

Description

与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物
技术领域
本发明涉及微生物标记物领域，尤其是涉及一种与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物。
背景技术
在养鸡产业中，个体体重大小是重要的经济指标之一，因此确定与体重关联的生物学标记物有重大的经济意义。有研究围绕鸡体重性状，尝试寻找与其显著关联的基因组变异位点作为生物标记物，能辅助选择大体重发育潜能的鸡只，但选择结果并不理想，其主要原因是体重是复杂性状，很难用少数位点进行解释。
近些年发现肠道微生物群落的多样性、组成、功能方面与宿主体重和机体代谢有很强的相关性。肠道微生物帮助宿主消化食物，对宿主的体重等表型有直接的影响。研究发现，肥胖者体内含有的肠道微生物物种多样性明显低于瘦的个体体内的肠道微生物物种多样性，某些特殊生物分类级别的微生物及功能基因组成也显著不同，并且根据肠道微生物的偏好性就可以把肥胖的、瘦的动物个体分离开，并且鉴别准确性可达到90％。另外，也发现肠道微生物也作为标记物，应用于直肠癌等病证的鉴别。
综上所述，将特定参与机体能量代谢的肠道微生物作为与鸡体重高度关联的标记物，具有较高的可行性。在未来，该微生物可为研发微生态添加饲料提供参考，也可能用于鸡只体重发育潜能预测。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物，所述肠道微生物标记物包括Barnesiella viscericola菌种(维塞科拉菌种)。
Barnesiella viscericola菌种属于Barnesiella属。
Barnesiella viscericola菌种的具体分类学特征为：Bacteria；FCB group；Bacteroidetes；Bacteroidia；Bacteroidales；Barnesiellaceae；Barnesiella；Barnesiella viscericola(细菌界；鞘脂杆菌亚界；拟杆菌门；拟杆菌科；拟杆菌目；拟杆菌纲；巴恩斯氏菌属；维塞科拉菌种)。
Barnesiella viscericola菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
一种与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物，所述肠道微生物标记物包括Bacteroides sp.AF14-46菌种(拟杆菌种AF14-46)。
Bacteroides sp.AF14-46菌种属于Bacteroides属。
Bacteroides sp.AF14-46菌种的具体分类学特征为：Bacteria；FCB group；Bacteroidetes；Bacteroidetes；Bacteroidia；Bacteroidales；Bacteroidaceae；Bacteroides；Bacteroides sp.AF14-46(细菌界；鞘脂杆菌亚界；拟杆菌门；拟杆菌科；拟杆菌目；拟杆菌纲；拟杆菌属；拟杆菌种AF14-46)。
Bacteroides sp.AF14-46菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
所述与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：
1)以白洛克鸡为共同祖先，以56日龄的体重高低为目标进行长期人工差异选择，保证体重这一饲养条件以及饲养环境都保持一致，以获得单一性状差异，在选择了56个世代后，获得的大体重家系鸡只的体重平均是小体重家系体重的十倍之多(该模型为世界著名体重双向选择家系模型，Lillie M等人，Genomic signatures of 60years ofbidirectional selection for 8-week body weight in chickens[J].Poultryscience,2017,97(3):781-790)；
2)收集两种家系鸡肠道微生物样品，用试剂盒(TIANGEN DNA stool mini kit)提取肠道中微生物DNA，得到肠道微生物基因组DNA；
3)构建DNA文库后进行宏基因组测序；
4)分析鉴定小体重家系鸡只与大体重家系鸡只的肠道微生物物种及各物种丰度；
过滤原始序列中低质量序列，随后将序列与NCBI NR数据库中菌群序列进行比对，得到每个样品中各肠道微生物的物种的序列与丰度；
5)肠道微生物筛选
按照步骤2)-4)所述的方法测得大体重重家系鸡只及小体重家系鸡只体内肠道微生物种丰度，通过比较，得到大体重家系鸡只中显著差异的高丰度肠道细菌Barnesiellaviscericola菌和Bacteroides属中的Bacteroides sp.AF14-46菌。
其中，过滤原始序列中低质量序列是指从reads的5'端开始，进行4个碱基的滑窗质量检测，切除碱基质量平均值低于2的滑窗；切除首末端碱基质量小于2的碱基；过滤碱基数小于25的碱基。
Barnesiella viscericola菌的P值＝0.00014，Bacteroides sp.AF14-46菌的P值＝0.00037。
步骤5)所述比较的方法是：不同分类水平的微生物在不同分组之间的丰度差异，用STAMP软件(v2.1.3)计算两组间丰度差异，该软件鉴定关键标记物的原理是：利用Welch’Test方法去筛选关键的微生物。检验结果中如一种微生物的矫正P值<0.01，则该微生物被判别为在两组中的分布有显著性差异，最后筛选出在大体重鸡只中高丰度的且差异最为显著的两种细菌作为标记物。
另外需要指出的是，得到的菌群丰度表一般显示为微生物的绝对值丰度，因此，进行比较时，需要对数据进行标准化，采用的方法是将绝对丰度换算为相对丰度再进行差异分析。
通过检测本发明所述标记物的丰度可有效鉴别出体重高的鸡只。
与现有技术相比，本本发明利用大体重鸡只肠道内异于小体重鸡只肠道微生物组成，通过筛选出能够用于协助判断鸡体重发育潜能的生物学标记物，所述标记物可以帮助和简化鸡只筛选的准确性，增加畜牧收益。该标记物在体重高的鸡只肠道中显著富集，参与鸡只能量代谢等功能，为饲料微生态制剂的研发提供了参考，另外也可用于鸡只体重发育潜力的预测。
附图说明
图1：Barnesiella viscericola菌种在大、小体重家系肠道中的丰度，H和L分别指大、小体重家系鸡只。
图2：Bacteroides sp.AF14-46菌种在大小体重家系肠道中的丰度，H和L分别指大、小体重家系鸡只。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1)以白洛克鸡为共同祖先，以56日龄的体重高低为目标进行长期人工差异选择，保证体重这一饲养条件以及饲养环境等都保持一致，以获得单一性状差异，在选择了56个世代后，获得的大体重家系鸡只的体重平均是小体重家系体重的十倍之多，选取长期选育的大小体重家系鸡只各10只，各包含公母鸡各5只(大体重公鸡1976±193g；大体重母鸡1598±166g；小体重公鸡174±46g；小体重母鸡128±37g)，小体重鸡只具有明显的厌食行为，取得肠道样本后提取肠道菌群DNA，具体步骤如下：微生物DNA提取严格按照产品试剂盒(TIANGEN DNA stool mini kit)说明书进行。提取微生物DNA后，用Nanodrop对DNA进行质量检测。DNA的OD值(260/280)为1.8-2.0左右且DNA浓度大于40ng/μl的样本符合本实验的DNA质量要求。然后，用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，将合适条带的DNA样本放入-20℃冰箱中保存，以备后续实验。
2)DNA文库构建和测序
DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳进行简单纯化实验。首先利用1％琼脂糖凝胶电泳检测检测肠道微生物DNA，随后将检测合格的微生物基因组DNA样品使用超声波样品处理系统随机打断，随后进行建库。测序得到的原始数据以双端(Paired-end)FASTQ格式保存(Read1和Read 2序列一一对应)，随后应用传统的trimmomatic软件(v0.32)将低质量的序列过滤删除，为了避免宿主基因组的污染，删除宿主基因组的序列。
3)基于宏基因组测序数据的微生物功能注释
质控后，将序列进行拼接合并，生成非冗余基因组集。同时利用Diamond软件(v4.4.0)将拼接的序列比对到NR数据库以获得肠道微生物组的组成和丰度。参数设置为序列全注释，e-value大于1e-5的序列截断、序列识别度小于90％的序列、以及氨基酸的注释长度最低为20的序列删除。得到微生物丰度后，进行数据标准化。用STAMP软件(v2.1.3)对各功能通路的标准化后的丰度数据进行大体重家系与小体重家系间差异分析，软件内置检验方法为两侧Welch’s t检验和benjamin-hochberg FDR校正。
4)根据比较分析的结果，证实了Barnesiella viscericola菌种(P值＝0.00014)和Bacteroides sp.AF14-46菌种(P值＝0.00037)在大体重鸡只中丰度显著高于小体重鸡只，如图1、图2所示。
实施例2
1)数据集建立
选择小体重鸡家系和大体重鸡家系分析所获丰度差异的肠道微生物，去除冗余或与不相关的肠道微生物；将总样本数的2/3作为训练集，总样本数的1/3作为验证集，将数据导入R语言软件(v3.6.1)，利用randomforest包(v4.6)构建随机森林模型。
2)训练模型并验证
将验证集导入构建的随机森林模型，发现预测错误率为零，说明模型可靠。将参与模型构建的重要变量菌导出。发现Barnesiella viscericola菌种和Bacteroidessp.AF14-46菌种的MeanDecreaseGini值(对模型分类效应准确度的影响值)较大，分别是0.08和0.06，该两种菌可作为标记物用于大体重和小体重鸡的分类。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1363
<212> DNA
<213> Barnesiella viscericola
<400> 1
tcaggatgaa cgctagcgac aggcctaaca catgcaagtc gaggggcagc gcggaggtag 60
caatacttct ggcggcgacc ggcgcacggg tgagtaacac gtatgcaatc tgcctgtaac 120
agggggataa cccggagaaa tccggcctaa taccccataa cgacatatct tcgcatgggg 180
agatgtctaa agagagcaat cttggttaca gatgagcatg cggtccatta gccagttggc 240
ggggtaacgg cccaccaaag cgacgatgga taggggttct gagaggaagg tcccccacat 300
tggaactgag acacggtcca aactcctacg ggaggcagca gtgaggaata ttggtcaatg 360
gtcggcagac tgaaccagcc aagtcgcgtg aaggaagacg gccctacggg ttgtaaactt 420
cttttgtcgg agagtaaagt gcgctacgcg tagcgtattg caagtatccg aagaaaaagc 480
atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg atgcgagcgt tatccggatt 540
tattgggttt aaagggtgcg taggcggcac gccaagtcag cggtgaaatg cccgggctta 600
acccgggagc tgccgttgaa actgcgagct agcgtgcaca agaggcaggc ggaatgcgtg 660
gtgtagcggt gaaatgcata gatatcacgc agaaccccga ttgcgaaggc agcctgctag 720
ggtgcaacgg acgctgaggc acgaaagcgt ggggatcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccacgcag taaacgatga atactaactg tttgcgatat aatgtaagcg gtacagcgaa 840
agcgttaagt attccacctg gggagtacgc cggcaacggt gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag gaaccttacc 960
cgggctcaaa cgcaggggga atatgggtga aagtccatag ccagcaatgg tcgcctgcga 1020
ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg ccataacgag 1080
cgcaacccta ttgacagtta ctaacgggtc aagccgagga ctctgtcgag actgccggcg 1140
caagccgcga ggaaggtggg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacgt ccggggcgac 1200
acacgtgtta caatggcagg tacagaaggc agccagtcag caatgacgcg cgaatcccga 1260
aaacctgtct cagttcggat tggagtctgc aactcgactc catgaagctg gattcgctag 1320
taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaat acgttcccgg gcc 1363
<210> 2
<211> 686
<212> DNA
<213> Bacteroides sp. AF14-46
<400> 2
aatgaatccg tgtcggcatc ataacagttg ccgaaataat atttcagggc ttctagttgc 60
tccctgtcga tgcggtccgc cttgtattcg ttggcgtcga cctggtaata gaccgcttcg 120
gcacctttcc ggatacgctt cacctgtttg gggtgtccgg ccatccagta gacggaacgg 180
atggcgaaaa ccaccacaca acctgcggca tacatcagca gctgttcata gcggagggtg 240
ttgtcttccg aatcgaccat gacggcccgt tggatgcgca gcagattatg cagnnnnnnn 300
nnntggatgc gcagcagatt atgcagcccc tcgttatcca aggcataaat cttcagcccg 360
acacgttctt cttcgtgcat cattgtcagc gagtagccga atatatgttt cagcccggta 420
ttggcgcact ccttctgaag gttcagcgtg gcggccattg tattgcggtc gcagatgccg 480
acagccgtat gcccgagcca tttcgccttg cggcacaaat cttccggcga gcagcaggcg 540
ttcagcagct cgtaggaggt atggatgccg aggttcacga aaggtacatc atgtaccgga 600
ggcttgggcc ggccgatata tttcagcagg ttgaaacgga attcttcccg caggtcatag 660
tagtaccagt tcctgccgaa cgggaa 686

Claims (4)

1.一种肠道微生物作为与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物的应用，其特征在于，所述肠道微生物为Barnesiella viscericola菌种；
Barnesiella viscericola菌种的具体分类学特征为：Bacteria;FCB group;Bacteroidetes/ Chlorobi group;Bacteroidetes;Bacteroidia;Bacteroidales;Barnesiellaceae; Barnesiella;Barnesiella viscericola，Barnesiella viscericola菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
其中，大体重公鸡的质量为1976±193g之间；大体重母鸡的质量为1598±166g之间；小体重公鸡的质量为174±46g之间；小体重母鸡的质量为128±37g之间。
2.一种肠道微生物作为与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物的应用，其特征在于，所述肠道微生物标记物为Bacteroides sp. AF14-46 菌种，Bacteroides sp. AF14-46菌种的具体分类学特征为：Bacteria;FCB group;Bacteroidetes;Bacteroidia;Bacteroidales; Barnesiellaceae; Barnesiella;Barnesiella viscericola，Bacteroides sp. AF14-46 菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
其中，大体重公鸡的质量为1976±193g；大体重母鸡的质量为1598±166g；小体重公鸡的质量为174±46g；小体重母鸡的质量为128±37g。
3.根据权利要求1或2所述一种肠道微生物作为与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物的应用，其特征在于，所述肠道微生物的筛选方法包括以下步骤：
1）以白洛克鸡为共同祖先，以 56 日龄的体重高低为目标进行长期人工差异选择，保证体重这一饲养条件以及饲养环境都保持一致，以获得单一性状差异，在选择了 56 个世代后，获得的大体重家系鸡只的体重平均是小体重家系体重的十倍之多；
2）收集两种家系鸡肠道微生物样品，用试剂盒提取肠道中微生物DNA，得到肠道微生物基因组DNA；
3) 构建DNA文库后进行宏基因组测序；
4) 分析鉴定小体重家系鸡只与大体重家系鸡只的肠道微生物物种及各物种丰度；
过滤原始序列中低质量序列，随后将序列与NCBI NR数据库中菌群序列进行比对，得到每个样品中各肠道微生物的物种的序列与丰度；
5)肠道微生物筛选
按照步骤2)-4)所述的方法测得大体重重家系鸡只及小体重家系鸡只体内肠道微生物种丰度，通过比较，得到大体重家系鸡只中显著差异的高丰度肠道细菌Barnesiellaviscericola菌和Bacteroides属中的Bacteroides sp. AF14-46 菌；
其中，过滤原始序列中低质量序列是指从 reads 的 5' 端开始，进行4个碱基的滑窗质量检测，切除碱基质量平均值低于2的滑窗；切除首末端碱基质量小于2的碱基；过滤碱基数小于25的碱基；
Barnesiella viscericola菌的P值= 0.00014，Bacteroides sp. AF14-46菌的P值=0.00037；
步骤5)所述比较的方法是：
不同分类水平的微生物在不同分组之间的丰度差异，用STAMP软件计算两组间丰度差异，检验结果中如一种微生物的矫正P值<0.01，则该微生物被判别为在两组中的分布有显著性差异，最后筛选出在大体重鸡只中高丰度的且差异最为显著的两种细菌作为标记物。
4.根据权利要求3所述一种肠道微生物作为与大体重鸡只高度关联的肠道微生物标记物的应用，其特征在于，用STAMP软件计算两组间丰度差异时，对数据进行标准化，采用的方法是将绝对丰度换算为相对丰度再进行差异分析。
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