CN107541544A

CN107541544A - 用于确定微生物分布谱的方法、系统、试剂盒、用途和组合物

Info

Publication number: CN107541544A
Application number: CN201610526143.5A
Authority: CN
Inventors: 李响; 刘晓东
Original assignee: Coyote Bioscience Co Ltd
Current assignee: Coyote Bioscience Co Ltd
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2018-01-05

Abstract

本公开内容提供了一种确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的方法、系统、试剂盒、用途和组合物。

Description

用于确定微生物分布谱的方法、系统、试剂盒、用途和组合物

交叉引用

本申请要求2016年6月27日提交的中国专利申请201610481965.6的权益，该申请通过引用将其全部内容并入本文。

背景技术

微生物，包括细菌、真菌、原生生物、古菌和病毒，遍布于几乎一切环境中。微生物个体微小，种类繁多，与人类日常生活关系密切，并在产业中得到广泛利用，例如，食品、健康和环保产业。许多微生物与人体的健康状态以及疾病发生密切相关。另外，对微生物的研究对现代生物学技术和理论的进步起到了非常关键的作用。

大肠癌(亦称作结肠癌、直肠癌、或结肠直肠癌)是发生于大肠(包括结肠和直肠)的恶性肿瘤。大肠癌的发病与许多因素相关，包括年龄、生活习惯、以及家族病史等等。一些大肠癌的风险因素包括饮食、肥胖、抽烟、缺乏体育锻炼、炎性肠病、结肠直肠息肉等等。仅2012年，全球即有一百四十万人诊断出患有大肠癌，并且有六十九万四千人死于该病。对于该病的早期诊断和预后对经济和健康方面均具有重大影响。然而，目前通常用于早期诊断该病的技术，如指检、结肠镜、X-光灌肠等，无论从金钱和时间成本，还是患者的顺应性方面均较差，成为了制约早期诊断大肠癌的重要因素。

发明内容

在上述背景下，需要能够迅速、非侵入地鉴定来自受试者样品，判断受试者罹患大肠癌的风险，或罹患大肠癌的受试者的预后的技术。

在一个方面，本发明提供了一种确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的方法，其包括：

1)对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度，从而获得所述生物样品的微生物分布谱；

2)将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考微生物分布谱相比较，确定与所述生物样品的微生物分布谱差异在预定的阈值之内的所有候选参考微生物分布谱；以及

3)根据2)中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，3)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

在一些实施方案中，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱。

在一些实施方案中，当2)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记。

在一些实施方案中，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记。

在一些实施方案中，所述生物样品来自受试者。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述生物样品包括活体组织、全血、血清、血浆、粘膜、唾液、拭子、尿、粪便、细胞、组织、淋巴液、CNS液和病变渗出物或其组合。

在一些实施方案中，所述粘膜是胃粘膜。

在一些实施方案中，所述拭子是直肠拭子。

在一些实施方案中，所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

在一些实施方案中，所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

在一些实施方案中，所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

在一些实施方案中，所述参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史、疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

在一些实施方案中，所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述病史为癌症病史。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

在一些实施方案中，所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

在一些实施方案中，所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

在一些实施方案中，所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后。

在一些实施方案中，所述诊断包括诊断所述受试者是否罹患所述癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户。

在另一个方面，本发明提供了一种确定受试者健康状况的方法，其包括：

1)从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含多种微生物；

2)对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度，从而获得所述上到样品的微生物分布谱；

3)将所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱进行比较，以确定受试者的健康状况。

在一些实施方案中，所述正常生物样品来自健康状况正常或被认为正常的个体。

在一些实施方案中，所述正常生物样品来自当处于正常的或被认为正常的健康状况的所述受试者自身。

在一些实施方案中，所述正常生物样品的参考微生物分布谱是根据来自多个健康状况正常或被认为正常的个体的生物样品的微生物分布谱通过统计方法获得的。

在一些实施方案中，当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常。

在一些实施方案中，当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常。

在一些实施方案中，所述生物样品为胃肠道样品。

在一些实施方案中，所述胃肠道样品选自下组：粪便、活体组织、胃粘膜、直肠拭子，或其组合。

在一些实施方案中，当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常。

在一些实施方案中，当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常。

在一些实施方案中，所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌的风险。

在一些实施方案中，所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌。

3)将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考生物样品的参考微生物分布谱进行比较。

4)根据3)中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，所述参数值的集合包括一个或多个特征参数值和一个或多个诊断参数值，所述特征参数值描述个体或群体的特征，所述诊断参数值描述相对于所述个体或群体的诊断。

在一些实施方案中，在4)之前包括根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱。

在一些实施方案中，4)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

在一些实施方案中，当4)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断。

在一些实施方案中，所述特征性参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史，或其组合。

在一些实施方案中，所述诊断性参数选自下组：疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

在一些实施方案中，所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，所述对受试者进行诊断包括诊断所述受试者是否罹患癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述微生物分布谱包含微生物的种类和数量或浓度。

在一些实施方案中，所述数量或浓度为相对数量或浓度。

在一些实施方案中，所述一种或多种微生物选自细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，所述一种或多种微生物包含至少两种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，所述一种或多种微生物是选自列表1的一种或多种微生物。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是qPCR。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是ddPCR。

在一些实施方案中，在进行核酸扩增反应之前无须进行核酸提取。

在一些实施方案中，所述所有步骤在2小时之内完成。

在一些实施方案中，确定微生物的种类包括用对所述微生物具特异性的引物进行核酸扩增反应。

在一些实施方案中，对所述微生物具特异性的引物是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

在一些实施方案中，对所述微生物具特异性的引物不是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

在一些实施方案中，所述测序是第二代测序或第三代测序。

在一些实施方案中，步骤1)中通过测序获得微生物的种类，其包括：

i.利用针对微生物16S或23S核糖体亚基保守序列的引物，通过测序获得包含在所述微生物的16S或23S核糖体亚基的核酸序列；

ii.将所述核糖体亚基的核酸序列与参考核糖体亚基的核酸序列数据库进行比对；以及

iii.基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

在一些实施方案中，对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应同时进行。

在一些实施方案中，对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应分别进行。

在一些实施方案中，对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在同一反应体系中进行。

在一些实施方案中，对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在不同反应体系中进行。

在另一个方面，本发明提供了一种用于本发明的方法的试剂盒，其包含：

1)对所述一种或多种微生物具有特异性的引物对；

2)用于核酸扩增反应的酶；

3)用于核酸扩增反应的缓冲液；

4)dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

1)用于对所述一种或多种微生物进行测序的引物；

2)用于测序反应的酶；

3)用于测序反应的缓冲液；

4)修饰和/或未修饰的dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

在另一个方面，本发明提供了检测剂在制备用于本发明的方法的试剂盒中的用途，其中所述检测剂是对所述多种微生物中的一种或多种微生物具有特异性的引物对。

在另一个方面，本发明提供了检测剂在制备用于本发明的方法的试剂盒中的用途，其中所述检测剂是用于对所述多种微生物中的一种或多种微生物进行测序的引物。

在另一个方面，本发明提供了一种用于执行本发明的方法的系统，其包括：

1)热循环仪，该热循环仪(i)接收反应混合物，该反应混合物包含所述生物样品，对所述多种微生物中的一种或多种微生物具有特异性的引物对，用于核酸扩增反应的酶，用于核酸扩增反应的缓冲液和dNTP，以及(ii)使所述反应混合物的温度循环以进行所述核酸扩增反应，从而产生扩增产物；以及

2)计算机处理器，该计算机处理器耦合至所述热循环仪并被编程为执行本发明的方法。

1)测序仪，该测序仪(i)接收反应混合物，该反应混合物包含所述生物样品，对所述多种微生物中的一种或多种微生物进行测序的引物，用于测序反应的酶，用于测序反应的缓冲液，和修饰和/或未修饰的dNTP，以及(ii)利用所述测序引物对所述样品中包含的核酸进行测序；以及

在另一个方面，本发明提供了用于执行本发明的方法的计算机辅助的方法和系统。

在另一个方面，本发明提供了一种反应混合物，其包含：

1)包含多种微生物的生物样品；

2)对所述多种微生物中的一种或多种微生物具有特异性的引物对；

3)用于核酸扩增反应的酶；

4)用于核酸扩增反应的缓冲液；以及

5)dNTP。

在另一个方面，本发明提供了一种反应混合物，其包含：

1)包含多种微生物的生物样品；

2)用于对所述多种微生物中的一种或多种微生物进行测序的引物；

3)用于测序反应的酶；

4)用于测序反应的缓冲液；以及

5)修饰和/或未修饰的dNTP。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种或多种对选自列表1的任一种微生物具有特异性的引物对。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含对一种或多种用于对选自列表1的任一种微生物进行测序的引物。

在另一个方面，本发明提供了一种生物样品，其包含一种或多种选自列表1的微生物。

附图说明

本公开内容的新颖特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本公开内容的特征和优势的更好的理解，附图中：

图1图示了根据本发明一个实施方案的系统。

图2显示了根据本发明一个实施方案的流程图。

图3显示了根据本发明一个实施方案的装置图。

具体实施方式

1.定义

除非另外说明，本文公开的一些实施方案的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些均在本领域的技术范围内。参见，例如Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；Current Protocols in Molecular Biology系列(F.M.Ausubel等人编著)；Methods In Enzymology系列(Academic Press,Inc.),PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995)),Harlow和Lane编著(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Culture of Animal Cells:AManual of BasicTechnique and Specialized Applications,第6版(R.I.Freshney编著(2010))。

除非上下文另外明确指定，如在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数的指代物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。它们指任何长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并可以执行任何功能(已知或未知的)。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、从连锁分析确定的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸结构的修饰(如果存在)可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步进行修饰，如通过与标记组分结合。

通常，术语“靶多核苷酸”是指具有靶序列的核酸分子起始群体中的核酸分子或多核苷酸，该靶序列的存在、量和/或核苷酸序列，或这些中的一种或多种的变化是需要进行确定的。通常，术语“靶序列”是指在核酸的单链上的核酸序列。靶序列可以是基因的一部分、调控序列、基因组DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、miRNA、rRNA)或其他。靶序列可以是来自样品或二级靶标如扩增反应产物的靶序列。

通常，“核苷酸探针”、“探针”或“标记寡核苷酸”是指用于在杂交反应中通过与相应的靶序列杂交来检测或鉴定其相应的靶多核苷酸的多核苷酸。因此，核苷酸探针可与一种或多种靶多核苷酸杂交。标记寡核苷酸可以与样品中的一种或多种靶多核苷酸完全互补，或含有不与样品中的一种或多种靶多核苷酸中的相应核苷酸互补的一种或多种核苷酸。

“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应以形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定。氢键结合可以通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链，或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程如PCR的引发或核酸内切酶对多核苷酸的酶切中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补序列”。

如应用于多核苷酸的术语“可杂交的”是指多核苷酸形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定的复合物的能力。氢键结合可以通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链，或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程如PCR反应的引发或核酶对多核苷酸的酶切中的步骤。与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补序列”。

“互补性”是指核酸与另一种核酸序列通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型的作用形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个则为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。如本文中所用的“基本互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域中为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或者指在严格条件下杂交的两个核酸。

如本文所用的，用于杂交的“严格条件”是指这样一种条件，在该条件下与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交，而基本不与非靶序列杂交。严格条件通常是序列依赖性的，并且根据多种因素而变化。通常，序列越长，该序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例在Tijssen(1993),Laboratory Techniques InBiochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes,第I部分,第二章“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.中进行了详细描述。

术语“环境“用于本文中意指任何可存在微生物的环境，包括但不限于受试者、土壤、物体表面、水体、植物、岩石、大气、以及其它任何生物圈。

术语“微生物分布谱”用于本文中涵盖微生物的种类和数量，其中所述数量可包括浓度、绝对数量、相对数量、相对浓度等。当提及环境或样品中的微生物分布谱时，是指所述环境或样品中的微生物的种类和数量。

术语“参考微生物分布谱”用于本文中指用一组特定参数的集合标记的参考的微生物分布谱。所述“参考微生物分布谱”可通过大数据处理对共同具有所述特定参数的集合的参考样本的微生物分布谱进行分析获得。或者，所述“参考微生物分布谱”可通过统计方法对于所述参数的集合进行建模而根据所建立的模型推出。在一些实施方案中，所述“参考微生物分布谱”是已知的，并可储存于储存装置中以供计算机分析。

术语“受试者”和“个体在本文中可互换使用，以指代脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物以及宠物。还涵盖体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。

如本文所用的，“表达”是指这样一种过程，通过该过程多核苷酸从DNA模板转录(如成为mRNA或其他RNA转录物)和/或通过该过程转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。

术语“大肠癌状态”是指受试者的健康和/或疾病状态。大肠癌状态的类型的实例包括但不限于，受试者罹患包括大肠癌在内的癌症的风险，疾病(例如，息肉或腺癌)的存在与否，患者的疾病阶段(例如，癌的分期)，和疾病治疗的疗效。

在所述多个方面中的任何方面，完成本发明方法的要素所需的时间可根据该方法的具体步骤而变化。例如，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约120分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约60分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约30分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可以小于或等于120分钟，小于或等于90分钟，小于或等于75分钟，小于或等于60分钟，小于或等于45分钟，小于或等于40分钟，小于或等于35分钟，小于或等于30分钟，小于或等于25分钟，小于或等于20分钟，小于或等于15分钟，小于或等于10分钟，或者小于或等于5分钟。

2.本发明的方法

4)对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度，从而获得所述生物样品的微生物分布谱；

5)将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考微生物分布谱相比较，确定与所述生物样品的微生物分布谱差异在预定的阈值之内的所有候选参考微生物分布谱；以及

6)根据2)中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，所述生物样品来自受试者。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述粘膜是胃粘膜。

在一些实施方案中，所述拭子是直肠拭子。

在一些实施方案中，所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述病史为癌症病史。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

4)从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含多种微生物；

5)对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度，从而获得所述上到样品的微生物分布谱；

6)将所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱进行比较，以确定受试者的健康状况。

在一些实施方案中，所述生物样品为胃肠道样品。

5)从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含多种微生物；

6)对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度，从而获得所述上到样品的微生物分布谱；

7)将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考生物样品的参考微生物分布谱进行比较。

8)根据3)中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述数量或浓度为相对数量或浓度。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是qPCR。

在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是ddPCR。

在一些实施方案中，所述所有步骤在2小时之内完成。

在一些实施方案中，所述测序是第二代测序或第三代测序。

iv.利用针对微生物16S或23S核糖体亚基保守序列的引物，通过测序获得包含在所述微生物的16S或23S核糖体亚基的核酸序列；

v.将所述核糖体亚基的核酸序列与参考核糖体亚基的核酸序列数据库进行比对；以及

vi.基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

在一些实施方案中，所述参数值可以是绝对数值，如年龄。所述参数值也可以是是布尔值，例如对于大肠癌的疾病诊断(是/否)。所述参数值也可以是分类值，如性别(男性、女性等)，种族(白人、黄种人、黑人等)。所述参数值也可以是一个范围，如吸烟史这一参数可赋予的值可为，例如，每天吸烟超过三根等。在一些实施方案中，所述参数值本身可以是一个集合，其包括多个子参数，其中每个子参数可为本文中所定义的参数。

在一些实施方案中，所述对于癌症的诊断可为对于是否罹患某种癌症的诊断。在一些实施方案中，所述对于癌症的诊断可为对于是否有罹患某种癌症风险，以及所述风险大小的诊断。在一些实施方案中，所述对于癌症的诊断可为对于癌症分期的诊断。

在一些实施方案中，所述疾病诊断结果可为存在或不存在癌症。在一些实施方案中，所述疾病诊断结果可为癌症的分期。在一些实施方案中，所述疾病诊断结果可为癌症的复发。在一些实施方案中，所述疾病诊断结果可为癌症的转移。在一些实施方案中，所述疾病诊断结果可为癌症的难治。

在一些实施方案中，所述疾病预后结果可为一段时间之后的疾病诊断结果。在一些实施方案中，所述一段时间可为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年，或10年以上。

在一些实施方案中，所述疾病预后结果可以是一段时间之后的存活率，所述一段时间可如上所定义。在一些实施方案中，所述疾病预后结果可以是中值存活时间(mediansurvival time)。在本文中，“中值存活时间”定义为至样本中50％的个体死亡而50％的个体存活的时间。

本发明提供了评估受试者罹患大肠癌的风险，以及判断罹患大肠癌的受试者的预后的方法。

在一些实施方案中，本发明的受试者是没有大肠癌的症状、没有大肠癌的家族史、和/或没有确认的大肠癌风险因素的受试者。

在一些实施方案中，所述受试者没有除年龄之外的确认的大肠癌风险因素。在一些实施方案中，所述受试者没有除肥胖之外的确认的大肠癌风险因素。在一些实施方案中，所述受试者没有除吸烟史之外的确认的大肠癌风险因素。在一些实施方案中，所述受试者没有除缺乏体育锻炼之外的确认的大肠癌风险因素。在一些实施方案中，所述受试者没有除罹患炎性肠炎之外的确认的大肠癌风险因素。在一些实施方案中，所述受试者没有除诊断罹患结肠直肠息肉之外的确认的大肠癌风险因素。

在一些实施方案中，所述受试者没有除下述一项或多项之外的确认的大肠癌风险因素：年龄、肥胖、吸烟史、缺乏体育锻炼、罹患炎性肠炎、和罹患结肠直肠息肉。

在一些实施方案中，所述受试者是已根据其家族史确定具有结肠直肠息肉或癌症的高风险、先前曾治疗结肠直肠息肉或癌症和或处于缓解期的受试者。所述受试者还可是表现出已知与大肠癌相关的身体症状的受试者、通过筛选测定(例如，粪便隐血试验或乙状结肠镜检查)或直肠指检或刚性或柔性结肠镜检查或CT扫描或其他X射线技术确认的受试者。受试者还可以是目前正在经受治疗的受试者，以确定他们正在接受的疗法或治疗的有效性。

本发明方法提供通过利用微生物分布谱诊断受试者罹患疾病或病症的风险，和/或确定罹患疾病或病症的受试者的预后。在一些情况下，本发明方法提供通过利用微生物分布谱与本领域已知的其他方法，例如细胞学分析或免疫组织化学结合来诊断受试者的疾病或病症。如本发明所使用，术语受试者是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物、狗、猪等。所述受试者可以知道或可以不知道疾病或病症。

在一些实施方案中，微生物分布谱包括对微生物特征性核酸(DNA或RNA)、蛋白或其组合的检测、分析或量化。通过本发明方法诊断的疾病或病症例如包括受试者的一种或多种组织中的异常生长的病症，包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾脏、乳房、胰腺、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、甲状腺、肠(包括大肠和小肠)、脑、食道或前列腺。在一些实施方案中，由本发明方法分析的组织包括大肠(包括直肠和结肠)。

本发明的引物和探针可用于鉴定微生物的分类和确定其数量和/或浓度。本发明还包括判断良性肿瘤和恶性肿瘤的方法，包括测定来自受试者的生物样品中的各种微生物的差异存在和/或分布，其中所述微生物是本文其他部分记载的微生物，特别地，所述微生物是列表1中所列出的微生物。本发明包括用于预测受试者的大肠癌风险的方法，包括确定来自受试者的生物样品中的微生物分布谱，并将其与参考微生物分布谱相比较和关联。本发明还包括用于诊断受试者的大肠癌的方法，包括确定来自受试者的生物样品中的微生物分布谱，并将其与参考微生物分布谱相比较和关联。本发明还包括用于判断罹患大肠癌的受试者的预后的方法，包括确定来自受试者的生物样品中的微生物分布谱，并将其与参考微生物分布谱相比较和关联。本发明还包括用于判断接受治疗或疗法的受试者的大肠癌病情进展的方法，包括确定来自受试者的生物样品中的微生物分布谱，并将其与参考微生物分布谱相比较和关联。本发明还包括用于诊断受试者大肠癌分期的方法，包括确定来自受试者的生物样品中的微生物分布谱，并将其与参考微生物分布谱相比较和关联。

在一些实施方案中，由本发明方法诊断的疾病或病症包括良性和恶性的过度增生性障碍，包括但不限于癌症、增生或肿瘤形成。在一些情况下，由本发明方法诊断的过度增生性障碍包括但不限于乳腺癌，例如乳腺导管组织中的导管癌、髓样癌、胶样癌、管状癌和炎性乳腺癌；卵巢癌，包括上皮卵巢肿瘤，例如卵巢中的腺癌和从卵巢转移到腹腔中的腺癌；子宫癌；子宫颈癌，例如子宫颈上皮的腺癌，包括鳞状细胞癌和腺癌；前列腺癌，例如选自以下的前列腺癌：腺癌或转移到骨的腺癌；胰腺癌，例如胰管组织中的上皮样癌和胰管中的腺癌；膀胱癌，例如膀胱中的移行细胞癌、尿路上皮癌(移行细胞癌)、内衬在膀胱中的膀胱上皮细胞的肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌症；白血病，例如急性粒细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、脊髓发育不良、骨髓增生性障碍、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、肥大细胞增多症、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和骨髓发育不良综合征(MDS)；骨癌；肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)，其分成鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化性癌和小细胞肺癌；皮肤癌，例如基底细胞癌、黑素瘤、鳞状细胞癌和光化性角化病(其是有时发展为鳞状细胞癌的皮肤病症)；眼视网膜母细胞瘤；皮肤或眼内(眼)黑素瘤；原发性肝癌(开始于肝脏的癌症)；肾癌；AIDS-相关淋巴瘤，例如扩散性大B细胞淋巴瘤、B细胞免疫母细胞性淋巴瘤和小的非核裂细胞淋巴瘤；Kaposi肉瘤；病毒诱导的癌症，包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和肝细胞癌；1型人亲淋巴病毒(HTLV-1)和成人T细胞白血病/淋巴瘤；和人乳头状瘤病毒(HPV)和子宫颈癌；中枢神经系统癌症(CNS)，例如原发性脑肿瘤、其包括神经胶质瘤(星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤)、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、神经鞘瘤和成神经管细胞瘤；外周神经系统(PNS)癌症，例如听神经瘤和恶性外周神经鞘瘤(MPNST)，包括神经纤维瘤和神经鞘瘤、恶性纤维性细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性间皮瘤和恶性混合性Müllerian肿瘤；口腔和口咽癌，例如，下咽癌、喉癌、鼻咽癌和口咽癌；胃癌，例如淋巴瘤、胃间质瘤和类癌瘤；睾丸癌，例如生殖细胞肿瘤(GCT)(其包括精原细胞瘤和非精原细胞瘤)和性腺基质细胞瘤(其包括Leydig细胞瘤和睾丸支持细胞瘤)；胸腺癌症，例如胸腺瘤、胸腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤良性肿瘤或类癌瘤；直肠癌和结肠癌。在一些情况下，由本发明方法诊断的疾病或病症包括但不限于位于大肠的肿瘤，例如大肠良性肿瘤，包括但不限于大肠平滑肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤、和血管瘤，大肠息肉，例如增生性息肉、赘生性息肉(如腺瘤)、错构瘤性息肉、和炎性息肉。在一些情况下，由本发明方法诊断的疾病或病症包括但不限于大肠恶性肿瘤，例如结肠癌和/或直肠癌。在一些情况下，本发明方法提供组织是疾病或正常的诊断。在其他情况下，本发明方法提供正常、良性或恶性的诊断。在一些情况下，本发明方法提供良性/正常或恶性的诊断。在一些情况下，本发明方法提供本发明提供的本文中提到的一种或多种特定疾病或病症的诊断。

在由个体提供的样品(试验样品)上进行的微生物分布谱分析的结果可以与已知或认为是正常的生物样品的微生物分布谱比较。正常的生物样品是来自没有或期望没有任何癌症、疾病或病症的受试者的样品，或在微生物分布谱分析中确定对于任何癌症疾病或病症测试阴性的样品。正常样品可以来自不同于经受测试的受试者的个体，或来自受试者已知或认为是正常时采集的样品。正常样品可以与测试样品同时分析或在不同的时间分析。在一些情况下，所述认为来自正常的生物样品的微生物分布谱是根据多个正常的生物样品的微生物分布通过大数据分析而获得的。

测试样品的微生物分布谱可与正常样品的微生物分布谱相比较。在一些情况下正常样品的分析结果来自于数据库，或对于多个正常样品的微生物分布通过大数据分析而获得。在一些情况下，正常样品的分析结果也可以通过建模分析获得。在一些情况下，正常样品的微生物分布谱是本领域技术人员已知或普遍接受的微生物分布谱。在一些情况下，这种比较是定性比较。在一些情况下，这种比较是定量比较。

3.癌症

通过本发明方法诊断的疾病或病症例如包括受试者的一种或多种组织中的异常生长的病症，包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾脏、乳房、胰腺、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、食道或前列腺。在一些实施方案中，由本发明方法分析的组织包括甲状腺组织。

可用本发明算法和方法判断、表征和/或监测的其他类型癌症包括但不限于肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、中枢神经系统(CNS)癌症、外周神经系统(PNS)癌症、乳腺癌、Castleman病、子宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、Ewing氏肿瘤族(例如Ewing氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道基质肿瘤、妊娠性滋养层细胞病、毛细胞白血病、霍奇金病、Kaposi氏肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、儿童白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳房癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、脊髓增生异常综合征、骨髓增生性障碍、鼻腔和鼻旁癌(paranasal cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(成人软组织癌)、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、子宫癌(例如子宫肉瘤)、阴道癌、外阴癌和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。

术语“肿瘤”是指可由癌性或非癌性细胞形成的、固体或液体填充的病变。术语“肿块”和“结节”经常与“肿瘤”同义使用。肿瘤包括恶性肿瘤或良性肿瘤。恶性肿瘤的实例可以是已知包含转化细胞的癌。

术语“息肉”是指从粘膜凸出的组织异常生长。如果它通过狭长的柄附接至表面，则它被称为有蒂息肉。如果不存在柄，则它被称为无蒂息肉。息肉可以是恶性的、癌变前的或良性的。息肉可通过各种程序如手术或者例如在结肠镜检查期间采用息肉切除术而除去。

术语“腺瘤性息肉”或“腺瘤”在本文中可互换使用，意指在结肠内衬(lining)上生长并具有增加的癌症风险的息肉。腺瘤性息肉被认为是恶变前的；然而，一些可能发展成大肠癌。管状腺瘤是腺瘤性息肉中最常见的并且它们是最不可能发展成大肠癌的结肠息肉。管状绒毛状腺瘤是另一种类型。绒毛状腺瘤是尺寸通常大于其他两种类型的腺瘤的第三种类型，且它们在所有息肉中具有最高的发病率和死亡率。

大肠癌，也被称为结肠癌、直肠癌或结肠直肠癌，是由结肠或直肠中的不受控的细胞生长而导致的癌症。结肠直肠息肉为在结肠或直肠的内衬上形成的细胞良性块。几乎所有的息肉最初都是非恶性的。然而，随着时间的推移，一些可能变成癌性病变。大部分结肠直肠息肉的原因是未知的，但它们常见于成人中。由于结肠直肠息肉是无症状的，因此建议定期筛查结肠息肉。当前，用于筛查息肉的方法是高度侵入性的且昂贵的。因此，尽管结肠镜检查筛查在预防和减少大肠癌方面存在益处，但被建议该程序的许多人拒绝进行此筛查，主要是因为担心成本、不适和不良事件。

有助于对患者具有存在结肠息肉、腺瘤或癌性肿瘤如癌的较高风险的可能性进行分类的分子测试可帮助医师指导患者关于抗拒进行结肠镜检查的态度和行为。增加的结肠镜检查筛查依从性将导致早期检测出癌症或癌变前腺瘤，并减少与大肠癌相关的发病率和死亡率。

大肠癌的类型

本文中所述的大肠癌可以是任何类型的大肠癌，如结肠癌和/或直肠癌。例如，所述大肠癌是腺癌、粘液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌、原发性结肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、或鳞状细胞癌。在一些情况下，所述大肠癌是复发的、难治的、或转移的大肠癌。在一些情况下，所述大肠癌可以是不同分期的大肠癌。

大肠癌的分期可根据American Joint Committee on Cancer(AJCC)第7版所述的改进的TNM分期进行。其中根据原发肿瘤分期(T)如下：

1)TX：原发肿瘤无法评估

2)T0：无原发肿瘤的迹象

3)Tis：原位癌，上皮内或侵及固有粘膜层(lamina propria)

4)T1：肿瘤侵及粘膜下层

5)T2：肿瘤侵及固有肌层(muscularis propria)

6)T3：肿瘤侵透固有肌层，侵及结直肠旁组织(pericolorectal tissue)

7)T4a：肿瘤穿透腹膜脏层(visceral peritoneum)表面

8)T4b：肿瘤直接侵及或粘连于其他内脏或结构

根据淋巴结转移(N)分期如下：

1)NX：局部淋巴结无法评估

2)N0：无局部淋巴结转移

3)N1：1-3个局部淋巴结转移

i.N1a：1个局部淋巴结转移

ii.N1b：2-3个局部淋巴结转移

iii.N1c：肿瘤沉积于浆膜下层、肠系膜、或无腹膜结肠或直肠旁组织，无局部淋巴结转移

4)N2：4个或更多个局部淋巴结转移

i.N2a：4-6个局部淋巴结转移

ii.N2b：7个或更多个局部淋巴结转移

根据远处转移(M)分期如下：

1)M0：无远处转移

2)M1：远处转移

i.M1a：转移限于一个器官或病灶(例如肝、肺、卵巢、非局部淋巴结)

ii.M1b：在超过一个器官/病灶，或腹膜的转移

下表示出了AJCC的改良TNM分期系统与Dukes和改进的Astler-Coller(MAC)系统的对应关系：

分期	T	N	M	Dukes	MAC
						0	Tis	N0	M0	-	-
I	T1	N0	M0	A	A
						IIA	T3	N0	M0	B	B2
IIB	T4a	N0	M0	B	B2
						IIC	T4b	N0	M0	B	B3
IIIA	T1-T2	N1/N1c	M0	C	C1
							T1	N2a	M0	C	C1
IIIB	T3-T4a	N1/N1c	M0	C	C2
							T2-T3	N2a	M0	C	C1/C2
	T1-T2	N2b	M0	C	C1
						IIIC	T4a	N2a	M0	C	C2
	T3-T4a	N2b	M0	C	C2
							T4b	N1-N2	M0	C	C3
IVA	任何T	任何N	M1a	-	-
						IVB	任何T	任何N	M1b	-	-

在一些实施方案中，本发明还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户。

在本发明的一些方面，所述报告进一步包括向受试者推荐大肠癌的治疗管控手段。所述治疗管控手段可包括，但不限于其他诊断性测试，如结肠镜、柔性乙状结肠镜检查、CT结肠成像术、粪便测试等，使用治疗剂治疗，手术干预，以及不采取任何措施。

4.样品处理

在多个方面的任一方面中，核酸可以来源于多种样品来源。可以将核酸在进一步操作之前任选地，但不是必须地，分离和/或纯化，如在核酸扩增反应中。例如，可以使生物样品在没有单独的提取步骤的情况下经历聚合酶链反应(PCR)过程，以使得无细胞核酸从未纯化的样品中扩增。作为进一步的示例，可以在临核酸扩增反应之前或在其期间使样品经受细胞裂解条件而不从其他细胞组分中纯化核酸。在一些实施方案中，在使核酸经历扩增反应之前从生物样品中纯化核酸(例如，DNA、RNA或两者)。多种核酸纯化方法是本领域已知的，并且可以随生物样品的类型而改变。例如，生物样品可以包括来自受试者的组织和/或流体。通常，生物流体包括与活生物相关的任何处理的或未处理的流体，包括但不限于，血液，包括全血、温的或冷的血液、以及储存的或新鲜的血液；处理的血液，如用至少一种生理溶液稀释的血液，该生理溶液包括但不限于盐水、营养物和/或抗凝剂溶液；血液成分，如血小板浓缩物(PC)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、无血小板血浆、血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、从血浆获得的成分、浓缩红细胞(PRC)、过渡区物质或血沉棕黄层(BC)；源自血液或血液成分或源自骨髓的类似血液制品；从血浆分离并再悬浮于生理流体或冷冻保护流体中的红细胞；以及从血浆分离并再悬浮于生理流体或冷冻保护流体中的血小板。生物样品的其他非限制性实例包括皮肤、心脏、肺、肾、骨髓、乳房、胰、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、前列腺、食管、甲状腺、血清、唾液、尿、胃液和消化液、泪水、粪便、精液、阴道液、源自肿瘤组织的间质液、眼内液、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脑脊髓液、组织、咽拭子、活检物、胎盘液、羊水、脐带血、腔液、痰、脓、微生物群落、胎粪、乳汁和/或其他排泄物或身体组织。在一些实施方案中，待测样品是全血。在一些实施方案中，待测样品是血沉棕黄层。在一些实施方案中，所分析的组织是待移植或手术移植的组织，如器官(例如，心脏、肾、肝、肺等)、皮肤、骨、神经组织、腱、血管、脂肪、角膜、血液或血液成分的一部分。在一些实施方案中，样品来自受试者，如哺乳动物，包括但不限于鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物或宠物。在一些实施方案中，样品中污染的检测是诸如作出诊断或治疗受试者等医疗行为的基础。例如，污染可能是受试者的脓毒症的预测或诊断。可以采取矫正性的医学干预，如施用治疗剂。

可以使用本领域已知的任何合适的方法从生物样品中提取核酸。例如，可以通过用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇或类似的制剂(包括TRIzol和TriReagent)进行有机萃取来纯化核酸。提取技术的其他非限制性实例包括：(1)有机萃取后乙醇沉淀，例如，使用苯酚/氯仿有机试剂(Ausubel等人,1993)，采用或不采用自动化的核酸提取器，例如，可从AppliedBiosystems(Foster City,Calif.)购得的341型DNA提取器；(2)固定相吸附法(美国专利号5,234,809；Walsh等人,1991)；以及(3)盐诱导的核酸沉淀法(Miller等人,(1988))，这类沉淀方法通常被称为“盐析”法。核酸分离和/或纯化的另一个实例包括使用可与核酸特异性或非特异性结合的磁性颗粒(例如，珠子)，随后使用磁体分离该颗粒，并从颗粒上清洗及洗脱核酸(参见，例如，美国专利号5,705,628)。在一些实施方案中，可以在上述分离方法之前进行酶消化步骤，以帮助从样品中消除不需要的蛋白质，例如，用蛋白酶K或其他类似的蛋白酶消化。参见，例如，美国专利号7,001,724。如果需要，可以将RNA酶抑制剂添加至裂解缓冲液中。对于某些细胞或样品类型，可能期望向方案中加入蛋白质变性/消化步骤。纯化方法可以用于分离DNA、RNA(包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA)或两者。当DNA和RNA在提取过程期间或之后一起分离时，可以采用进一步的步骤单独地将其中一种或两种从另一种中提纯。也可以产生提取的核酸的亚组分，例如，按大小、序列或其他物理或化学特征进行的纯化。除了初始的核酸分离步骤外，还可以在随后的操作之后进行核酸的纯化，如去除过量或不需要的试剂、反应物或产物。

在一些实施方案中，无须在核酸扩增前进行核酸提取。例如，可将生物样品和对于核酸扩增所必需的试剂与裂解剂混合，从而获得能够裂解该生物样品内的种类(例如，微生物或病毒颗粒)的反应混合物。或者，可将裂解剂与生物样品和上述试剂同时加入到反应混合物的第一热区中。使第一热区经受适合于裂解剂作用的温度条件可用来在第一热区中裂解生物样品中的微生物或病毒颗粒，使得该生物样品中的核酸释放到反应混合物中。裂解之后，随后可使反应混合物进入反应容器的第二热区，以供使用本文所述的扩增方法对释放的核酸进行扩增。

在需要裂解剂的情况下，可使用本领域中已知的任何合适的裂解剂，包括可商购的裂解剂。裂解剂的非限制性实例包括Tris-HCl，EDTA，去污剂(例如，Triton X-100、SDS)，溶菌酶，葡萄糖酶(glucolase)，蛋白酶E，病毒内溶素，外溶素(exolysin)，消解酶(zymolose)，溶细胞酶(Iyticase)，蛋白酶K，来自噬菌体的内溶素和外溶素，来自噬菌体PM2的内溶素，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)噬菌体PBSX的内溶素，来自乳杆菌原噬菌体Lj928、Lj965、噬菌体15Phiadh的内溶素，来自肺炎链球菌噬菌体Cp-I的内溶素，无乳链球菌噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素，来自原噬菌体细菌的内溶素和外溶素，来自利斯特氏菌属(Listeria)噬菌体的内溶素，穴蛋白(holin)-内溶素，细胞20裂解基因，holWMY沃氏葡萄球菌(Staphylococcus wameri)M噬菌体varphiWMY，沃氏葡萄球菌M噬菌体varphiWMY的Iy5WMY，及其组合。在一些情况下，缓冲液可包含裂解剂(例如，裂解缓冲液)。裂解缓冲液的一个实例是氢氧化钠(NaOH)。

在一些实施方案中，本发明方法用于获得来自受试者的样品。如本发明所使用，术语受试者是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物、狗、猪等。本领域一些获得组织的方法包括活组织检查法，包括细针抽吸、芯针活组织检查、真空辅助活组织检查、切取活组织检查、切除活组织检查、钻取活组织检查、刮取活组织检查或皮肤活组织检查。样品可从本发明提供的任何组织中获得，包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾脏、乳腺、胰腺、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、直肠、脑、前列腺、食道或甲状腺。或者，样品可从任何其他来源获得，包括但不限于血液、汗液、毛囊、口腔组织、泪液、月经、粪便或唾液。在本发明的一些实施方式中，医学专业人员可以获得用于测试的生物样品。

样品可由本领域已知方法获得，例如本领域常见的活组织检查法、拭取、刮削、放血或本领域已知的任何其他方法。在一些情况下，可使用本领域常见的组件获得、储存或运输样品。在一些情况下，可获得多个样品，例如可获得多个生物样品用于通过本发明方法进行诊断。在一些情况下，可获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如肠道)的一个或多个样品和来自另一个组织(例如胃)的一个或多个样品用于通过本发明方法进行诊断。在一些情况下，可在相同或不同时间获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如肠道)的一个或多个样品和来自另一个组织(例如胃)的一个或多个样品。在一些情况下，在不同时间获得的样品通过不同方法储存和/或分析。例如，可通过细胞学分析(常规染色)获得并分析样品。在一些情况下，可基于细胞学分析结果从受试者获得进一步的样品。癌症的诊断可以包括医师、护士或其他医学专业人员对受试者的检查。所述检查可以是常规检查的一部分，或所述检查可以源于特定的主诉，包括但不限于以下之一：疼痛、患病、疾病预测、疑似肿块或团块、疾病或病症的存在。所述受试者可以知道或不知道该疾病或病症。医学专业人员可以获得用于测试的生物样品。在一些情况下所述医学专业人员可以指引受试者去测试中心或实验室以提交生物样品。

在一些情况下，所述医学专业人员可以指引受试者去测试中心或实验室以提交生物样品。在其他情况下，所述受试者可以提供样品。在一些情况下，经营本发明的微生物分布谱的企业可以获得样品。所述样品可通过本领域已知方法获得，例如本领域常见的活组织检查法、拭取、刮削、放血或本领域已知的任何其他方法。在一些情况下，可使用本领域常见的组件获得、储存或运输样品。在一些情况下，可获得多个样品，例如可获得多个生物样品用于通过本发明方法进行诊断。在一些情况下，可获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如肠道)的一个或多个样品和来自另一个组织(例如胃)的一个或多个样品用于通过本发明方法进行诊断。在一些情况下，可在相同或不同时间获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如肠道)的一个或多个样品和来自另一个组织(例如胃)的一个或多个样品。在一些情况下，在不同时间获得的样品通过不同方法储存和/或分析。例如，可通过细胞学分析(常规染色)获得并分析样品。在一些情况下，可基于细胞学分析结果从受试者获得进一步的样品。

在一些情况下，所述受试者可以被指引去看专家，例如肿瘤学家、外科医生或内分泌专家以获得进一步诊断。所述专家同样可以获得用于测试的生物样品，或指引个体去测试中心或实验室以提交生物样品。在任何情况下，可由医师、护士或其他医学专业人员例如医学技师、内分泌专家、细胞学家、抽血者、放射科医师、肿瘤科医师或消化科医师获得所述生物样品。所述医学专业人员可以指示对所述样品进行合适的测试或分析，或者经营本发明的微生物分布谱的企业可以咨询那个分析或测试最适于指定。经营微生物分布谱的企业可以向个体或其医学或保险提供者为其咨询工作、为样品获得和/或储存、为材料或者为所提供的所有产品和服务收费。

在本发明的一些实施方式中，医学专业人员不必参与初始诊断或样品获得。或者个体可以通过使用在药店出售的试剂盒来获得样品。所述试剂盒可以包含用于获得如本发明描述的所述样品的手段，用于储存所述样品用于检验的手段以及正确使用所述试剂盒的说明书。在一些情况下，微生物分布谱服务包括在购买该试剂盒的价格中。在其他情况下，微生物分布谱服务单独收费。

适于微生物分布谱企业使用的样品可以是包含待测试个体的组织、细胞、核酸、基因、基因片段、表达产物、基因表达产物或基因表达产物片段的任何材料。提供了用于确定样品适用性和/或充足性的方法。样品可以包括但不限于，组织、细胞或来自个体的细胞或源自个体的细胞的生物材料。所述样品可以是细胞或组织的异质群体或同质群体。可使用能够提供适于本发明描述的分析法的样品的本领域已知的任何方法获得生物样品。

样品可通过非侵入性法获得，包括但不限于：皮肤或子宫颈的刮削、颊部的擦拭、唾液收集、尿液收集、粪便收集、月经、泪液或精液的收集。在其他情况下，样品通过侵入性方法获得，包括但不限于：活组织检查、肺泡或肺灌洗、针抽吸或放血。针抽吸法还可以包括细针抽吸、芯针活组织检查、真空辅助活组织检查或核芯针活组织检查。在一些实施方案中，可通过本发明方法获得多个样品以确保足够量的生物材料。获得合适的来自胃肠道的生物样品的方法是本领域已知的。

在本发明的一些实施方式中，经营所述微生物分布谱的企业可以直接从受试者、从医学专业人员、从第三方或从由经营所述微生物分布谱的企业或第三方提供的试剂盒获得生物样品。在一些情况下，所述生物样品可在受试者、医学专业人员或第三方获得生物样品并将生物样品递送给经营所述微生物分布谱的企业后由该企业获得。在一些情况下，所述经营微生物分布谱的企业可以提供用于将所述生物样品储存并运送给所述经营微生物分布谱的企业的合适容器和赋形剂。

在一些实施方案中，本发明方法提供用于在获得样品之后和通过本发明的一种或多种方法分析样品之前储存样品一段时间，例如数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月、数年或更久。在一些情况下，在储存步骤或进一步分析之前细分从受试者获得的样品，这样样品的不同部分经受不同的下游方法或处理，包括但不限于储存、细胞学分析、充足性测试、核酸提取、微生物分布谱或其组合。

在一些情况下，一部分样品可以储存而另一部分所述样品可以进一步操作。这种操作可以包括但不限于微生物分布谱；细胞学染色；基因或基因表达产物(RNA或蛋白质)提取、检测或定量；固定和检验。在其他情况下，获得、储存并在储存步骤之后细分样品用于进一步分析，这样样品的不同部分经受不同的下游方法或处理，包括但不限于储存、细胞学分析、充足性测试、核酸提取、微生物分布谱或其组合。在一些情况下，获得样品并通过例如细胞学分析进行分析，且所得样品材料通过本发明的一种或多种微生物分布谱方法进一步分析。在这种情况下，可以在细胞学分析步骤和微生物分布谱步骤之间储存样品。样品可以在获取时储存，以利于运送或等待其他分析的结果。在另一个实施方式中，可以在等待医师或其他医学专业人员的指示的同时储存样品。

所获取的样品可以置于合适介质、赋形剂、溶液或容器中用于短期或长期储存。所述储存可以要求将样品保持在冷藏或冷冻环境中。在储存在冷冻环境之前，样品可以快速冷冻。冷冻样品可以与合适的低温贮藏介质或化合物接触，所述介质或化合物包括但不限于：甘油、乙二醇、蔗糖或葡萄糖。合适的介质、赋形剂或溶液可以包括但不限于：hanks盐溶液、盐水、细胞生长培养基、铵盐溶液例如硫酸铵或磷酸铵、或水。合适的铵盐浓度包括约0.1g/ml、0.2g/ml、0.3g/ml、0.4g/ml、0.5g/ml、0.6g/ml、0.7g/ml、0.8g/ml、0.9g/ml、1.0g/ml、1.1g/ml、1.2g/ml、1.3g/ml、1.4g/ml、1.5g/ml、1.6g/ml、1.7g/ml、1.8g/ml、1.9g/ml、2.0g/ml、2.2g/ml、2.3g/ml、2.5g/ml或更高的溶液。所述介质、赋形剂或溶液可以是无菌的或可以不是无菌的。

样品可以储存在室温下或低温下，例如寒冷温度(例如约20℃至约0℃)，或冷冻温度，包括例如0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-12℃、-14℃、-15℃、-16℃、-20℃、-22℃、-25℃、-28℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-100℃、-120℃、-140℃、-180℃、-190℃或约-200℃。在一些情况下，样品可以储存在冰箱中、冰或冷冻凝胶包装上、冷藏箱中、低温冷藏箱中、干冰上、液氮中或与液氮平衡的蒸气相中。

所述介质、赋形剂或溶液可以包含防腐剂以使样品维持在适当状态中用于随后的诊断或操作，或阻止凝结。所述防腐剂可以包括柠檬酸盐、乙二胺四乙酸、叠氮化钠或硫柳汞。所述样品可以通过本领域已知的任何方法例如使用戊二醛、甲醛或甲醇在储存之前或储存期间固定。所述容器可以是适于储存或运输生物样品的任何容器，包括但不限于：杯子、带盖杯子、试管、无菌管、真空管、注射器、瓶子、显微镜载片或任何其他合适的容器。所述容器可以是无菌的或可以不是无菌的。在一些情况下，所述样品可以储存在适于储存用于随后细胞学分析的细胞的商业制剂中，例如但不限于Cytyc ThinPrep、SurePath或Monoprep。

所述样品容器可以是适于储存和/或运输生物样品的任何容器，包括但不限于：杯子、带盖杯子、试管、无菌管、真空管、注射器、瓶子、显微镜载片或任何其他合适的容器。所述容器可以是无菌的或可以不是无菌的。

5.核酸扩增反应

在一些实施方案中，本发明涉及核酸扩增反应。在一些实施方案中，本发明的方法涉及对所述生物样品进行核酸扩增反应，以确定所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度。

在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是qPCR。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是ddPCR。

在一些实施方案中，在进行核酸扩增反应之前无须进行核酸提取。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述聚合酶链反应在90分钟之内完成。

在一些实施方案中，确定微生物的种类包括用对所述微生物具特异性的引物进行核酸扩增反应。在一些实施方案中，对所述微生物具特异性的引物是针对16S或23S核糖体亚基的引物。在一些实施方案中，对所述微生物具特异性的引物不是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

在多个方面的任一方面中，核酸扩增反应可以涉及多种用于核酸扩增的方法中的任一种。通常，“扩增”是指使靶序列的拷贝数增加的任何过程。多种用于靶核酸的检测和定量的基于扩增的方法是本领域已知的。聚合酶链反应(PCR)采用多个循环的变性、将引物对与相反链退火以及引物延伸，以使靶序列的拷贝数呈指数增加。在被称为RT-PCR的变化形式中，使用逆转录酶(RT)由RNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将该cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝(参见，例如，美国专利号5,322,770和5,310,652)。

扩增方法可能涉及温度变化(如在热变性步骤中)，或者可以是不包括热变性步骤的等温过程。等温扩增方法的实例是链置换扩增(常称为SDA)，其采用以下循环：将引物序列对与靶序列的相反链退火、在dNTP的存在下进行引物延伸以产生半硫代磷酸化的双链引物延伸产物、半修饰的限制性核酸内切酶识别位点的核酸内切酶介导的切口形成、以及聚合酶介导的从切口的3’端开始的引物延伸，以置换存在的链并产生用于下一轮的引物退火、切割和链置换的链，从而导致产物的几何扩增(参见，例如，美国专利号5,270,184和美国专利号5,455,166)。嗜热SDA(tSDA)在基本相同的方法中在更高的温度下采用嗜热的核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利号0684315)。

扩增方法的其他实例包括滚环扩增(RCA)(例如,Lizardi,“Rolling CircleReplication Reporter Systems”,美国专利号5,854,033)；解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如，美国专利申请US 20040058378)；以及环介导等温扩增(LAMP)(例如,Notomi等人,“Process for Synthesizing Nucleic Acid”,美国专利号6,410,278)。

核酸扩增反应的其他实例包括基于转录的扩增方法，如基于核酸序列的扩增(也称为NASBA)(例如，Malek等人,美国专利号5,130,238)；依赖于RNA复制酶的使用来扩增探针分子自身的方法，常称为Qβ复制酶(例如，Lizardi,P.等人(1988)BioTechnol.6,1197-1202)；以及自我持续序列复制(例如，Guatelli,J.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874-1878；Landgren(1993)Trends in Genetics 9,199-202；和HELEN H.LEE等人.NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES(1997))。另一种基于转录的扩增方法是转录介导的扩增，常称为TMA，其在基本恒定的温度、离子强度和pH条件下自催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自催化地产生额外的拷贝(参见，例如，美国专利号5,480,784；和美国专利号5,399,491)。核酸扩增方法的另外的实例包括连接酶链反应(参见，例如，美国专利号5,494,810和5,830,711)，和固相扩增方法(例如，采用附于固体表面如载玻片或珠子上的引物的桥扩增；参见，例如，美国专利号5,641,658和7,985,565)。

通常，SDA可以如下描述。使单链靶核酸(通常是DNA靶序列)与SDA引物接触。“SDA引物”通常具有25-100个核苷酸的长度，且约35个核苷酸的SDA引物是优选的。SDA引物与在靶序列的3’端的区域基本互补，并且该引物在其5’端(在与靶标互补的区域之外)具有为限制性核酸内切酶的识别序列的序列，该限制性核酸内切酶有时被称为“切口酶”或“切口核酸内切酶”。然后SDA引物与靶序列杂交。SDA反应混合物还含有聚合酶(“SDA聚合酶”)，以及全部四种脱氧核苷-三磷酸(也称为脱氧核苷酸或dNTP，即，dATP、dTTP、dCTP和dGTP，常在引物延伸反应中使用)的混合物，其中至少一种为取代的或修饰的dNTP；由此，将SDA引物延伸，以形成修饰的引物，有时称为“新合成的链”。将取代的dNTP进行修饰，以使得其将抑制含有取代的dNTP的链中的切割，但将不抑制另一条链上的切割。合适的取代的dNTP的实例包括但不限于2'脱氧腺苷5'-O-(1-硫代三磷酸)、5-甲基脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-脱氧尿苷5'-三磷酸和7-脱氮-2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸。另外，dNTP的取代可以发生在掺入至新合成的链中之后；例如，可以使用甲基化酶将甲基基团添加至合成的链中。另外，如果全部核苷酸都被取代，则聚合酶可以具有5’→3’核酸外切酶活性。然而，如果少于全部的核苷酸被取代，则聚合酶优选缺少5’→3’核酸外切酶活性。正如将被本领域技术人员所理解的，识别位点/核酸内切酶对可以是很多种已知组合中的任一种。选择核酸内切酶在识别位点或其3’或5’端切割链，而不切割互补序列，这是因为该酶仅切割一条链或者由于取代的核苷酸的掺入。合适的识别位点/核酸内切酶对是本领域已知的，包括但不限于HincII、HindII、AvaI、Fnu4HI、TthIIII、NcII、BstXI、BamHI等。描绘了合适的酶及其相应的识别位点和使用的修饰的dNTP的图表见于美国专利号5,455,166中，该专利通过引用并入于此。一旦形成切口，则使用聚合酶(“SDA聚合酶”)延伸新的切口链，5’→3’，由此形成另一条新合成的链。所选的聚合酶应当能够在切口位点引发5’→3’聚合，还应当置换切口下游的聚合的链，并且应当缺少5’→3’核酸外切酶活性(这可以通过添加阻断剂而另外完成)。SDA中合适的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE 1.0和SEQUENASE 2.0(U.S.Biochemical)、T5 DNA聚合酶和Phi29 DNA聚合酶。通常，SDA不需要热循环。通常将反应的温度设置得足够高以防止非特异性杂交，但又足够低以允许特异性杂交；这通常为约37℃到约42℃，取决于酶。在一些实施方案中，对于本文所述的其他扩增技术，可以采用互补的靶序列进行第二引物延伸反应，从而导致在设定的时间段期间扩增大幅度增加。即，第二引物核酸与第二靶序列(与第一靶序列基本互补)杂交，以形成第二杂交复合体。添加酶并随后将第二杂交复合体解离，导致产生多个新合成的第二链。因此，扩增可以是线性或非线性的(例如，指数的)。

NASBA在美国专利号5,409,818中进行了一般性描述；Sooknanan等人,MolecularMethods for Virus Detection的Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,Ch.12(pp.261-285),Academic Press,1995；以及“Profiting from Gene-based Diagnostics”,CTB International Publishing Inc.,N.J.,1996，所有这些文献均通过引用并入本文。NASBA与TMA和QBR都非常相似。转录介导的扩增(TMA)在美国专利号5,399,491、5,888,779、5,705,365、5,710,029中进行了一般性描述，所有这些专利均通过引用并入本文。NASBA与TMA之间的主要差异为，NASBA利用RNA酶H的添加来实现RNA降解，而TMA依赖于逆转录酶的固有的RNA酶H活性。通常，这些技术可以如下描述。使通常为RNA靶序列(有时称为“第一靶序列”或“第一模板”)的单链靶核酸与本文中通常称为“NASBA引物”的第一引物(尽管“TMA引物”也是合适的)接触。以下从DNA靶序列开始描述。这些引物通常具有25-100个核苷酸的长度，且约50-75个核苷酸的NASBA引物是优选的。第一引物优选为DNA引物，该DNA引物在其3’端具有与第一模板的3’端基本互补的序列。第一引物还在其5’端具有RNA聚合酶启动子(或其互补序列(反义的)，取决于系统的配置)。然后第一引物与第一模板杂交以形成第一杂交复合体。反应混合物还包含逆转录酶(“NASBA”逆转录酶)，以及四种dNTP的混合物，使得第一NASBA引物得到延伸，以形成包含RNA(第一模板)和DNA(新合成的链)的杂交复合体的修饰的第一引物。本文中“逆转录酶”或“RNA引导的DNA聚合酶”是指能够从DNA引物和RNA模板合成DNA的酶。合适的RNA引导的DNA聚合酶包括但不限于禽成髓细胞性白血病病毒逆转录酶(“AMV RT”)和莫洛尼鼠白血病病毒RT。当扩增反应为TMA时，逆转录酶还包含RNA降解活性。除了上述列出的成分之外，NASBA反应还包含RNA降解酶，本文中有时也称为核糖核酸酶，其会水解RNA:DNA杂合体的RNA而不水解单链或双链的RNA或DNA。合适的核糖核酸酶包括但不限于来自大肠杆菌和小牛胸腺的RNA酶H。核糖核酸酶活性使杂交复合体中的第一RNA模板降解，从而导致该杂交复合体解离，留下第一单链新合成DNA链，有时称为“第二模板”。另外，NASBA反应还包含第二NASBA引物，其通常包含DNA(虽然对于本文中所有的探针和引物，还可以使用核酸类似物)。该第二NASBA引物在其3’端具有与第二模板的3’端基本互补的序列，并且还含有功能性启动子的反义序列和转录起始位点的反义序列。因此，该引物序列在用作合成第三DNA模板的模板时，含有充分的信息以允许RNA聚合酶的特异且有效的结合以及在期望位点处转录的引发。反义启动子和转录起始位点可以是T7RNA聚合酶的相应启动子和起始位点，尽管也可以使用其他RNA聚合酶启动子和起始位点。第二引物与第二模板杂交，并且也称为“DNA引导的DNA聚合酶”的DNA聚合酶也存在于反应中，合成第三模板(第二新合成DNA链)，从而产生包含两条新合成的DNA链的第二杂交复合体。最后，纳入RNA聚合酶和所需的四种核糖核苷三磷酸(核糖核苷酸或NTP)导致RNA链(与第一模板基本相同的第三新合成链)的合成。RNA聚合酶，本文中有时称为“DNA引导的RNA聚合酶”，识别启动子并在起始位点特异性引发RNA合成。此外，对于每个DNA双链体，RNA聚合酶优选地合成RNA的若干个拷贝。优选的RNA聚合酶包括但不限于T7RNA聚合酶和其他噬菌体RNA聚合酶，包括噬菌体T3、噬菌体沙门氏菌噬菌体sp6或假单胞菌噬菌体gh-1的RNA聚合酶。在一些实施方案中，TMA和NASBA与起始DNA靶序列、包含RNA聚合酶启动子的第一引物和DNA聚合酶一起使用，以产生具有新合成的链的双链DNA杂合体，该新合成的链包含启动子序列。然后使该杂合体变性并添加第二引物。

等温扩增反应的另一个实例是单引物等温扩增(SPIA)。该扩增技术在WO2001020035和美国专利号6,251,639中公开，这些专利通过引用并入本文。通常，该方法包括使嵌合RNA/DNA扩增引物与探针或靶标杂交。优选地，探针的DNA部分是RNA的3’端。任选地，该方法包括使包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与模板中相对于复合引物与该模板的杂交位于5’侧的区域杂交。引物与模板杂交后，采用DNA聚合酶将引物延伸。随后，采用从RNA/DNA杂合体中切割RNA的酶从复合引物中切割RNA。随后，将另外的RNA/DNA嵌合引物与模板杂交，以便从靶探针中置换第一延伸引物。重复该延伸反应，由此产生探针序列的多个拷贝。当只使用一个SPIA引物时，扩增反应线性进行。当还使用与第一引物延伸产物互补的反向SPIA引物时，扩增反应是非线性的。

在一些实施方案中，核酸扩增反应是PCR反应。对通过PCR扩增靶序列有利的条件可以通过本领域已知的方法来确定，可以在过程中的多个步骤中优化，并且取决于反应中元件的特征，如靶标类型、靶标浓度、待扩增的序列的长度、靶标的序列和/或一种或多种引物、引物长度、引物浓度、所用的聚合酶、反应体积、一个或多个元件与一个或多个其他元件的比例、以及其他因素，这些中的一些或全部可以改变。通常，PCR包括使待扩增的靶标变性(如果是双链的)、一种或多种引物与靶标杂交、以及通过DNA聚合酶进行引物延伸的步骤，且使这些步骤重复(或“循环”)以便扩增靶序列。可以优化该过程中的步骤以得到不同的结果，如提高产率，减少假产物的形成，和/或提高或降低引物退火的特异性。优化的方法是本领域已知的，且包括调节扩增反应中元件的类型或量，和/或调节过程中给定步骤的条件，如特定步骤中的温度、特定步骤的持续时间和/或循环数。在一些实施方案中，扩增反应包括至少5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。在一些实施方案中，扩增反应包括不超过5、10、15、20、25、35、50个或更多个循环。循环可以包含任意数目的步骤，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个步骤，并且在所循环的步骤之前和/或之后可以有不包括在那些循环的步骤中的一个或多个步骤(例如，初始解链步骤或最终温育步骤)。步骤可以包括适合于实现给定步骤的目的的任意温度或温度梯度，该给定步骤包括但不限于引物退火、引物延伸和链变性。步骤可以具有任意的持续时间，包括但不限于约、少于约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、180、240、300、360、420、480、540、600秒或更多秒，包括无限地进行直至手动中止。包含不同步骤的任意数目的循环可以以任意顺序组合。在一些实施方案中，将包含不同步骤的不同循环组合，使得组合中循环的总数目为约、少于约或多于约5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。

在一些实施方案中，核酸扩增反应包括一种或多种引物例如约、多于约或少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物的3’端延伸。在一些实施方案中，核酸扩增反应中的引物延伸仅涉及一对引物。在其他实施方案中，核酸扩增反应中的引物延伸涉及多个引物对，如2、3、4、5个或更多个引物对。在一些实施方案中，引物对由第一引物和第二引物组成，其中第一引物包含可与一种或多种靶多核苷酸的至少一部分杂交的序列，并且进一步地，其中第二引物包含可与第一引物延伸产物的互补序列的至少一部分杂交的序列。当靶多核苷酸是双链时，可与第一引物延伸产物的互补序列的至少一部分杂交的第二引物的序列还可以是可与靶多核苷酸的互补链的至少一部分杂交的。当扩增反应包含多个引物对时，该多个引物对可以是不同的(如每一对为两种不同的引物)、重叠的(如一个正向引物与两个或更多个不同的反向引物配对)、或不同对和重叠对的组合。扩增引物可以具有任何合适的长度，如约、小于约或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更多个核苷酸，其任何部分或全部可以与相应的靶序列(例如，约、小于约或大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸)互补。通常，当引物包含互补部分和非互补部分时，与靶序列互补的部分位于引物的3’端。引物对可被设计用于扩增具有任何期望长度的靶序列。如本文所用的，“扩增子”是指在核酸扩增反应中从靶多核苷酸扩增的单链或双链形式的靶序列。当扩增子通过引物对扩增时，引物对通常位于扩增子的侧翼，使得一个引物在靶序列的5’端杂交而另一引物与靶序列的3’端的互补序列杂交。在一些实施方案中，扩增子的长度为约或小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，扩增子的长度为约或大于约50、100、200、300、400、500、750、1000个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，扩增子的长度在这些端点的任意两个端点之间，如25-1000、30-500、50-400、50-250、50-150或100-200个核苷酸长。可以基于与多种设计考虑因素中的任一种的一致性来选择引物，这些设计考虑因素可以单独使用，或与本文公开的或本领域已知的任何其他设计考虑因素组合使用。引物的可选设计考虑因素的另外的非限制性实例包括：避免相同核苷酸的区段(run)(例如，连续3、4、5个或更多个相同核苷酸)；邻近探针而不与探针杂交位点重叠(例如，沿同一链在引物的3’端与探针的5’端之间约或小于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸)；G-C含量在约20％-80％内，解链温度(T_m)在选定范围(例如，约55-65℃、58-62℃或58-60℃)内；在3’端的最后五个核苷酸中有不超过两个G和/或C碱基；成对的引物具有相似的T_m(例如，相同的T_m，或T_m在彼此约1-2℃内)；最少的二级结构(例如，当最优折叠时有约或少于约5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基，如通过用mFold所分析的(参见，例如，Zuker等人,Nucl.Acid Res,2003,31:3406-3415))；作为同源二聚体或异源二聚体的反应中引物之间最少的杂交(例如，当最佳对齐时有约或少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基)；以及引物与相应探针之间最少的杂交(例如，当最佳对齐时有约或少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个Watson-Crick配对碱基)。在一些实施方案中，引物特异性地扩增长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸的扩增子，并且当最佳对齐时与表1中的序列(或其互补序列)具有约或至少约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的，这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(BasicLocal Alignment Search Tool，BLAST)，如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)所维护的。

在一些实施方案中，引物对固定在固体支持体上。固体支持体的实例包括但不限于，无机材料如基于二氧化硅的基底(例如，玻璃、石英、熔融石英、硅等)，其他半导体材料，以及有机材料如聚合物材料(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖，或常用作反应介质的支持体的多种有机基底材料中的任一种)。除了所述多种材料用作固体支持体之外，固体支持体结构还可以为多种物理构造中的任一种，包括但不限于微粒、珠子、纳米颗粒、纳米晶体、纤维、微纤维、纳米纤维、纳米线、纳米管、垫(mat)、平面薄片、平面晶片或载玻片、多孔板、包含额外结构的光学载玻片、毛细管、微流体通道等。在一些实施方案中，在固体支持体上的扩增包括桥扩增。桥扩增的一般方法是本领域已知的。参见，例如WO/1998/044151和WO/2000/018957。

特别感兴趣的是能够与在至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组中保守的区域特异性杂交的引物序列。例如，选择各自与在至少5、10、15、20个或更多个不同细菌基因组中保守的单独的区域杂交的正向和反向引物。这些保守区域包括但不限于金黄色葡萄球菌的16S rRNA(GenBank登录号NC_007622)的9到28、32到48、522到545、888到903、916到937、939到973、975到994、957到981、1093到1125、1184到1206、1231到1252、1378到1396、1398到1422或1496到1516的区域，或以下细菌的基因组中的任一种的相应区域：金黄色葡萄球菌Mu3、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、粘质沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、丙酸杆菌属的种、金黄色葡萄球菌Mu50、小肠结肠炎耶尔森氏菌、模仿葡萄球菌、藤黄微球菌和产气肠杆菌。

核酸扩增反应中的引物延伸可以通过本领域已知的任何合适的聚合酶如DNA聚合酶进行，这些聚合酶中的许多是可商购的。DNA聚合酶可以包括DNA依赖性DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA聚合酶活性、或DNA依赖性和RNA依赖性DNA聚合酶活性。DNA聚合酶可以是热稳定的或非热稳定的。DNA聚合酶的实例包括但不限于Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Klenow片段，及其变体、修饰产物和衍生物。在一些实施方案中，使用细菌产生的酶是高度纯化的，使得无模板对照扩增反应在约或多于约25、30、35、40、45个或更多个PCR反应循环后不产生高于背景水平的扩增信号。

在多个方面的任一方面的一些实施方案中，核酸扩增产物在扩增过程期间和/或完成时进行检测。扩增产物检测可在扩增测定中实时进行。在一些实施方案中，扩增产物可直接采用荧光DNA结合剂进行可视化，该荧光DNA结合剂包括但不限于DNA嵌入剂和DNA沟结合剂。由于掺入至双链DNA分子中的嵌入剂的量通常与扩增的DNA产物的量成比例，因此可以通过使用常规的光学系统定量嵌入染料的荧光来确定扩增产物的量。DNA结合染料的非限制性实例包括绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoechst、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶(homidium)、光神霉素、多吡啶钌、安曲霉素等。

在一些实施方案中，在核酸扩增反应中采用序列特异性寡核苷酸探针以促进扩增产物的检测和/或定量。基于探针的定量扩增依赖于所期望的扩增产物的序列特异性检测，如通过探针与扩增产物内的靶序列之间的特异性杂交。靶特异性探针的实例包括但不限于探针和分子信标。用于进行基于探针的定量扩增的一般方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,210,015)。杂交可以在不同的严格性下进行。合适的杂交条件通常为这样的条件，其使得探针与靶多核苷酸之间的识别相互作用足够特异并且足够稳定，以便提供寡核苷酸探针和/或引物与预期靶序列之间的优先杂交。增加杂交反应的严格性的条件是本领域已知的，并且包括退火温度和/或盐浓度的优化。寡核苷酸探针可以具有任何合适的长度，例如约、小于约或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100个或更多个核苷酸，其任何部分或全部可以与相应的靶序列(例如，约、小于约或大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸)互补。在一些实施方案中，在单个核酸扩增反应中使用多种探针，如约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25种或更多种探针。在一些实施方案中，单个核酸扩增反应仅含有两种探针，例如一种与来自一种或多种革兰氏阳性菌(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)的序列特异性杂交，而第二种与来自一种或多种革兰氏阴性菌(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)的序列特异性杂交。在一些实施方案中，单个核酸扩增反应仅含有一种探针，例如与在多种不同细菌物种(例如，约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50种或更多种物种)中相同的序列和/或在来自多个不同属(例如，约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个属)的细菌中相同的序列特异性杂交的探针。可以基于与多种设计考虑因素中的任一种的一致性来选择探针，这些设计考虑因素可以单独使用，或与本文公开的或本领域已知的任何其他设计考虑因素组合使用。探针的可选设计考虑因素的另外的非限制性实例包括：避免相同核苷酸的区段(例如，连续3、4、5个或更多个相同核苷酸)；邻近扩增引物杂交位点而不重叠(例如，沿同一链在引物的3’端与探针的5’端之间约或小于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸)；G-C含量在约20％-80％内，解链温度(T_m)在选定范围内(例如，比相应的引物T_m高约8-10℃)；以及C比G多；在5’端没有G。在一些实施方案中，探针与长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸的扩增子特异性杂交，并且当最佳对齐时与表1中的序列具有约或至少约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的，这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(Basic Local AlignmentSearch Tool，BLAST)，如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)所维护的。

为了方便检测在杂交测定期间形成的探针-靶标复合物，可将核苷酸探针与可检测标记物结合。合适的可检测标记物可包括：可通过光化学、生物化学、光谱学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。很多种合适的可检测标记物是本领域已知的，其包括荧光标记物、化学发光标记物、放射性同位素标记物、酶标记物和配体。用于检测或定量杂交强度的检测方法通常将取决于上述选定的标记物。例如，可以使用照相胶片或磷光影像分析仪(phosphoimager)检测放射性标记物。可以使用用于检测发射的光的光检测器来检测和定量荧光标志物。在一些实施方案中，单个反应中的多种探针中的每一种均与不同的可检测标记物(例如，具有不同发射光谱的荧光染料)结合，以使得可以区分对应于不同靶标的扩增的信号。通常通过为酶提供底物并测量通过酶对底物的作用而产生的反应产物来检测酶标记物；并且最后通过简单地将有色标记物可视化来检测比色标记物。

在一些实施方案中，使用TaqMan测定来检测结合的探针的杂交(PE Biosystems,Foster City,Calif.；参见，例如，美国专利号5,962,233和5,538,848，各专利均通过引用并入本文)。该测定在PCR反应期间进行。TaqMan测定利用DNA聚合酶如AMPLITAQ DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性。序列特异性探针包含在PCR反应中。典型的TaqMan探针是具有5’-报道分子染料(例如，荧光染料)和3’-猝灭剂染料的寡核苷酸。在PCR期间，如果探针与其靶标结合，则AMPLITAQ聚合酶的5’-3’核溶解活性切割在报道分子与猝灭剂染料之间的探针。报道分子染料与猝灭剂染料的分离导致荧光增加。信号随每一个PCR循环而积累并且可以用荧光计进行监测。多种报道分子-猝灭剂对是本领域已知的。一些报道分子-猝灭剂对通过荧光共振能量转移(FRET)相互作用。常在FRET中用作报道分子或猝灭剂的分子包括但不限于荧光染料(例如，FAM、JOE和HEX)、罗丹明染料(例如，R6G、TAMRA、ROX)、花菁染料(例如，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)、DABCYL和EDANS。荧光染料是充当报道分子还是猝灭剂通过其激发和发射光谱来确定，并且通过与其配对的荧光染料来确定。例如，FAM被具有488nm波长的光最有效地激发，并且发射500至650nm光谱的光，并且具有525nm的最大发射波长。FAM是用于与例如最大激发波长为514nm的作为猝灭剂的TAMRA一起使用的合适的报道分子标记物。将从荧光染料所吸收的能量耗散的非荧光或暗猝灭剂(dark quencher)的实例包括由Biosearch Technologies,Inc,(Novato,Calif.,USA)销售的Black Hole Quenchers^TM。Black Hole Quenchers^TM是包含选自取代或未取代的芳基或杂芳基化合物或其组合的至少三个自由基的一类结构，其中这些残基中的至少两个通过环外重氮键连接(参见，例如，国际公开号WO2001086001)。其他暗猝灭剂包括Iowa Black猝灭剂(例如,Iowa Black FQ^TM和Iowa Black RQ^TM)、暗猝灭剂(Epoch Biosciences,Inc,Bothell,Wash.)和Zen^TM猝灭剂(Integrated DNA Technologies,Inc.；Coralville,IA)。还在美国专利号6,465,175中提供了猝灭剂的另外的非限制性实例。

在一些实施方案中，如在美国专利号5,925,517、PCT申请号WO1995013399和美国专利号6,150,097中描述的，使用分子信标寡核苷酸探针来检测结合探针的杂交。在典型的分子信标中，当探针没有与靶标链杂交时，中心靶标识别序列的侧翼为彼此杂交的臂，从而形成发夹结构，在该结构中靶标识别序列在发夹结构的单链环中，而臂序列形成双链茎杂合体。当探针与靶标杂交时，形成相对刚性的螺旋，从而导致茎杂合体解开并迫使臂分离。FRET对，如荧光团EDANS和猝灭剂DABCYL(或本文中所述的或本领域已知的其他对)，可以通过烷基间隔基团与臂连接。当分子信标没有与靶标链杂交时，荧光团的发射被猝灭。当分子信标与靶标链杂交时，FRET对分离，且荧光团的发射没有被猝灭。所发射的荧光标志着靶标链的存在。可以在核酸扩增反应期间，如在PCR反应中的每个循环结束时采用荧光计检测信号。信号强度随靶序列量的增加而增加。

如在Whitcombe等人,Detection Of PCR Products Using Self-probingAmplicons and Fluorescence,Nature Biotechnology 17:804-807(1999年8月)中公开的，PCR产物的检测可以采用自探测扩增子来完成。蝎形引物(Scorpion Primer)携带包含探针元件、自互补茎序列对和荧光团/猝灭剂对的5’延伸部。“保护”延伸部以防止通过纳入嵌段六乙二醇(hexethylene glycol，HEG)单体而被拷贝。在一轮从引物开始的PCR延伸后，新合成的靶区域此时连接至与探针相同的链上。在第二轮变性和退火后，探针和靶标杂交，探针随后发出荧光。因此，如本文中描述的“探针”可以作为引物的一部分而存在。

在多个方面的任一方面的一些实施方案中，在核酸扩增反应中扩增的靶序列是保守的细菌多核苷酸的一部分的序列。在一些实施方案中，保守的多核苷酸的扩增部分在不同的细菌属中表现出约或高于约80％、85％、90％、95％、97.5％或更高的同源性。保守的多核苷酸序列的实例包括但不限于，在16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8SrRNA基因、12S rRNA基因、18S rRNA基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、cox1基因和nifD基因中发现的核苷酸序列。在一些实施方案中，保守的多核苷酸是16S rRNA多核苷酸的一部分(例如，rRNA、rDNA、扩增产物或这些的组合)。近40,000种长度大于1250个核苷酸的对齐的16S rDNA序列的列表可见于Greengenes网络应用(Greengenes web application)，其为由劳伦斯伯克利国家实验室(Lawrence BerkeleyNational Laboratory)运行的可公开访问的数据库。其他可公开访问的数据库包括GenBank、密歇根州立大学(Michigan State University)的核糖体数据库项目(ribosomaldatabase project)、马克斯普朗克海洋微生物研究所的Silva数据库(Max PlanckInstitute for Marine Microbiology's Silva database)和国家卫生研究院(NationalInstitute of Health)的NCBI。扩增靶序列的非限制性实例在表1中示出。在一些实施方案中，扩增子的长度为约或至少约25、50、75、100、125、150或175个核苷酸，并且当最佳对齐时与表1中的序列具有约或至少约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或更高的序列同一性。用于确定最佳序列对齐的方法和算法是本领域已知的，这些中的任一种均可用于确定百分比序列同一性。用于确定两个序列之间的序列同一性的算法的一个实例包括局部序列排比检索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)，如在blast.ncbi.nlm.nih.gov由国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)所维护的。

在多个方面的一些实施方案中，在单个反应中检测多种生物的存在与否和/或量。在一些实施方案中，所检测的生物是微生物，微生物的非限制性实例包括病毒、类病毒、细菌、古菌、真菌和原生动物。在一些实施方案中，微生物是细菌。所检测的细菌可以是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、或革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的组合。可以在单个反应中检测的细菌的非限制性实例包括以下的种或分类阶元所属的种中的一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)：变形菌门(Proteobacteria)、假单胞菌(P.veronii)、脆弱拟杆菌(B.fragilis)、颗粒链菌属(Granulicatella)、毗邻颗粒链菌(Granulicatellaadiacens)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、普拉氏梭杆菌(F.rausnitzii)、梭菌样梭状芽胞杆菌(Clostridium clostridioforme)、萨特氏菌属(Sutterella)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、梭菌属(Fusobacteria)、弯曲菌属(ProteobacteriaCampylobacter)、紫单胞菌属(Parabacteroides)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。在一些实施方案中，检测的所有细菌均采用与在所有待检测的细菌中共享的序列互补的单种探针来检测。侧翼为通用引物对并被其扩增的靶序列可以在具有保守多核苷酸的多种不同生物中是不同的(例如，具有一个或多个插入、缺失、取代或其组合)，在具有保守多核苷酸的多种不同生物中是相同的，或这些的组合。通常，侧翼为通用引物对并被其扩增的靶序列包含核苷酸序列的一个或多个保守内部区域，该保守内部区域在多种不同细菌物种(例如，约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50种或更多种)中是相同的和/或在来自多个不同属(例如，约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个)的细菌中是相同的，该保守内部区域可以用作探针靶标。在一些实施方案中，保守内部区域在多种革兰氏阳性菌中相同而在革兰氏阴性菌中不同，或反之亦然。在一些实施方案中，保守内部区域的长度为约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75、100个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，选择引物使得在待检测的种和/或属中的扩增子序列在待检测的种和/或属中为约或至少约80％、85％、90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，选择引物，以产生在待检测的种和/或属中在靶标长度内的扩增子，如本文所述的任何扩增子长度。

在一些实施方案中，通过扩增的保守内部区域与探针寡核苷酸之间的杂交来检测(并优选地定量)多种细菌种和/或属。通常，来自与保守内部区域特异性杂交的探针的阳性信号指示靶序列的存在，表明至少一种具有该靶序列的生物存在于核酸所来源的样品中。这样，可以采用共有探针来检测多个种和/或属的存在与否和/或量。

在多个方面的任一方面的一些实施方案中，选择引物和探针以最大化靶多核苷酸检测的灵敏度。在一些实施方案中，灵敏度以循环阈值(C_T)来度量。在初始PCR循环中，荧光信号变化很小。这确定了扩增图(荧光强度相对于循环数的图)的基线。基线以上的荧光增加指示积累的PCR产物的检测。固定的荧光阈值可以设置在基线以上。参数C_T定义为荧光超过固定阈值时的部分循环数，该固定阈值通常为统计学上显著高于基线或背景并且在扩增的对数线性阶段中的强度。用于计算给定反应或反应组中荧光的阈值水平的软件通常包含在实时PCR分析软件包中。用于设置阈值的一个常用方法是确定基线(背景)平均信号并设置高于基线平均信号10倍的阈值。或者，阈值可以设置为基线发射的标准差的约10倍。一组标准的初始靶拷贝数的对数相对于C_T的图通常为直线。通过测量C_T并使用标准曲线确定起始拷贝数来完成未知样品中靶标量的定量。在一些实施方案中，检测在约或多于约3、4、5、6、7、8或更多个log中具有线性检测范围。在一些实施方案中，在扩增反应中来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种的约或少于约10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或在其中任何数值之间的范围(例如，0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg等)的基因组DNA的扩增具有小于30的C_T。在一些实施方案中，在扩增反应中可通过探针检测的靶序列的约或少于约15000、10000、5000、2500、1500、1000、500、200、100、50个或更少的起始拷贝的扩增具有小于30的C_T。在一些实施方案中，在扩增反应中来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种的约1pg的基因组DNA的扩增具有约或小于约30、29、28、27、26、25或更小的C_T。在一些实施方案中，在扩增反应中阴性对照样品的C_T比含有约100pg、10pg、5pg、4pg、3pg、2pg、1pg、0.5pg、0.1pg或在其中任何数值之间的范围(例如，0.5-4pg、1pg-5pg、1pg-3pg、5pg-10pg等)的基因组DNA的样品的C_T高至少2个循环(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个循环)，该基因组DNA来自可通过探针检测的细菌物种中的任一种。通常，阴性对照为具有所有反应试剂，但没有添加模板(例如，添加水替代模板，或在细菌特异性扩增子的情况下添加已知缺少靶标扩增子的多核苷酸，如人类基因组DNA)的扩增反应。

在一些实施方案中，DNA扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、PCR的变型(例如，实时PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、非对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR(dial-out PCR)、解旋酶依赖的PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR(miniprimer PCR)、多重PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、热非对称交错PCR(thermalasymmetric interlaced PCR)、递降PCR)以及连接酶链反应(LCR)。在一些情况下，DNA扩增是线性的。在一些情况下，DNA扩增是指数式的。在一些情况下，DNA扩增采用巢式PCR来实现，其可改善检测扩增的DNA产物的灵敏度。

在多个方面，本文所述的这些核酸扩增反应可平行进行。通常，平行的扩增反应是同时在同一反应容器内发生的扩增反应。平行的核酸扩增反应可以如下进行：例如，在反应容器中包括对于各个核酸扩增反应所必需的试剂以获得反应混合物，并且使该反应混合物经受对于各个核酸扩增反应所必需的条件。例如，逆转录扩增和DNA扩增可如下平行地进行：在反应容器中提供对于这两种扩增方法所必需的试剂以形成并获得反应混合物，并使该反应混合物经受适于进行这两个扩增反应的条件。由RNA的逆转录产生的DNA可以平行地进行扩增以产生扩增的DNA产物。任何合适数目的核酸扩增反应可以平行地进行。在一些情况下，平行地进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸扩增反应。

平行进行核酸扩增反应的优点可包括耦合的核酸扩增反应之间的快速转换。例如，可在平行核酸扩增的加热阶段从生物样品中提取或释放靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)。在靶RNA的情况下，例如，可加热包含靶RNA的生物样品并使靶RNA从生物样品中释放。所释放的靶RNA可以立即开始逆转录(经由逆转录扩增)以产生互补DNA。然后可立即扩增该互补DNA，通常在数秒的量级上。靶RNA从生物样品中释放与靶RNA逆转录为互补DNA之间的短时间间隔可有助于使生物样品中可能妨碍逆转录和/或DNA扩增的抑制剂的影响最小化。

在这些多个方面中的任何方面，可使用针对靶核酸的引物组来进行核酸扩增反应。引物组通常包含一种或多种引物。例如，引物组可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物。在一些情况下，引物组可包含针对不同的扩增产物或不同的核酸扩增反应的引物。例如，引物组可包含第一引物和与核酸链产物互补的第二引物，第一引物是生成与靶核酸的至少一部分互补的核酸产物的第一链所必需的，第二引物是生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物的第二链所必需的。

例如，引物组可针对靶RNA。引物组可包含可用于生成与靶RNA的至少一部分互补的核酸产物第一链的第一引物。在逆转录反应的情况下，核酸产物的第一链可以是DNA。引物组还可包含可用于生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物第二链的第二引物。在与DNA扩增平行进行的逆转录反应的情况下，核酸产物的第二链可以是与自RNA模板产生的DNA链互补的核酸(例如，DNA)产物的一条链。

如有需要，可以使用任何合适数目的引物组。例如，可以使用约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物组。当使用多个引物组时，一个或多个引物组可各自对应于特定的核酸扩增反应或扩增产物。

在一些实施方案中，使用DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常指能够以模板结合的方式将核苷酸掺入到DNA链中的酶。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热分布。

在一些实施方案中，使用逆转录酶。可使用任何合适的逆转录酶。逆转录酶通常指在与RNA模板结合时能够将核苷酸掺入到DNA链中的酶。逆转录酶的非限制性实例包括HIV-1逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、端粒酶逆转录酶，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。

在多个方面，使用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。

变性温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约97℃。在一些实例中，变性温度可为约92℃至约95℃。在另外其他的实例中，变性温度可为约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

变性持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，变性持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约72℃。在一些实例中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实例中，延伸温度可为约50℃至约60℃。在另外其他的实例中，延伸温度可为约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

延伸持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，延伸持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

在所述多个方面中的任何方面，可进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可取决于，例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物)所必需的循环数(例如，循环阈值(Ct))。例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)所必需的循环数可以少于约或为约100个循环、75个循环、70个循环、65个循环、60个循环、55个循环、50个循环、40个循环、35个循环、30个循环、25个循环、20个循环、15个循环、10个循环或5个循环。此外，在一些实施方案中，可检测量的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)可以以小于100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的循环阈值(Ct)获得。

扩增产生指示存在所扩增的靶核酸的可检测量的扩增产物所需的时间可根据从中获得靶核酸的生物样品、将要进行的特定核酸扩增反应和所期望的扩增反应的特定循环数而变化。例如，靶核酸的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物。

在一些实施方案中，靶RNA的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物。

在一些实施方案中，可使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括多个循环的特定引物延伸反应，该反应的特征在于，例如，如本文其他地方所述的特定的变性和延伸条件。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。例如，就变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个或全部四个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。

例如，多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。

在一些实施方案中，斜变时间(即，热循环仪从一个温度转变至另一温度所花的时间)和/或斜变速率是扩增中的重要因素。例如，扩增产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物所需的温度和时间可根据斜变速率和/或斜变时间而变化。斜变速率可影响用于扩增的温度和时间。

在一些情况下，斜变时间和/或斜变速率在循环之间可以是不同的。然而在一些情况下，循环之间的斜变时间和/或斜变速率可以是相同的。斜变时间和/或斜变速率可基于正在处理的样品进行调整。

在一些情况下，例如可以根据样品的性质和反应条件来确定不同温度之间的斜变时间。也可根据样品的性质和反应条件来确定精确的温度和孵育时间。在一些实施方案中，可使用多个热循环将单个样品处理(例如，使之经受扩增条件)多次，各个热循环在例如斜变时间、温度和/或孵育时间上不同。随后可为该特定样品选择最好或最佳的热循环。这提供了针对被测试的特定样品或样品组合裁量热循环的稳健而高效的方法。

在一些实施方案中，靶核酸可在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，靶核酸可在执行所述多个系列之前经受变性条件，或者可在所述多个系列之间经受变性条件。例如，靶核酸可在多个系列中的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此等变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。

进行多个系列的引物延伸反应的优点可能在于，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，多个系列的方法以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。与在相若的变性和延伸条件下的单一系列相比，使用多个系列的引物延伸反应可将此等循环阈值减少至少约或大约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方案中，可在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预热温度)和持续时间(例如，预热持续时间)可根据例如所分析的特定生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其他的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。

在一些实施方案中，对于进行核酸扩增所必需的试剂(包括对于进行平行核酸扩增所必需的试剂)还可包括产生可检测信号的报告剂，该可检测信号的存在或不存在指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。例如，在通过平行地逆转录和扩增从逆转录获得的DNA来扩增靶RNA的情况下，对于这两个反应所必需的试剂还可包括可产生可检测信号的报告剂，该可检测信号指示扩增的DNA产物和/或扩增的靶RNA的存在。可检测信号的强度可与扩增的DNA产物和/或扩增的原始靶RNA的量成比例。报告剂的使用还使得实时扩增方法成为可能，包括用于DNA扩增的实时PCR。

报告剂可通过共价或非共价方式与包括扩增产物在内的核酸相连接。非共价方式的非限制性实例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键键合及其组合。在一些实施方案中，报告剂可与初始反应物结合，并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。在一些实施方案中，报告剂可以仅在核酸扩增进行时是可检测的(或不可检测的)。在一些实施方案中，光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性实例包括SYBR绿，SYBR蓝，DAPI，碘化丙啶(propidium iodine)，Hoeste，SYBR金，溴化乙锭，吖啶，原黄素、吖啶橙，吖啶黄，荧光香豆素(fluorcoumanin)，玫瑰树碱，道诺霉素，氯喹，偏端霉素D，色霉素，胡米溴铵(homidium)，光辉霉素，多吡啶钌(ruthenium polypyridyl)，安曲霉素(anthramycin)，菲啶和吖啶，溴化乙锭，碘化丙啶，碘化己啶(hexidium iodide)，二氢乙锭，乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2，单叠氮化乙锭(ethidium monoazide)和ACMA，Hoechst33258，Hoechst 33342，Hoechst 34580，DAPI，吖啶橙，7-AAD，放线菌素D，LDS751，羟茋巴脒(hydroxystilbamidine)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，POPO-1，POPO-3，YOYO-1，YOYO-3，TOTO-1，TOTO-3，JOJO-1，LOLO-1，BOBO-1，BOBO-3，PO-PRO-1，PO-PRO-3，BO-PRO-1，BO-PRO-3，TO-PRO-1，TO-PRO-3，TO-PRO-5，JO-PRO-1，LO-PRO-1，YO-PRO-1，YO-PRO-3，PicoGreen，OliGreen，RiboGreen，SYBR金，SYBR绿I，SYBR绿II，SYBR DX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)，罗丹明，四甲基罗丹明，R-藻红蛋白，Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7，德克萨斯红(Texas Red)，Phar-Red，别藻蓝蛋白(APC)，Sybr绿I，Sybr绿II，Sybr金，CellTracker绿，7-AAD，乙锭同型二聚体I，乙锭同型二聚体II，乙锭同型二聚体III，溴化乙锭，伞形酮，曙红，绿色荧光蛋白，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀绿，茋，荧光黄，级联蓝(cascade blue)，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯，荧光镧系络合物(如那些包括铕和铽的络合物)，羧基四氯荧光素，5和/或6-羧基荧光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰胺基荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)，丽丝胺罗丹明B磺酰氯，5和/或6羧基罗丹明(ROX)，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，BODIPY荧光团，8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺，藻胆蛋白，AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料，或其他荧光团。

在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。由于探针与扩增产物的序列特异性结合，寡核苷酸探针的使用可提高检测的特异性和灵敏度。探针可连接至本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)，并且还可包括能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针或Lion探针。

在一些实施方案中，报告剂可以是RNA寡核苷酸探针，其包含光学活性染料(例如，荧光染料)和相邻地位于探针上的猝灭剂。染料与猝灭剂的紧密靠近可阻断染料的光学活性。探针可与待扩增的靶序列结合。一旦在扩增期间DNA聚合酶的外切核酸酶活性使探针断裂，则猝灭剂与染料分离，而游离的染料重新获得其光学活性，该活性随后可被检测到。

在一些实施方案中，报告剂可以是分子信标(molecular beacon)。分子信标包括，例如，在发夹构象的寡核苷酸的一端上连接的猝灭剂。在该寡核苷酸的另一端是光学活性染料，例如，荧光染料。在发夹构型中，光学活性染料和猝灭剂足够紧密地接近，使得猝灭剂能够阻断染料的光学活性。然而，一旦与扩增产物杂交，该寡核苷酸即呈线性构象并与该扩增产物上的靶序列杂交。寡核苷酸的线性化导致光学活性染料与猝灭剂的分离，从而使得光学活性恢复，并且可被检测到。分子信标对扩增产物上的靶序列的序列特异性可改善检测的特异性和灵敏度。

在一些实施方案中，报告剂可以是放射性种类。放射性种类的非限制性实例包括¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、Tc^99m、³⁵S或³H。

在一些实施方案中，报告剂可以是能够产生可检测信号的酶。可检测信号可通过酶对其底物，或在酶具有多个底物的情况下对特定底物的活性来产生。可用作报告剂的酶的非限制性实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I²-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和萤光素酶。

在多个方面，可检测扩增产物(例如，扩增的DNA产物、扩增的RNA产物)。扩增产物(包括扩增的DNA)的检测可采用本领域已知的任何合适的检测方法来实现。所使用的检测方法的具体类型可取决于，例如，具体的扩增产物，用于扩增的反应容器的类型，反应混合物中的其他试剂，报告剂是否包括在反应混合物中，以及在使用报告剂时所使用的报告剂的具体类型。检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测、电化学检测等。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)波谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在扩增产物的高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。

6.测序方法

在一些实施方案中，本发明涉及测序方法。在一些实施方案中，所述测序方法是第二代测序或第三代测序。在一些实施方案中，通过测序获得微生物的种类，其可包括：

iii.基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

在一些实施方案中，本发明包括提供了准备用于测序的扩增就绪的产物。在一些实施方案中，将靶多核苷酸合并，随后对集合体中的一种或多种多核苷酸进行测序。利用掺有衔接子的序列的测序方法是本领域公知的，并进一步描述于例如美国专利号8,053,192和8,017,335中。

测序过程通常为模板依赖的。当在模板介导的合成反应例如引物延伸反应过程中添加单个碱基或一组碱基时，利用模板依赖性合成的核酸序列分析对所述单个碱基或一组碱基进行鉴别，其中碱基的身份与合成过程中引物序列所杂交的模板序列互补。其他这样的过程包括连接驱动的过程，其中寡核苷酸或多核苷酸与基础的(underlying)模板序列复合，从而鉴定该序列中的核苷酸序列。一般来说，此类过程是酶介导的，其使用核酸聚合酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等，或其他酶，例如对连接驱动的过程而言，例如，连接酶。

使用模板依赖性合成的序列分析可以包括很多不同的过程。例如，在广泛使用的四色Sanger测序方法中，使用一组模板分子创建互补性片段序列的群体。在四种天然存在的核苷酸的存在下，用一个亚群的染料标记的终止子核苷酸例如双脱氧核糖核苷酸进行引物延伸，其中每种类型的终止子(ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP)包括不同的可检测标记。结果创建了一组嵌套片段，其中该片段在超出引物的序列中的每个核苷酸处终止，并以允许鉴定终止核苷酸的方式进行标记。然后对嵌套片段群体进行基于大小的分离，例如，使用毛细管电泳，并对与每个不同大小的片段相关联的标记进行鉴定以确定终止核苷酸。结果，移动经过分离系统中的检测器的标记的序列提供了对合成片段的序列信息的直接读出，且根据互补性，也提供了对基础的模板信息的直接读出(参见，例如美国专利号5,171,534，其为了所有目的通过引用整体并入本文)。

模板依赖性测序方法的其他实例包括合成测序方法，其中单独的核苷酸在被添加至正在伸长的引物延伸产物时迭代地进行鉴定。

焦磷酸测序是合成测序方法的一个例子，其通过分析得到的合成混合物中测序反应副产物即焦磷酸的存在与否来鉴定核苷酸的掺入。具体地，使引物/模板/聚合酶复合物与单一类型的核苷酸接触。如果该核苷酸被掺入，则聚合反应裂解三磷酸链的α和β磷酸之间的核苷三磷酸，从而释放焦磷酸。然后使用化学发光酶报道系统鉴定释放的焦磷酸的存在，该化学发光酶报道系统将焦磷酸与AMP转化为ATP，然后通过使用萤光素酶产生可测定的光信号来测定ATP。当检测到光时，碱基被掺入，当检测不到光时，碱基未被掺入。在适当的洗涤步骤后，使多种不同的碱基循环地与复合物接触，以依次鉴定模板序列中的后续碱基。参见，例如美国专利号6,210,891，其为了所有目的通过引用整体并入本文。

在相关的方法中，将引物/模板/聚合酶复合物固定化于基底上，并且使该复合物与标记的核苷酸接触。复合物的固定化可通过引物序列、模板序列和/或聚合酶来进行，并且可以是共价的或非共价的。例如，复合物的固定化可通过聚合酶或引物与基底表面之间的连接来实现。该附接可使用多种连接类型，例如，包括使用例如生物素-PEG-硅烷连接化学来提供生物素化的表面成分，随后对待固定化的分子进行生物素化，然后通过例如链霉亲和素桥进行连接。其他合成偶联化学以及非特异性蛋白质吸附也可用于固定化。在可替代的构型中，提供具有和不具有可去除的终止子基团的核苷酸。一旦掺入，标记就与复合物偶联，从而是可检测的。对于携带终止子的核苷酸，使单独携带可识别标记的全部四种不同的核苷酸与复合物接触。由于终止子的存在，标记核苷酸的掺入阻止了延伸，并将标记加至复合物上。然后从掺入的核苷酸上去除标记和终止子，并在适当的洗涤步骤后重复该过程。对于非终止的核苷酸，向复合物中加入单一类型的标记核苷酸，以确定其是否将被掺入，如焦磷酸测序一样。在去除核苷酸上的标记基团和适当的洗涤步骤后，该多种不同核苷酸在相同过程中通过反应混合物进行循环。参见，例如美国专利号6,833,246，其为了所有目的通过引用整体并入本文。例如，Illumina基因组分析仪系统(Illumina Genome AnalyzerSystem)基于通过引用并入于此的WO 98/44151中描述的技术，其中DNA分子通过锚探针结合位点(也称为流动池结合位点)与测序平台(流动池)结合并在载玻片上原位扩增。然后DNA分子与测序引物退火并使用可逆终止子方法逐个碱基地平行测序。一般而言，Illumina基因组分析仪系统使用8通道流动池，产生18-36个碱基长度的测序读取值，每轮产生>1.3Gbp的高质量数据。因此，本发明的方法可用于通过如美国专利号5,750,341、6,306,597和5,969,119所述的、由Illumina商业化的方法进行测序。使用本发明的方法制备定向(链特异性)cDNA文库，并通过例如PCR对选定的单链核酸进行扩增。然后使得到的核酸变性，并将单链扩增的多核苷酸随机地附接至流动池通道的内表面。加入未标记的核苷酸来启动固相桥式扩增以产生双链DNA的密集簇。为了启动第一碱基测序循环，加入四种标记的可逆终止子、引物和DNA聚合酶。在激光激发之后，对来自流动池上的每个簇的荧光进行成像。然后记录每个簇的第一碱基的身份。进行测序循环以便每次一个碱基地确定该片段序列。

在另一合成测序方法中，进行模板依赖性合成时对不同标记的核苷酸的掺入进行实时观察。具体地，在掺入荧光标记的核苷酸时观察单个固定化的引物/模板/聚合酶复合物，从而在每个碱基加入时允许对每个加入的碱基进行实时鉴定。在该过程中，将标记基团附接至在掺入过程中被裂解的核苷酸的一部分上。例如，通过将标记基团附接至在掺入过程中被去除的磷酸链的一部分上，即核苷多磷酸上的α、β、γ或其他末端磷酸基团上，该标记没有被掺入新生链中，而是相反，产生了天然DNA。对单个分子的观察通常涉及将复合物光学限制在非常小的照明体积内。通过光学限制该复合物，产生了监测区域，在该区域中随机扩散的核苷酸存在非常短的一段时间，而掺入的核苷酸由于其正在被掺入而在观察体积内保持较长时间。这导致与掺入事件相关联的特征信号，其特征也在于所正在添加的碱基所特有的信号谱。在相关方面，在聚合酶或复合物的其他部分和正在掺入的核苷酸上提供相互作用的标记组分，例如荧光共振能量转移(FRET)染料对，以便掺入事件使标记组分交互接近(interactive proximity)，并产生特征信号，这同样也是正在掺入的碱基所特有的(参见，例如美国专利号6,056,661、6,917,726、7,033,764、7,052,847、7,056,676、7,170,050、7,361,466、7,416,844和公开的美国专利申请号2007-0134128，其全部公开内容为了所有目的通过引用全部并入本文)。

在一些实施方案中，样品中的核酸可以通过连接进行测序。该方法使用DNA连接酶来鉴定靶序列，例如，如在聚合酶集落方法和SOLiD技术(Applied Biosystems，现为Invitrogen)中使用的那样。通常，提供所有可能的固定长度寡核苷酸的集合体，根据测序的位置对其进行标记。将寡核苷酸退火并连接；通过DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生对应于该位置处的互补序列的信号。

因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括制备靶多核苷酸，以供通过由Applied Biosystems商业化的连接测序方法(例如，SOLiD测序)进行测序。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以供使用由454/Roche Life Sciences商业化的方法(包括但不限于在Margulies等人,Nature(2005)437:376-380(2005)和美国专利号7,244,559、7,335,762、7,211,390、7,244,567、7,264,929及7,323,305中所述的方法和装置)进行合成测序。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以供如美国申请序列号11/167,046和美国专利号7,501,245、7,491,498、7,276,720以及美国专利申请公开号US20090061439、US20080087826、US20060286566、US20060024711、US20060024678、US20080213770和US20080103058中所述，通过由Helicos BioSciences Corporation(Cambridge,Mass.)商业化的方法进行测序。在其他实施方案中，这些方法可用于制备靶多核苷酸，以供如美国专利号7,462,452、7,476,504、7,405,281、7,170,050、7,462,468、7,476,503、7,315,019、7,302,146、7,313,308和美国申请公开号US20090029385、US20090068655、US20090024331和US20080206764中所述，通过由Pacific Biosciences商业化的方法进行测序。通常，可以通过本发明的方法制备双链片段多核苷酸。该多核苷酸随后可固定化于零模波导阵列(zero mode waveguide array)中。该方法可包括使得与波导阵列结合的核酸成为单链或部分单链的步骤。将聚合酶和标记的核苷酸添加至反应混合物中，并且通过附接至核苷酸的末端磷酸基团的荧光标记而对核苷酸掺入进行可视化。作为核苷酸掺入的一部分，将荧光标记剪切掉。在一些情况下，使用环状模板来实现单个分子上的多次读取。

可在提供的本发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是纳米孔测序(参见，例如Soni G V和Meller A.(2007)Clin Chem 53:1996-2001)。纳米孔可以是直径为1纳米等级的小孔。纳米孔在传导流体中的浸没以及跨纳米孔的电势的施加由于离子通过纳米孔的传导而可导致轻微的电流。流动的电流量对纳米孔的大小是敏感的。随着DNA分子通过纳米孔，DNA分子上的各个核苷酸以不同的程度阻塞纳米孔。因此，当DNA分子通过纳米孔时通过纳米孔的电流的变化可代表对DNA序列的读取。

可在提供的本发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是由Ion Torrent提供的半导体测序(例如，使用Ion Personal Genome Machine(PGM))。Ion Torrent的技术可使用具有多个层(例如，具有微机械加工的孔的层、离子敏感性层和离子传感器层)的半导体芯片。可将核酸引入孔中，例如，可将单个核酸的克隆群体附接至单个珠上，并且可将该珠引入孔中。为了启动在珠上的核酸的测序，可将一种类型的脱氧核糖核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP或dTTP)引入孔中。当通过DNA聚合酶掺入一种或多种核苷酸时，在孔中释放出质子(氢离子)，这可以通过离子传感器来检测。然后可以洗涤半导体芯片，并且可利用不同的脱氧核糖核苷酸重复该过程。可在半导体芯片的孔中对多种核酸进行测序。半导体芯片可包含化学敏感性场效应晶体管(chemFET)阵列以对DNA进行测序(例如，如美国专利申请公开号20090026082中所述)。一种或多种三磷酸在测序引物的3’端处向新核酸链中的掺入可通过用chemFET测量的电流的变化来检测。阵列可具有多个chemFET传感器。

在一些实施方案中，所述方法可包括以链特异性方式从特定目的序列区域的选择性富集群体制备靶多核苷酸，以供通过本领域熟知的并在下文进一步描述的方法进行测序。

例如，所述方法可用于通过由Illumina商业化的方法进行测序，如在美国专利号5,750,341、6,306,597和5,969,119中所述。通常，可以通过本发明的方法制备双链片段多核苷酸，以产生在一端(例如(A)/(A’))或两端(例如，(A)/(A’)和(C)/(C’))标记的扩增的核酸序列。在一些情况下，通过本发明的方法(例如，通过SPIA或线性PCR)扩增在一个或两个末端标记的单链核酸。然后使获得的核酸变性，并且将扩增的单链多核苷酸随机地附接至流动池通道的内表面上。加入未标记的核苷酸以启动固相桥式扩增，从而产生双链DNA的密集簇。为了启动第一碱基测序循环，加入四种标记的可逆终止子、引物和DNA聚合酶。在激光激发后，对来自流动池上的每个簇的荧光进行成像。然后记录每个簇的第一个碱基的身份。进行测序循环以便每次一个碱基地确定该片段序列。对于配对末端测序，例如，当通过本发明的方法对多核苷酸在两端进行标记时，测序模板可在原位再生，使得也可对该片段的相对端进行测序。

7.定量和统计方法

在一些实施方案中，本发明的方法可包括确定所述多种微生物中至少一种微生物的相对数量、绝对数量、相对浓度或绝对浓度。在本发明的上下文中，样品中微生物的数量可标示为质量、物质的量、或微生物个数。相应地，样品中微生物的浓度可为质量浓度、摩尔浓度、或个数浓度。如果样品是液体，则所述质量浓度、摩尔浓度、或个数浓度可表示为微生物的质量/物质的量/个数与所述液体体积之比。如果所述生物样品是固体，但是经处理成为裂解液、悬液、提取液、或匀浆液，则可用由此产生的裂解液、悬液、提取液、或匀浆液替代上述液体体积。此外，如果所述微生物是细菌或真菌，则微生物的数量可通过菌落形成单位(cfu)来测量。相应地，所述微生物的浓度可表示为cfu与如本文中所定义的样品体积之比，例如cfu/ml。

所述微生物的数量或浓度可归一化从而使得所述数量或浓度可在多个不同的样品之间进行比较。所述不同的样品可为从不同环境获得的样品。所述不同的样品可为从同一环境在不同时间获得的样品。所述不同的样品可为从同一环境取得的样品的不同分试样(aliquot)。例如，所述数量或浓度可通过内标来归一化。所述内标可代表所述样品相对恒定的组分的数量或浓度。当某种组分的数量或浓度在取得样品的条件下获得的不同样品之间不浮动(即，彼此相差10％、5％、1％或更低半分比之内)的情况下，可认为该组分是相对恒定的。在一些实施方案中，所述内标可为另一种微生物的数量或浓度。

样品中微生物的相对数量可表示为微生物的数量和另一种参考数量之比。在一些实施方案中，所述参考数量是样品中的所有微生物的数量，或其一个或多个子集的数量。在一些实施方案中，所述参考数量是所有列表1的微生物的数量，或其一个或多个子集的数量。在一些实施方案中，所述参考数量是某种得顶微生物的数量。在一些实施方案中，所述微生物的参考数量是另一种特定微生物的数量(其可为列表1中的微生物，或其他微生物)。

样品中微生物的相对浓度可表示为微生物的浓度和另一种参考浓度之比。在一些实施方案中，所述参考浓度是样品中的所有微生物的浓度，或其一个或多个子集的浓度。在一些实施方案中，所述参考浓度是所有列表1的微生物的浓度，或其一个或多个子集的浓度。在一些实施方案中，所述参考浓度是某种得顶微生物的浓度。在一些实施方案中，所述微生物的参考浓度是另一种特定微生物的浓度(其可为列表1中的微生物，或其他微生物)。

在一些实施方案中，所述样品中的多种微生物可来自相同类别，其中所述类别为：细菌、病毒、原生生物、古菌和真菌。在一些实施方案中，所述多种微生物可为细菌。在一些实施方案中，所述多种微生物可为病毒。在一些实施方案中，所述多种微生物可为原生生物。在一些实施方案中，所述多种微生物可为古菌。在一些实施方案中，所述多种微生物可为真菌。在一些实施方案中，所述样品中的多种微生物可来自不同类别，其中所述类别为：细菌、病毒、原生生物、古菌和真菌。在一些实施方案中，所述样品中的多种微生物可来自至少两种(例如2、3、4或全部5种)不同类别，其中所述类别为：细菌、病毒、原生生物、古菌和真菌。

在一些实施方案中，评估了样品中来自1、2、3、4、5、10、15、25、50、100、500、1000、5000或更多种微生物的存在、不存在、数量或浓度，以确定所述样品的微生物分布谱。

在一些实施方案中，在具有相同的特定参数值组成的集合的至少1、2、3、4、5、10、15、25、50、100、500、1000、5000或更多个样本中检测了来自1、2、3、4、5、10、15、25、50、100、500、1000、5000或更多种微生物的存在、不存在、数量或浓度，以确定以具有该特定参数值组成的集合标记的参考微生物分布谱。

在一些实施方案中，在一段时间内检测了来自1、2、3、4、5、10、15、25、50、100、500、1000、5000或更多种微生物的存在、不存在、数量或浓度，以确定在该一段时间内，所述微生物分布谱的变化。在一些实施方案中，所述一段时间为约或至少1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、20日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或多于1年。

所述多种微生物的数量或浓度、相对数量或相对浓度、以及微生物分布谱可以是加权的。例如，可对每种微生物分配一个系数，所述系数反映所述微生物对于某种特定参数值组成的集合的影响因子。因此，本发明方法可包括下述操作步骤，其中对所述数量和浓度、相对数量和相对浓度、以及微生物分布谱(包括参考微生物分布谱)进行操作，使得对所述多种微生物的数量或浓度、相对数量或相对浓度、以及微生物分布谱赋以权重。这些系数可用于计算本文中所述的微生物的数量和浓度、相对数量和浓度、以及微生物分布谱的加权总和或加权平均值。这种加权总和或加权平均值可用来与参考微生物分布谱进行比较，用于将样品的微生物分布谱与参考微生物分布谱相关联。

微生物的数量或浓度、相对数量或相对浓度、或微生物分布谱的变化可以表示为所述微生物的数量或浓度、相对数量或相对浓度、或微生物分布谱对时间的一阶或二阶导数。所述微生物数量或浓度、相对数量或相对浓度、或微生物分布谱对时间的一阶或二阶导数达到或超过阈值可提供微生物群体是否扩展、缩小、保持不变、加速或减速生长或衰退方面的信息。

在一些实施方案中，本发明涉及将物样品的微生物分布谱与多个参考微生物分布谱相比较。在一些实施方案中中，所述比较确定了与所述样品的微生物分布谱差异在预定的阈值之内的所有候选参考微生物分布谱。

在一些实施方案中，根据上述比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联。

在一些实施方案中，所述关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

计算置信水平的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，使用参数统计检验确定统计显著性和置信水平。所述参数统计检验可包括但不限于，部分析因设计、方差分析(ANOVA)、t检验、最小二乘法、皮尔逊相关、简单线性回归、非线性回归、多元线性回归或多元非线性回归。或者，所述参数统计检验可包含单因素方差分析、双因素方差分析或重复测量方差分析。在其它实施方案中，使用非参数统计检验确定统计显著性和置信水平。其实例包括但不限于，威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)、曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)、Kruskal-Wallis检验、弗里德曼检验(Friedman test)、斯皮尔曼秩次相关系数(Spearman ranked order correlation coefficient)、Kendall Tau分析和非参数回归检验。在一些实施方案中，统计显著性在低于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001的p值下确定。还可针对多重比较校正p值，例如使用邦弗朗尼校正(Bonferroni correction)、其改进方法或本领域的技术人员所知的其它技术，如Hochberg校正、Holm-Bonferroni校正、校正、Dunnett's校正或Tukey’s多重比较。在一些实施方案中，为进行来自各群体的生物标志物的检验后比较，在ANOVA后进行了Tukey’s校正。

在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记。

在本发明的实施方案中，可使用本领域技术人员公知的任何统计方法对数据进行处理。

常规细胞学或其他分析的结果可以指示样品为阴性(无癌症、疾病或病症)、不明确或疑似(提示癌症、疾病或病症的存在)、诊断性(癌症、疾病或病症的阳性诊断)或非诊断性(对于癌症、疾病或病症的存在或不存在提供的信息不够)。诊断结果还可以分为恶性或良性。诊断结果也可以提供得分，例如指示癌症的严重性或等级，或精确诊断的可能性。在一些情况下，诊断结果可以指示特定类型的癌症、疾病或病症，例如大肠的增生性息肉、赘生性息肉(如腺瘤)、错构瘤性息肉、炎性息肉、腺癌、粘液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌、原发性结肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、或鳞状细胞癌或本发明提供的任何疾病或病症。在一些情况下，诊断结果可以指示癌症、疾病或病症的特定阶段。所述诊断结果可以为所诊断的特定癌症疾病或病症的类型或阶段提示特定治疗或治疗性干预。在一些实施方案中，所进行的分析的结果可以进入数据库。经营微生物分布谱的企业可以为以下一项或多项向个体、保险提供者、医疗提供者或政府机构收费：所进行的分析、咨询服务、报告结果、数据库访问或数据分析。在一些情况下除了微生物分布谱关联之外的所有或一些步骤可由细胞学实验室或医学专业人员进行。

经营微生物分布谱的企业可以通过与个体直接接触或通过中介例如医师、第三方测试中心或实验室或者医学专业人员而要求额外的样品。在一些情况下，使用经营微生物分布谱的企业的方法和组合物与一些或所有细胞学染色或其他诊断方法结合来分析样品。在其他情况下，可使用经营微生物分布谱的企业的方法和组合物而不预先使用常规细胞学染色或其他诊断方法直接分析样品。在一些情况下，微生物分布谱单独的结果或与细胞学或其他分析结合的结果可以使本领域技术人员能够为受试者诊断或建议治疗。在一些情况下，微生物分布谱可以单独使用或与细胞学方法结合使用来监测肿瘤或疑似肿瘤随着时间的恶性变化。

灵敏度和特异性是二元分类试验的性能的统计度量。完美的分类预测指标(predictor)被描述为100％灵敏(即，将来自患病组的所有人预测为患病)和100％特异(即，不将来自健康组的任何人预测为患病)；然而，理论上任何分类预测指标将具有最小误差。(Altman DG,Bland JM(1994)."Diagnostic tests Sensitivity and Specificity".BMJ 308(6943):1552和Loong T(2003)."Understanding sensitivity and specificitywith the right side of the brain".BMJ 327(7417):716-719)。

在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌状态状态实现了选自大于60％真阳性、70％真阳性、75％真阳性、85％真阳性、90％真阳性、95％真阳性或99％真阳性的灵敏度。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌状态实现了选自大于60％真阴性、70％真阴性、75％真阴性、85％真阴性、90％真阴性、95％真阴性或99％真阴性的特异性。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合排除了或没有确定大肠癌的存在与否。在本公开方法的一个方面，通过附加试验如结肠镜检查、其他成像方法或诊断试验或手术来确认大肠癌状态的存在与否。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌状态实现了选自大于70％真阳性和小于30％真阴性、75％真阳性和小于25％真阴性、85％真阳性和小于15％真阴性、90％真阳性和小于10％真阴性、95％真阳性和小于5％真阴性、或99％真阳性和小于1％真阴性的灵敏度和特异性。

在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌的存在与否实现了选自大于70％真阳性、75％真阳性、85％真阳性、90％真阳性、95％真阳性或99％真阳性的灵敏度。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌的存在与否实现了选自大于70％真阴性、75％真阴性、85％真阴性、90％真阴性、95％真阴性或99％真阴性的特异性。在本公开方法的一个方面，不检测大肠癌的存在与否。在本公开方法的一个方面，通过附加试验如结肠镜检查、其他成像方法或诊断试验或手术来确认大肠癌的存在与否。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的大肠癌的存在与否实现了选自大于70％真阳性和小于30％真阴性、75％真阳性和小于25％真阴性、85％真阳性和小于15％真阴性、90％真阳性和小于10％真阴性、95％真阳性和小于5％真阴性、或99％真阳性和小于1％真阴性的灵敏度和特异性。

在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤的存在与否实现了选自大于70％真阳性、75％真阳性、85％真阳性、90％真阳性、95％真阳性或99％真阳性的灵敏度。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤的存在与否实现了选自大于70％真阴性、75％真阴性、85％真阴性、90％真阴性、95％真阴性或99％真阴性的特异性。在本公开方法的一个方面，通过附加试验如结肠镜检查、其他成像方法或诊断试验或手术来确认腺瘤性息肉或息肉样腺瘤。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤的存在与否实现了选自大于70％真阳性和小于30％真阴性、75％真阳性和小于25％真阴性、85％真阳性和小于15％真阴性、90％真阳性和小于10％真阴性、95％真阳性和小于5％真阴性、或99％真阳性和小于1％真阴性的灵敏度和特异性。

在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的有蒂息肉和无蒂息肉的存在与否实现了选自大于70％真阳性、75％真阳性、85％真阳性、90％真阳性、95％真阳性或99％真阳性的灵敏度。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的有蒂息肉和无蒂息肉的存在与否实现了选自大于70％真阴性、75％真阴性、85％真阴性、90％真阴性、95％真阴性或99％真阴性的特异性。在本公开方法的一个方面，通过附加试验如结肠镜检查、其他成像方法或诊断试验或手术来确认有蒂息肉和无蒂息肉的存在与否。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对受试者的有蒂息肉和无蒂息肉的存在与否实现了选自大于70％真阳性和小于30％真阴性、75％真阳性和小于25％真阴性、85％真阳性和小于15％真阴性、90％真阳性和小于10％真阴性、95％真阳性和小于5％真阴性、或99％真阳性和小于1％真阴性的灵敏度和特异性。

在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对根据细胞发育异常或恶变前的程度表征的受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤实现了选自大于70％真阳性、75％真阳性、85％真阳性、90％真阳性、95％真阳性或99％真阳性的灵敏度。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对根据细胞发育异常或恶变前的程度表征的受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤实现了选自大于70％真阴性、75％真阴性、85％真阴性、90％真阴性、95％真阴性或99％真阴性的特异性。在本公开方法的一个方面，通过附加试验如结肠镜检查、其他成像方法或诊断试验或手术来确认根据细胞发育异常或恶变前的程度表征的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤。在本公开方法的一个方面，使用全部或一些生物标志物或生物标志物的组合针对根据细胞发育异常或恶变前的程度表征的受试者的腺瘤性息肉或息肉样腺瘤实现了选自大于70％真阳性和小于30％真阴性、75％真阳性和小于25％真阴性、85％真阳性和小于15％真阴性、90％真阳性和小于10％真阴性、95％真阳性和小于5％真阴性、或99％真阳性和小于1％真阴性的灵敏度和特异性。

可使用特征选择技术分析各样品的所得强度值，所述特征选择技术包括通过观察数据的本征性质评估特征的相关性的过滤器技术；将模型假设嵌入特征子集检索内的包装器方法(wrapper method)；以及其中最优特征集的检索构建立到分类器算法中的嵌入技术。

用于本发明方法的过滤器技术包括(1)参数法，例如利用两个样品t-检验、ANOVA分析、贝叶斯框架和伽马分布模型；(2)无模型法(model free method)，例如利用Wilcoxon秩和检验、类间内平方和检验、秩产物法(rank products method)、随机排列法或TNoM，其包括设置两个数据集之间表达的成倍差异(fold-change difference)的阈值点，然后检测最小化误分类数目的各基因的该阈值点；(3)和多变量法，例如二变量法、基于相关性的特征选择法(CFS)、最小冗余最大相关法(MRMR)、Markov毯过滤法和非相关收缩质心法(uncorrelated shrunken centroid method)。可用于本发明方法的包装器方法包括顺序检索法、遗传算法和分布式算法的评估。可用于本发明方法的嵌入方法包括随机森林算法、支持向量机算法的权向量和逻辑回归算法的权重。Bioinformatics.2007年10月，1；23(19)：2507-17提供了用于分析强度数据的以上提供的过滤器技术的相对优点的综述。

然后可使用分类器算法对选定的特征分类。例证性的算法包括但不限于减少变量数目的方法，例如主成分分析算法、部分最小二乘法和独立成分分析算法。例证性的算法还包括但不限于直接处理大量变量的方法，例如统计方法和基于机器学习技术的方法。统计方法包括惩罚逻辑回归、微阵列的预测分析(PAM)、基于收缩质心的方法、支持向量机分析和正则化线性判别分析。机器学习技术包括装袋程序(bagging procedure)、加速程序(boosting procedure)、随机森林算法及其组合。Cancer Inform.2008；6：77-97提供了用于分析微阵列强度数据的上述提供的分类技术的综述。

在一些情况下，原始数据，例如微生物分布谱数据，可通过应用设计来标准化和/或提高数据可靠性的算法而改进。在本发明的一些实施方式中，由于需处理大量单个数据点，数据分析需要计算机或其他装置、机器或仪器以应用本发明描述的多种算法。“机器学习算法”是指用于表征基因表达谱的基于计算的预测方法，本领域技术人员也称为“分类器”。例如由基于微阵列的杂交分析获得的对应于某些表达水平的信号通常进行所述算法，从而分类所述表达谱。监督的学习通常包括“训练”分类器以识别各类别之间的区别，然后“测试”分类器在独立测试集的准确性。对于新的未知样品，所述分类器可用于预测样品所属的种类。

在一些情况下，加强的多阵列平均(RMA)法可用于标准化原始数据。RMA法通过计算多个微阵列上各匹配细胞的背景校正强度开始。背景校正的值被限制为正值，如Irizarry等的Biostatistics 2003April 4(2)：249-64所描述的。背景校正后，然后获得各背景校正的匹配细胞强度的基础-2对数。然后使用分位数归一化法标准化各微阵列上的背景校正的、对数转化的匹配强度，其中对于各输入阵列和各探针表达值，用所有阵列百分点的平均值替换阵列百分位探针值，该方法由Bolstad等的Bioinformatics 2003更完整地描述。分位标准化后，然后标准化数据可以拟合线性模型以获得各微阵列上的各探针的表达测量值。然后Tukey中位数平滑算法(Tukey,J.W.,Exploratory Data Analysis.1977)可用于确定标准化探针集数据的对数级表达水平。

对微生物分布谱的数据分析方法还可以包括使用特征选择算法。在本发明的一些实施方式中，通过利用LIMMA软件包(Smyth,G.K.(2005).Limma：linear models formicroarray data.In：Bioinformatics and Computational Biology Solutions using Rand Bioconductor,R.Gentleman,V.Carey,S.Dudoit,R.Irizarry,W.Huber(eds.),Springer,New York,pages397-420)提供特征选择。

对微生物分布谱的数据分析方法还可以包括使用预分类器算法。例如，算法可利用细胞-特异性分子指纹根据其组成预分类样品，然后应用校正/标准化因子。然后该数据/信息可输入将整合该信息以有利于最终诊断的最终分类算法中。

对微生物分布谱的数据分析方法还可以包括使用本发明提供的分类器算法。在本发明的一些实施方式中，提供支持向量机(SVM)算法、随机森林算法或其组合用于微阵列数据的分类。在一些实施方案中，基于统计显著性选择区分样品(例如对应不同参数集合的参考分布谱)的识别标志物。在一些情况下，将Benjamini Hochberg校正应用于错误发现率(FDR)后进行统计显著性选择。

在一些情况下，所述分类器算法可以以荟萃分析方式进行补充，例如由Fishel和Kaufman等，2007Bioinformatics 23(13)：1599-606描述的方式。在一些情况下，该分类器算法可以补充以荟萃分析方式进行补充，例如再现性分析。在一些情况下，所述再现性分析选择出现在至少一个预测的表达产物标志物集中的标志物。

在一些情况下，特征选择和分类的结果可使用贝叶斯后分析法(Bayesian post-analysis method)分级。例如，可使用本领域已知方法例如本发明提供的方法来提取、标准化和总结微阵列数据。然后数据可以进行特征选择步骤，例如本领域已知的任何特征选择方法，包括但不限于LIMMA中提供的特征选择方法。然后所述数据可以进行分类步骤，例如本领域已知的任何分类方法，包括但不限于使用SVM或随机森林算法。然后可以根据后验概率函数分级分类器算法的结果。例如，后验概率函数可以由检验已知微生物分布谱的关联结果(例如已公布结果)以从将样品的微生物分布谱与参考微生物分布谱相关联的I型和II型误差率中导出先验概率而得到。可基于各研究报告的样品大小使用估计的倍数变化值(例如1.1、1.2.、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.4、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或以上)来计算这些误差率。然后这些先验概率可以和本发明的微生物分布谱数据集结合以评估差异基因表达的后验概率。最后，所述后验概率评估可与本发明第二数据集结合以创制差异表达的最终后验概率。用于导出后验概率并将后验概率应用于数据分析的其他方法是本领域已知的，且已例如描述在Smyth,G.K.2004Stat.Appl.Genet.Mol.Biol.3：Article 3中。在一些情况下，所述后验概率可用于分级由分类器算法提供的标志物。在一些情况下，可以根据其后验概率分级微生物种类，且可选择通过所选阈值的那些作为其差异表达指示特定参数的集合的样品的标志物。示例性的阈值包括0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.925、0.95、0.975、0.98、0.985、0.99、0.995或更高的先验概率。

微生物分布谱结果可分类为以下之一：阴性(无癌症、疾病或病症)、诊断的(癌症、疾病或病症的阳性诊断)、不确定或疑似的(提示癌症、疾病或病症)或非诊断的(对于癌症、疾病或病症的存在或不存在提供的信息不够)。在一些情况下，诊断结果还可以分类癌症、疾病或病症的类型。在其他情况下，诊断结果可以指示涉及癌症疾病或病症的特定分子途径，或特定癌症疾病或病症的特定等级或阶段。在再其他情况下诊断结果可以告知适当的治疗性干预，例如特定的药物方案(如化疗剂，例如氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡培他滨、亚叶酸、伊立替康、贝伐单抗或本领域已知的任何药物，或其组合)或外科手术介入(如结肠镜手术、开腹手术、腹腔镜手术、结肠造口术等等)。

在本发明的一些实施方式中，使用训练算法分类结果。本发明的训练算法包括使用已知的恶性、良性和正常样品(包括但不限于表2所列样品)的参考集开发的算法。适于样品分类的算法包括但不限于k-最近邻算法、概念向量算法(concept vector algorithm)、朴素贝叶斯算法、神经网络算法、隐马尔可夫模型算法、遗传算法和互信息特征选择算法或其任何组合。在一些情况下，本发明的训练算法可以整合除了基因组DNA多态性数据(例如拷贝数变异数据)、基因表达数据可变剪接数据以外的数据例如但不限于本发明的细胞学家或病理学家进行的评估或诊断、由本发明的预分类器算法提供的信息或本发明受试者的病史信息。

在一些实施方案中，使用用于使微生物分布谱与特定表型相关的本领域已知方法评估微生物分布谱结果，所述表型例如恶性肿瘤、恶性肿瘤的类型(例如腺癌、平滑肌肉瘤等)、恶性肿瘤分期(例如本文中其他部分所述大肠癌的分期)、良性或正常(例如无疾病或病症)。在一些情况下，可以确定规定的统计学置信水平以提供诊断置信水平。例如，可以确定大于90％的置信水平是恶性肿瘤、恶性肿瘤类型、恶性肿瘤分期、正常或良性的可用预测器。在其他实施方式中，可以选择更严格或更宽松的置信水平。例如，可以选择大约70％,75％,80％,85％,90％,95％,97.5％,99％,99.5％或99.9％的置信水平作为可用的表型预测器。在一些情况下，所提供的置信水平可与样品质量、数据质量、分析质量、所用的特定方法和所分析的基因、标志物或基因组区域的数目有关。提供诊断的规定置信水平可基于假阳性或假阴性和/或成本的期望值来选择。用于选择实现规定的置信水平的参数或用于识别具有诊断能力的标志物的方法包括但不限于接收者操作曲线分析(ROC)、双正态ROC、主成分分析、部分最小二乘法分析、奇异值分解、最小绝对收缩和选择算子分析、最小角回归和阈值梯度定向正则化方法。

微生物分布谱结果的统计学评估可以提供指示以下一种或多种可能性的一个或多个定量值：诊断准确性的可能性、癌症、疾病或病症的可能性、特定癌症、疾病或病症的可能性、特定治疗性干预成功的可能性。因此可能没有经过遗传学或分子生物学训练的医师不必了解原始数据。相反，所述数据以指导患者护理的最有用的形式直接提供给医师。微生物分布谱的结果可使用本领域已知的许多方法进行统计学评估，包括但不限于：studentsT检验、双侧T检验、皮尔森秩和分析、隐马尔可夫模型分析、q-q图分析、主成分分析、单向ANOVA、双向ANOVA、LIMMA等。

在本发明的一些实施方式中，单独使用微生物分布谱或者与细胞学分析结合使用微生物分布谱可以提供约85％准确性到约99％或约100％准确性的诊断。在一些情况下，经营微生物分布谱的企业可以通过使用微生物分布谱和/或细胞学提供约85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.75％、99.8％、99.85％或99.9％准确性的恶性、良性或正常的诊断。

在一些情况下，可通过在一段时间内跟访受试者来确定初始诊断的准确性。在其他情况下，可以确定性的方式或者使用统计方法建立准确性。例如，接受者操作特征(ROC)分析可用于确定最优分析参数，从而实现准确性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或错误发现率的特定水平。在癌症诊断中使用ROC分析的方法是本领域已知的且例如描述在美国专利申请No.2006/019615中，其通过题述并入本文。

在本发明的其他实施方式中，单独使用微生物分布谱或者和细胞学分析结合使用微生物分布谱与使用本领域已知的标准细胞学技术相比可以减少评定为非诊断性的样品的数目约100％、99％、95％、90％、80％、75％、70％、65％或约60％。在一些情况下，本发明方法与本领域已知的标准细胞学方法相比可以减少评定为中间或疑似的样品的数目约100％、99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或约60％。

在一些情况下，将微生物分布谱分析的结果输入数据库中以供经营微生物分布谱的企业、个体、医疗提供者或保险提供者的代表或代理人访问。在一些情况下分析结果包括企业的代表、代理人或顾问，例如医学专业人员的解释或诊断。在其他情况下，自动提供数据的计算机或算法分析。在一些情况下微生物分布谱企业可以向个体、保险提供者、医疗提供者、研究人员或政府机构为以下一项或多项服务收费：所进行的微生物分布谱分析、咨询服务、数据分析、结果报告或数据库访问。

在本发明的一些实施方式中，微生物分布谱结果作为计算机屏幕上的报告或作为纸件报告提供。在一些情况下，所述报告可以包括但不限于以下一种或多种信息：微生物存在或不存在或数量/浓度、分布差异的微生物、原始样品的适合性、诊断、诊断的统计学置信度、癌症或恶性肿瘤的可能性和指定疗法。

在一些实施方案中，可使用本发明的方法和组合物监测受试者。例如，受试者可以诊断为患有癌症。该初始诊断可以包括或不包括使用微生物分布谱。所述受试者可以被规定治疗性干预，例如，外科手术介入、化疗治疗或姑息治疗。治疗性干预的结果可以通过微生物分布谱在持续进行的基础上监测，以检测治疗性干预的效果。在另一个实施方式中，受试者可能诊断为患有良性肿瘤或癌前病变或结节，且所述肿瘤、结节或病变可以通过微生物分布谱在持续进行的基础上监测，以检测肿瘤或病变状态的任何变化。

8.计算机辅助的方法和系统

在一些实施方案中，本发明涉及计算机辅助的方法和系统，用于实现本发明的目的。

在一些实施方案中，本发明涉及的系统包括热循环仪和计算机处理器，所述计算机处理器耦合至所述热循环仪并被编程为执行本发明的方法。

在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括测序仪和计算机处理器，所述计算机处理器耦合至所述测序仪并被编程为执行本发明的方法。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的系统，其包括：

1)热循环仪，该热循环仪(i)接收本文中所述的反应混合物，以及(ii)使所述反应混合物的温度循环以进行所述核酸扩增反应，从而产生扩增产物；以及

1)测序仪，该测序仪(i)接收本文中所述的反应混合物，以及(ii)利用所述测序引物对所述样品中包含的核酸进行测序；以及

2)计算机处理器，该计算机处理器耦合至所述测序仪并被编程为执行本发明的方法。

在一些实施方案中，所述系统还包括将关联结果和/或标记结果发送给用户的装置。

在一些实施方案中，所述系统还包括储存本文中所述参考微生物分布谱的储存装置。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的计算机辅助的方法(其流程图参见图2)，其包括：

1)用于输入关于所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度的信息的输入步骤，其中所述数量或浓度是通过对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序而获得的；

2)用于根据关于所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度的信息，获得所述生物样品的微生物分布谱的获得步骤；

3)用于将多个参考微生物分布谱存储到存储装置中的存储步骤；

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与所述存储装置中存储的多个参考微生物分布谱相比较，确定与所述生物样品的微生物分布谱差异在预定的阈值之内的所有候选参考微生物分布谱的比较步骤；

5)用于根据比较步骤中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联的关联步骤。

在一些实施方案中，5)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

在一些实施方案中，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括当4)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括将多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

在一些实施方案中，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

在一些实施方案中，所述生物样品来自受试者。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述粘膜是胃粘膜。

在一些实施方案中，所述拭子是直肠拭子。

在一些实施方案中，所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述病史为癌症病史。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后的获得步骤。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户的发送步骤。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的方法，其包括：

3)用于将正常生物样品的参考微生物分布谱存储到存储装置中的存储步骤；以及

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与所述存储装置中存储的正常生物样品的参考微生物分布谱进行比较，以确定受试者的健康状况的比较步骤。

在一些实施方案中，，其中所述正常生物样品来自当处于正常的或被认为正常的健康状况的所述受试者自身。

在一些实施方案中，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常的确定步骤。

在一些实施方案中，所述生物样品为胃肠道样品。

在一些实施方案中，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括将确定所述受试者的健康状况的结果发送给用户的发送步骤。

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考生物样品的参考微生物分布谱进行比较的比较步骤；以及

在一些实施方案中，还包括将所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

权利要求115或116的方法，其中所述参数值的集合包括一个或多个特征参数值和一个或多个诊断参数值，所述特征参数值描述个体或群体的特征，所述诊断参数值描述相对于所述个体或群体的诊断。

在一些实施方案中，还包括在关联步骤之前根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱的确定步骤。

在一些实施方案中，所述关联步骤包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括当5)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定步骤。

在一些实施方案中，还包括根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断的诊断步骤。

在一些实施方案中，所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的计算机辅助的系统(参见图3)，其包括：

1)用于输入关于所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度的信息的输入装置，其中所述数量或浓度是通过对所述生物样品进行核酸扩增反应和/或测序而获得的；

2)用于根据关于所述多种微生物中一种或多种微生物的数量或浓度的信息，获得所述生物样品的微生物分布谱的获得装置；

3)用于存储多个参考微生物分布谱的存储装置；

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与所述存储装置中存储的多个参考微生物分布谱相比较，确定与所述生物样品的微生物分布谱差异在预定的阈值之内的所有候选参考微生物分布谱的比较装置；

5)用于根据所述比较装置的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联的关联装置。

在一些实施方案中，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定装置。

在一些实施方案中，还包括当4)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定装置。

在一些实施方案中，还包括将多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

在一些实施方案中，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

在一些实施方案中，所述生物样品来自受试者。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述粘膜是胃粘膜。

在一些实施方案中，所述拭子是直肠拭子。

在一些实施方案中，所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述病史为癌症病史。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后的获得装置。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户的发送装置。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的系统，其包括：

3)用于存储正常生物样品的参考微生物分布谱的存储装置；以及

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与所述存储装置中存储的正常生物样品的参考微生物分布谱进行比较，以确定受试者的健康状况的比较装置。

在一些实施方案中，其中所述正常生物样品来自健康状况正常或被认为正常的个体。

在一些实施方案中，所述正常生物样品的参考微生物分布谱是根据来自多个健康状况正常或被认为正常的个体的生物样品的微生物分布谱通过统计系统获得的。

在一些实施方案中，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常的确定装置。

在一些实施方案中，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常的确定装置。

在一些实施方案中，所述生物样品为胃肠道样品。

在一些实施方案中，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常的确定装置。

在一些实施方案中，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常的确定装置。

在一些实施方案中，还包括将确定所述受试者的健康状况的结果发送给用户的发送装置。

3)用于存储多个参考微生物分布谱的存储步骤；

4)用于将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考生物样品的参考微生物分布谱进行比较的比较装置；以及

5)用于根据比较装置中的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联的关联装置。

在一些实施方案中，还包括将所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

在一些实施方案中，还包括在关联装置之前根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱的确定装置。

在一些实施方案中，所述关联装置包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平的确定装置。

在一些实施方案中，还包括当5)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定装置。

在一些实施方案中，还包括根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断的诊断装置。

在一些实施方案中，所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

在一些实施方案中，所述癌症为肠癌。

在一些实施方案中，所述肠癌为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是复发的大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌是难治的大肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症为大肠癌。

在一些实施方案中，所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

前述任一项权利要求的系统，其中所述微生物分布谱包含微生物的种类和数量或浓度。

前述任一项权利要求的系统，其中所述数量或浓度为相对数量或浓度。

前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物选自细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物包含至少两种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物是选自列表1的一种或多种微生物。

前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应采用选自下组的系统进行：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。

前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。

前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是qPCR。

前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是ddPCR。

前述任一项权利要求的系统，其中在进行核酸扩增反应之前无须进行核酸提取。

前述任一项权利要求的系统，其中所述所有装置在2小时之内完成。

前述任一项权利要求的系统，其中确定微生物的种类包括用对所述微生物具特异性的引物进行核酸扩增反应。

前述任一项权利要求的系统，其中对所述微生物具特异性的引物是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

前述任一项权利要求的系统，其中对所述微生物具特异性的引物不是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

前述任一项权利要求的系统，其中所述测序是第二代测序或第三代测序。

前述任一项权利要求的系统，其中通过测序获得微生物的种类，其包括：

利用针对微生物16S或23S核糖体亚基保守序列的引物，通过测序获得包含在所述微生物的16S或23S核糖体亚基的核酸序列；

将所述核糖体亚基的核酸序列与参考核糖体亚基的核酸序列数据库进行比对；以及

基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应同时进行。

前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应分别进行。

前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在同一反应体系中进行。

前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在不同反应体系中进行。

在一些实施方案中，可将关于核酸扩增反应或测序反应的信息，如扩增产物(例如，扩增的DNA产物)的存在和/或量，或测序结果输出至接收者。关于核酸扩增反应或测序反应的信息可经由本领域已知的任何适宜的方法输出。在一些实施方案中，此等信息可口头提供给接收者。在一些实施方案中，此等信息可在报告中提供。报告可包括任何数目的所期望的元素，该元素的非限制性实例包括关于受试者(例如，性别、年龄、种族、健康状况等)的原始数据、经处理的数据(例如，图形显示(例如，图、图表、数据表、数据汇总)、确定的循环阈值、靶多核苷酸起始量的计算值)的信息，核酸扩增反应或测序反应的结构，等等，及其组合。该报告可作为打印的报告(例如，硬拷贝)提供，或者可作为电子报告提供。在一些实施方案(包括其中提供电子报告的情况)中，此等信息可经由诸如监视器或电视、可操作地与用于获得扩增产物的单元连接的屏、平板计算机屏、移动装置屏等电子显示器(例如，电子显示屏)输出。打印的报告和电子报告均可分别存储于文件或数据库中，使得它们可被访问以供与以后的报告进行比较。

此外，可使用任何合适的通信介质(包括，例如，网络连接、无线连接或因特网连接)将报告发送至本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，可将报告发送至接收者的装置，诸如个人计算机、电话、平板或其他装置。该报告可在线观看、保存在接收者的装置上或打印。还可通过用于传送信息的任何其他合适的手段传送报告，该手段的非限制性实例包括邮寄硬拷贝报告供接收和/或接收者查看。

此外，可将此等信息输出至各种不同类型的接收者。此等接收者的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医师、治疗受试者的医师、用于临床试验的临床监视器、护士、研究人员、实验室技术员、制药公司的代表、医疗保健公司、生物技术公司、医院、人类援助组织、医疗保健管理者、电子系统(例如，存储例如受试者的医疗记录的一台或多台计算机和/或一台或多台计算机服务器)、公共卫生工作者、其他医务人员和其他医疗设施。

在一些情况下，用户界面可以是图形用户界面。此外，用户界面可包括一个或多个图形元素。图形元素可包括图像和/或文本信息，如图片、图标和文本。图形元素在用户界面上可具有不同的尺寸和方向。此外，电子显示屏可以是任何适宜的电子显示器，包括本文其他地方描述的实例。电子显示屏的非限制性实例包括监视器、移动装置屏、膝上型计算机屏、电视、便携式视频游戏系统屏和计算器屏。在一些实施方案中，电子显示屏可包括触摸屏(例如，电容式或电阻式触摸屏)，使得在电子显示屏的用户界面上显示的图形元素可经由用户触摸电子显示屏来选择。

用户的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医务人员、临床医生(例如，医生、护士、实验室技术员)、实验室人员(例如医院实验室技术人员、研究科学家、药学科学家)、临床试验的临床监视者，或医疗保健行业中的其他用户等。

在多个方面，所述系统包括扩增模块，该扩增模块用于响应于由输入模块接收的用户请求而对靶核酸或其部分进行核酸扩增反应。该扩增模块可以能够执行本文所述的任何方法，并且可以包括流体处理装置、一个或多个热循环仪、用于接纳一个或多个反应容器(例如，热循环的热块的孔)的装置、能够检测扩增产物的检测器(例如，光学检测器、光谱检测器、电化学检测器)以及用于向接收者输出关于扩增产物(扩增的DNA产物)的存在和/或量的信息(例如，原始数据，经处理的数据或本文所述的任何其他类型的信息)的装置中的任何装置。在一些情况下，该扩增模块可包括具有如本文其他地方所述的计算机处理器的装置，并且还可以能够在适宜软件的辅助下分析自检测获得的原始数据。此外，在一些实施方案中，该扩增模块可包括从输入模块接收指令所必需的输入电子器件并且可包括与输出模块进行通信所必需的输出电子器件。

在一些实施方案中，向反应容器提供材料、扩增核酸、检测扩增产物和输出信息的一个或多个步骤可由扩增模块自动化操作。在一些实施方案中，自动化操作可包括使用一个或多个流体处理器和相关联的软件。可采用若干市售的流体处理系统来运行此等过程的自动化操作。此等流体处理器的非限制性实例包括来自Perkin-Elmer、Caliper LifeSciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design和Velocity 11的流体处理器。

在一些实施方案中，扩增模块可包括实时检测仪器。此等仪器的非限制性实例包括实时PCR热循环仪、ABI7000序列检测系统、ABI7700序列检测系统、Applied Biosystems 7300实时PCR系统、Applied Biosystems 7500实时PCR系统、AppliedBiosystems 7900HT快速实时PCR系统(均来自Applied Biosystems)；LightCycler^TM系统(Roche Diagnostics GmbH)；Mx3000P^TM实时PCR系统、Mx3005P^TM实时PCR系统和多重定量PCR系统(Multiplex Quantitative PCR System)(Stratagene,LaJolla,Calif.)；以及智能循环仪系统(Smart Cycler System)(Cepheid，由FisherScientific分销)。在一些实施方案中，扩增模块可包括另一种自动化仪器，例如，AmpliPrep/系统(Roche Molecular Systems)、TIGRIS DTS系统(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、PANTHER系统(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、BD MAXTM系统(Becton Dickinson)、GeneXpert系统(Cepheid)、(BioFire Diagnostics)系统、iCubate系统、IDBox系统(Luminex)、EncompassMDxTM(Rheonix)系统、LiatTM Aanlyzer(IQuum)系统、Biocartis的MolecularDiagnostic Platform系统、ML系统(Enigma Diagnostics)、系统(T2Biosystems)、系统(NanoSphere)、Great Basin的Diagnostic System、UnyveroTM系统(Curetis)、PanNAT系统(Micronics)或SpartanTM RX系统(SpartanBioscience)。

在各个方面，所述系统包含可操作地连接至扩增模块的输出模块。在一些实施方案中，该输出模块可包含具有如上所述的用于输入模块的处理器的装置。该输出模块可包括如本文所述的输入设备，并且/或者可包括用于与扩增模块通信的输入电子器件。在一些实施方案中，该输出模块可以是电子显示器，在一些情况下，该电子显示器包括UI。在一些实施方案中，该输出模块是可操作地耦合至计算机网络如因特网的通信接口。在一些实施方案中，该输出模块可使用任何合适的通信媒介(包括计算机网络、无线网络、本地内联网或因特网)将信息至传送至处于本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，该输出模块能够分析从扩增模块接收到的数据。在一些情况下，该输出模块包括能够生成报告并将报告传送至接收者的报告生成器，其中该报告包含如本文其他地方所述的关于扩增产物的量和/或存在的任何信息。在一些实施方案中，该输出模块可响应于从扩增模块接收到的信息自动地传送信息，例如以原始数据或由包含在扩增模块中的软件进行的数据分析的形式。或者，该输出模块可在接收用户指令后传送信息。由输出模块传送的信息可以经电子方式进行查看或者由打印机打印出来。

输入模块、扩增模块和输出模块中的一种或多种可包含在同一装置中，或者可包含一种或多种相同的组件。例如，扩增模块也可包含输入模块、输出模块或两者都包含。在其他实例中，包含处理器的装置既可包含在输入模块中也可包含在输出模块中。用户可使用该装置来请求对靶核酸进行扩增，并且也可将该装置用作将关于扩增产物的信息传送至接收者的工具。在一些情况下，包含处理器的装置可包含在全部三种模块中，使得该包含处理器的装置也可用于控制包含在扩增模块或任何其他模块中的仪器(例如，热循环仪、检测器、流体处理装置)，对该仪器提供指令，并接收从该仪器返回的信息。

在一些实施方案中，所述计算机包含一个或多个处理器。处理器可以与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关联，或根据需要植入固件中。如果程序在软件中实现，则该程序可以存储在任何计算机可读存储器如RAM、ROM、闪存、磁盘、光盘或其他存储介质中。同样地，可以通过任何已知的传送方法将该软件传送至计算装置，该传送方法包括，例如，经通信信道如电话线、因特网、无线连接等，或通过可传输介质，如计算机可读磁盘、闪存盘等。多个步骤可以作为多个块、操作、工具、模块或技术实现，这些块、操作、工具、模块或技术反过来可以在硬件、固件、软件或其任意组合中实现。当在硬件中实现时，一些或全部的块、操作、技术等可以在例如定制的集成电路(IC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等中实现。在一些实施方案中，计算机被配置用于接收客户请求以对样品进行检测反应。计算机可以直接(例如，通过由客户操作的输入设备如键盘、鼠标或触摸屏，或用户输入客户请求的方式)或间接地(例如，通过有线或无线连接，包括经因特网)接收客户请求。客户的非限制性实例包括提供样品的受试者、医务人员、临床医生、实验室人员、保险公司人员或医疗保健行业中的其他人。

在一些实施方案中，所述系统包含用于响应由计算机接收的客户请求，对样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增系统。该扩增系统可以包含液体处理器、热循环仪、光检测器和/或用于分析检测数据的处理器。在一些实施方案中，样品处理、核酸分离、扩增和/或分析中的一个或多个步骤通过扩增系统自动化地进行。在一些实施方案中，自动化可以包括一种或多种液体处理器和相关软件的使用。可以采用几种可商购的液体处理系统来运行这类过程的自动化(参见，例如，来自Perkin-Elmer、Caliper Life Sciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design、Velocity 11的液体处理器)。在一些实施方案中，检测包括实时检测仪器。示例性的实时仪器包括但不限于，ABI7000序列检测系统(ABI7000Sequence Detection System)、ABI7700序列检测系统(ABI7700Sequence Detection System)、Applied Biosystems 7300实时PCR系统(Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System)、Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System)、Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)(全部来自Applied Biosystems)；LightCycler^TM系统(Roche Diagnostics GmbH)；Mx3000P^TM实时PCR系统(Mx3000P^TM Real-Time PCR System)、Mx3005P^TM实时PCR系统(Mx3005P^TM Real-TimePCR System)和多重定量PCR系统(Multiplex Quantitative PCRSystem)(Stratagene,La Jolla,Calif.)；以及智能循环仪系统(Smart Cycler System)(Cepheid,由Fisher Scientific销售)。用于处理和/或测定样品的自动化系统的另外的非限制性实例包括AmpliPrep/系统(Roche MolecularSystems)、TIGRIS DTS系统(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、PANTHER系统(HologicGen-Probe,San Diego,CA)、BD MAX^TM系统(Becton Dickinson)、GeneXpert系统(Cepheid)、(BioFire Diagnostics)、iCubate系统、IDBox系统(Luminex)、EncompassMDx^TM(Rheonix)、Liat^TM分析仪(Liat^TM Aanlyzer)(IQuum)、Biocartis的分子诊断平台(Molecular Diagnostic Platform)、ML系统(Enigma Diagnosstics)、系统(T2Biosystems)、系统(NanoSphere)、Great Basin的诊断系统(Diagnostic System)、Unyvero^TM系统(Curetis)、PanNAT系统(Micronics)、Spartan^TM RX系统(Spartan Bioscience)、Atlas io系统(Atlas Genetics)、Idylla平台(Biocartis)、ARIES(Luminex)、GenMark的自动化PCR平台(automated PCR platform)(例如，eSensor系统)、3M集成循环仪(3M Integrated Cycler)(Focus Diagnostics)以及Alere i自动化PCR平台(Alere i automated PCR platform)(Alere)。实时仪器的说明可见于其他地方，即其各自的制造商的用户手册；McPherson；DNA Amplification:Current Technologies andApplications,Demidov和Broude编著.,Horizon Bioscience,2004；以及美国专利号6,814,934。

在一些实施方案中，本文所描述的系统包括核酸测序仪。测序仪任选地为任何合适的DNA或RNA测序装置，包括但不限于Sanger测序仪、焦磷酸测序仪、离子半导体测序仪、聚合酶克隆测序仪、连接测序装置、DNA或RNA纳米球测序装置、连接测序装置或单分子测序装置。

在一些实施方案中，所述系统包含向接受者发送报告的报告生成器，其中该报告含有由探针产生的信号强度的检测结果。报告生成器可以响应由扩增系统产生的荧光强度数据而自动地发送报告，如以通过实时PCR分析软件进行的数据分析的形式发送。或者，报告生成器可以响应来自操作者的指令而发送报告。报告可以含有原始信号强度数据、经处理的信号强度数据(例如，图形显示、C_T值的确定、模板多核苷酸起始量的计算)、检测到或未检测到细菌污染的结论、和/或源样品中污染的量的定量(如以CFU/mL为单位)。可以使用任何合适的通信介质将报告传送到在本地或远程位置的接收者。例如，通信介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。报告可以通过此类网络或连接(或用于传输信息的任何其他合适的手段，包括但不限于邮寄体检报告，如打印稿)进行传输，以供接收者接收和/或查看。接收者可以是但不限于客户、个人、医疗保健提供者、医疗保健管理者或电子系统(例如，一个或多个计算机和/或一个或多个服务器)。在一些实施方案中，报告生成器将报告发送至接收者的装置，如个人计算机、电话、平板计算机或其他装置。报告可以在线查看、存储在接收者的装置上或打印。

在一个方面，本公开内容提供了包含代码的计算机可读介质，该代码在由一个或多个处理器执行时，实施根据本文公开的任何方法的方法。计算机可读介质可以采取许多种形式，包括但不限于：有形存储介质、载波介质或者物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如在任何计算机等(如可以用于实施计算步骤、处理步骤等)中的任何存储装置。易失性存储介质包括动态存储器，如计算机的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号、或声波或光波(如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些)的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、传送该载波的电缆或链路、或计算机可从中读取程序代码和/或数据的任何其他介质。这种形式的计算机可读介质中的许多可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送至处理器以供执行。

9.组合物

在一个方面，本发明提供了用于实现本发明目的，例如用于执行本发明的方法的组合物，其可包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。

在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含一种或多种对选自列表1的任一种微生物具有特异性的引物对。

在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含对一种或多种用于对选自列表1的任一种微生物进行测序的引物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种样品，其包含一种或多种选自列表1的微生物。

本发明所述的组合物可以包含在任何适当的容器，如多孔板的孔、板、管、腔室、流动池、微流体装置的腔室或通道、或芯片中。在一些实施方案中，该组合物为固体形式，如粘附于容器表面的珠子或膜，或冻干粉，或沉淀物。

10.反应混合物

在一个方面，本发明提供了用于实现本发明目的，例如用于执行本发明的方法的反应混合物，其可包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。

在一些实施方案中，本发明提供了一种反应混合物，其包含：

a)包含多种微生物的生物样品；

b)对所述多种微生物中的一种或多种微生物具有特异性的引物对；

c)用于核酸扩增反应的酶；

d)用于核酸扩增反应的缓冲液；以及

e)dNTP。

a)包含多种微生物的生物样品；

b)用于对所述多种微生物中的一种或多种微生物进行测序的引物；

c)用于测序反应的酶；

d)用于测序反应的缓冲液；以及

e)修饰和/或未修饰的dNTP。

在一些实施方案中，所述一种或多种微生物为选自列表1的微生物。

本发明所述的反应混合物可以包含在任何合适的反应位置中。该反应位置可以是容器，如多孔板的孔、板、管、腔室、流动池、微流体装置的腔室或通道、或芯片。该反应位置可以是溶液内的分区，如小滴(例如，在乳液混合物内)。在一些实施方案中，该组合物为固体形式，如粘附于容器表面的珠子或膜，或冻干粉，或沉淀物。

11.试剂盒

在一个方面，本发明提供了用于实现本发明目的，例如用于执行本发明的方法的试剂盒，其可包含本文公开的与多个方面中的任意方面有关的任意组合的一种或多种要素。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于实现本发明的方法的试剂盒，其包含：

1)对所述一种或多种微生物具有特异性的引物对；

2)用于核酸扩增反应的酶；

3)用于核酸扩增反应的缓冲液；

4)dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

1)用于对所述一种或多种微生物进行测序的引物；

2)用于测序反应的酶；

3)用于测序反应的缓冲液；

4)修饰和/或未修饰的dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

试剂盒中的试剂和其他材料可以包含在任何合适的容器中，并且可以为立即可用的形式或者需要与试剂盒中的其他试剂或使用者提供的试剂组合(例如，浓缩组合物的稀释或冻干组合物的重建)。试剂盒中可提供缓冲液的非限制性实例包括碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。试剂盒可以包含对照样品，例如，用于已知种类和数量/浓度的微生物，和/或用作阳性对照或定量标准的纯化的DNA，以及已知不会发生核酸扩增反应或测序反应的阴性对照。在一些实施方案中，试剂盒包含根据本文公开的一种或多种方法的试剂盒的使用说明。

在一些实施方案中，使用试剂盒的方法包括本文中所述的任何方法。

12.微生物

本发明所述的微生物可选自细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，本发明方法中涉及的微生物可包含一种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，本发明方法中涉及的微生物可包含至少两种(2、3、4、或全部5种)选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

本发明所述的微生物可包括但不限于以下一种或多种微生物：贫养菌属(Abiotrophia)、软弱贫养菌(Abiotrophia defectiva)、贫养菌属、厌氧醋菌属(Acetanaerobacterium)、延长厌氧醋菌(Acetanaerobacterium elongatum)、厌氧醋菌、醋弧菌属(Acetivibrio)、醋弧菌属细菌(Acetivibrio bacterium)、醋弧菌属、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、醋酸杆菌属、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、无胆甾原体属、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、发酵氨基酸球菌属(Acidaminococcus fermentans)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、酸菌属(Acidianus)、布氏酸菌(Acidianus brierleyi)、酸菌属、食酸菌属(Acidovorax)、食酸菌属、不动杆菌属(Acinetobacter)、Acinetobacter guillouiae、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、不动杆菌属、放线杆菌属(Actinobacillus)、放线杆菌M1933/96/1、放线菌属、放线菌ICM34、放线菌ICM41、放线菌ICM54、Actinomyces lingnae、龋齿放线菌(Actinomycesodontolyticus)、口腔放线菌(Actinomyces oral)、放线菌ph3、放线菌属、Adlercreutzia、Adlercreutzia equolifaciens、Adlercreutzia intestinal、Adlercreutzia、气球菌属(Aerococcus)、气球菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、气单胞菌165C、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、气单胞菌RC50、气单胞菌属、嗜热古菌属(Aeropyrum)、敏捷嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、嗜热古菌属、聚生杆菌属(Aggregatibacter)、聚生杆菌属、阿格雷氏菌属(Agreia)、Agreia bicolorata、阿格雷氏菌属、土壤单胞菌属(Agromonas)、土壤单胞菌CS30、Akkermansia、Akkermansia muciniphila、Akkermansia、Alistipes、Alistipes ANH、Alistipes AP11、Alistipes bacterium、Alistipes CCUG、AlistipesDJF_B185、Alistipes DSM、Alistipes EBA6-25cl2、Alistipes finegoldii、Alistipesindistinctus、Alistipes JC136、Alistipes NML05A004、Alistipes onderdonkii、Alistipes putredinis、Alistipes RMA、Alistipes senegalensis、Alistipes shahii、Alistipes Smarlab、Alistipes、Alkalibaculum、Alkalibaculum、Alkaliflexus、Alkaliflexus、Allisonella、Allisonella histaminiformans、Allisonella、Alloscardovia、Alloscardovia omnicolens、Anaerofilum、Anaerofilum、Anaerofustis、Anaerofustis stercorihominis、Anaerofustis、厌氧枝原体属(Anaeroplasma)、厌氧枝原体属、Anaerostipes、Anaerostipes 08964、Anaerostipes 1y-2、Anaerostipes494a、Anaerostipes 5_1_63FAA、Anaerostipes AIP、Anaerostipes细菌、Anaerostipesbutyraticus、Anaerostipes caccae、Anaerostipes hadrum、Anaerostipes IE4、Anaerostipes indolis、Anaerostipes、Anaerotruncus、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus NML、Anaerotruncus、Aquincola、Aquincola、弓形菌属(Arcobacter)、弓形菌属、节杆菌属(Arthrobacter)、节杆菌FV1-1、Asaccharobacter、Asaccharobactercelatus、Asaccharobacter、无甾醇枝原体属(Asteroleplasma)、无甾醇枝原体属、Atopobacter、Atopobacter phocae、阿托波氏菌属(Atopobium)、极小阿托波氏菌(Atopobium parvulum)、裂阿托波氏菌(Atopobium rimae)、阿托波氏菌属、嗜菌弧菌属(Bacteriovorax)、嗜菌弧菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌31SF18、拟杆菌326-8、拟杆菌35AE31、拟杆菌35AE37、拟杆菌35BE34、拟杆菌4072、拟杆菌7853、生酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、拟杆菌AP1、拟杆菌AR20、拟杆菌AR29、拟杆菌B2、拟杆菌属细菌、Bacteroides barnesiae、拟杆菌BLBE-6、拟杆菌BV-1、粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)、Bacteroides CannelCatfish9、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroideschinchillae、拟杆菌CIP103040、Bacteroides clarus、Bacteroides coprocola、Bacteroides coprophilus、拟杆菌D8、拟杆菌DJF_B097、拟杆菌dnLKV2、拟杆菌dnLKV7、拟杆菌dnLKV9、Bacteroides dorei、拟杆菌EBA5-17、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、拟杆菌富集(Bacteroides enrichment)、拟杆菌F-4、Bacteroides faecichinchillae、Bacteroides faecis、Bacteroides fecal、Bacteroides finegoldii、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Bacteroides gallinarum、生溃疡拟杆菌(Bacteroideshelcogenes)、拟杆菌ic1292、Bacteroides intestinalis、Bacteroides massiliensis、Bacteroides mpnisolate、拟杆菌NB-8、Bacteroides new、拟杆菌nlaezlc13、拟杆菌nlaezlc158、拟杆菌nlaezlc159、拟杆菌nlaezlc161、拟杆菌nlaezlc163、拟杆菌nlaezlc167、拟杆菌nlaezlc172、拟杆菌nlaezlc18、拟杆菌nlaezlc182、拟杆菌nlaezlc190、拟杆菌nlaezlc198、拟杆菌nlaezlc204、拟杆菌nlaezlc205、拟杆菌nlaezlc206、拟杆菌nlaezlc207、拟杆菌nlaezlc211、拟杆菌nlaezlc218、拟杆菌nlaezlc257、拟杆菌nlaezlc260、拟杆菌nlaezlc261、拟杆菌nlaezlc263、拟杆菌nlaezlc308、拟杆菌nlaezlc315、拟杆菌nlaezlc322、拟杆菌nlaezlc324、拟杆菌nlaezlc331、拟杆菌nlaezlc339、拟杆菌nlaezlc36、拟杆菌nlaezlc367、拟杆菌nlaezlc375、拟杆菌nlaezlc376、拟杆菌nlaezlc380、拟杆菌nlaezlc391、拟杆菌nlaezlc459、拟杆菌nlaezlc484、拟杆菌nlaezlc501、拟杆菌nlaezlc504、拟杆菌nlaezlc515、拟杆菌nlaezlc519、拟杆菌nlaezlc532、拟杆菌nlaezlc557、拟杆菌nlaezlc57、拟杆菌nlaezlc574、拟杆菌nlaezlc592、拟杆菌nlaezlg105、拟杆菌nlaezlg117、拟杆菌nlaezlg127、拟杆菌nlaezlg136、拟杆菌nlaezlg143、拟杆菌nlaezlg157、拟杆菌nlaezlg167、拟杆菌nlaezlg171、拟杆菌nlaezlg187、拟杆菌nlaezlg194、拟杆菌nlaezlg195、拟杆菌nlaezlg199、拟杆菌nlaezlg209、拟杆菌nlaezlg212、拟杆菌nlaezlg213、拟杆菌nlaezlg218、拟杆菌nlaezlg221、拟杆菌nlaezlg228、拟杆菌nlaezlg234、拟杆菌nlaezlg237、拟杆菌nlaezlg24、拟杆菌nlaezlg245、拟杆菌nlaezlg257、拟杆菌nlaezlg27、拟杆菌nlaezlg285、拟杆菌nlaezlg288、拟杆菌nlaezlg295、拟杆菌nlaezlg296、拟杆菌nlaezlg303、拟杆菌nlaezlg310、拟杆菌nlaezlg312、拟杆菌nlaezlg327、拟杆菌nlaezlg329、拟杆菌nlaezlg336、拟杆菌nlaezlg338、拟杆菌nlaezlg347、拟杆菌nlaezlg356、拟杆菌nlaezlg373、拟杆菌nlaezlg376、拟杆菌nlaezlg380、拟杆菌nlaezlg382、拟杆菌nlaezlg385、拟杆菌nlaezlg4、拟杆菌nlaezlg422、拟杆菌nlaezlg437、拟杆菌nlaezlg454、拟杆菌nlaezlg455、拟杆菌nlaezlg456、拟杆菌nlaezlg458、拟杆菌nlaezlg459、拟杆菌nlaezlg46、拟杆菌nlaezlg461、拟杆菌nlaezlg475、拟杆菌nlaezlg481、拟杆菌nlaezlg484、拟杆菌nlaezlg5、拟杆菌nlaezlg502、拟杆菌nlaezlg515、拟杆菌nlaezlg518、拟杆菌nlaezlg521、拟杆菌nlaezlg54、拟杆菌nlaezlg6、拟杆菌nlaezlg8、拟杆菌nlaezlg80、拟杆菌nlaezlg98、拟杆菌nlaezlh120、拟杆菌nlaezlh15、拟杆菌nlaezlh162、拟杆菌nlaezlh17、拟杆菌nlaezlh174、拟杆菌nlaezlh18、拟杆菌nlaezlh188、拟杆菌nlaezlh192、拟杆菌nlaezlh194、拟杆菌nlaezlh195、拟杆菌nlaezlh207、拟杆菌nlaezlh22、拟杆菌nlaezlh250、拟杆菌nlaezlh251、拟杆菌nlaezlh28、拟杆菌nlaezlh313、拟杆菌nlaezlh319、拟杆菌nlaezlh321、拟杆菌nlaezlh328、拟杆菌nlaezlh334、拟杆菌nlaezlh390、拟杆菌nlaezlh391、拟杆菌nlaezlh414、拟杆菌nlaezlh416、拟杆菌nlaezlh419、拟杆菌nlaezlh429、拟杆菌nlaezlh439、拟杆菌nlaezlh444、拟杆菌nlaezlh45、拟杆菌nlaezlh46、拟杆菌nlaezlh462、拟杆菌nlaezlh463、拟杆菌nlaezlh465、拟杆菌nlaezlh468、拟杆菌nlaezlh471、拟杆菌nlaezlh472、拟杆菌nlaezlh474、拟杆菌nlaezlh479、拟杆菌nlaezlh482、拟杆菌nlaezlh49、拟杆菌nlaezlh493、拟杆菌nlaezlh496、拟杆菌nlaezlh497、拟杆菌nlaezlh499、拟杆菌nlaezlh50、拟杆菌nlaezlh531、拟杆菌nlaezlh535、拟杆菌nlaezlh8、拟杆菌nlaezlp104、拟杆菌nlaezlp105、拟杆菌nlaezlp108、拟杆菌nlaezlp132、拟杆菌nlaezlp133、拟杆菌nlaezlp151、拟杆菌nlaezlp157、拟杆菌nlaezlp166、拟杆菌nlaezlp167、拟杆菌nlaezlp171、拟杆菌nlaezlp178、拟杆菌nlaezlp187、拟杆菌nlaezlp191、拟杆菌nlaezlp196、拟杆菌nlaezlp208、拟杆菌nlaezlp213、拟杆菌nlaezlp228、拟杆菌nlaezlp233、拟杆菌nlaezlp267、拟杆菌nlaezlp278、拟杆菌nlaezlp282、拟杆菌nlaezlp286、拟杆菌nlaezlp295、拟杆菌nlaezlp299、拟杆菌nlaezlp301、拟杆菌nlaezlp302、拟杆菌nlaezlp304、拟杆菌nlaezlp317、拟杆菌nlaezlp319、拟杆菌nlaezlp32、拟杆菌nlaezlp332、拟杆菌nlaezlp349、拟杆菌nlaezlp35、拟杆菌nlaezlp356、拟杆菌nlaezlp370、拟杆菌nlaezlp371、拟杆菌nlaezlp376、拟杆菌nlaezlp395、拟杆菌nlaezlp402、拟杆菌nlaezlp403、拟杆菌nlaezlp409、拟杆菌nlaezlp412、拟杆菌nlaezlp436、拟杆菌nlaezlp438、拟杆菌nlaezlp440、拟杆菌nlaezlp447、拟杆菌nlaezlp448、拟杆菌nlaezlp451、拟杆菌nlaezlp476、拟杆菌nlaezlp478、拟杆菌nlaezlp483、拟杆菌nlaezlp489、拟杆菌nlaezlp493、拟杆菌nlaezlp557、拟杆菌nlaezlp559、拟杆菌nlaezlp564、拟杆菌nlaezlp565、拟杆菌nlaezlp572、拟杆菌nlaezlp573、拟杆菌nlaezlp576、拟杆菌nlaezlp591、拟杆菌nlaezlp592、拟杆菌nlaezlp631、拟杆菌nlaezlp633、拟杆菌nlaezlp696、拟杆菌nlaezlp7、拟杆菌nlaezlp720、拟杆菌nlaezlp730、拟杆菌nlaezlp736、拟杆菌nlaezlp737、拟杆菌nlaezlp754、拟杆菌nlaezlp759、拟杆菌nlaezlp774、拟杆菌nlaezlp828、拟杆菌nlaezlp854、拟杆菌nlaezlp860、拟杆菌nlaezlp886、拟杆菌nlaezlp887、拟杆菌nlaezlp900、拟杆菌nlaezlp909、拟杆菌nlaezlp913、拟杆菌nlaezlp916、拟杆菌nlaezlp920、拟杆菌nlaezlp96、Bacteroides nordii、Bacteroides oleiciplenus、卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)、Bacteroides paurosaccharolyticus、Bacteroides plebeius、拟杆菌R6、Bacteroides rodentium、拟杆菌S-17、拟杆菌S-18、Bacteroides salyersiae、拟杆菌SLC1-38、拟杆菌Smarlab、拟杆菌'Smarlab、Bacteroides stercorirosoris、粪便拟杆菌、Bacteroides str、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、拟杆菌TP-5、拟杆菌属、单形拟杆菌属(Bacteroides uniformis)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、拟杆菌WA1、拟杆菌WH2、拟杆菌WH302、拟杆菌WH305、拟杆菌XB12B、拟杆菌XB44A、拟杆菌XO77B42、Bacteroides xylanisolvens、Barnesiella、Barnesiella intestinihominis、Barnesiella NSB1、Barnesiella、Barnesiella viscericola、Bavariicoccus、Bavariicoccus、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、口腔蛭弧菌属(Bdellovibrio oral)、Bergeriella、Bergeriella、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、双歧杆菌103、双歧杆菌108、双歧杆菌113、双歧杆菌120、双歧杆菌138、双歧杆菌33、双歧杆菌Acbbto5、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、双歧杆菌Amsbbt12、角双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、双歧杆菌属细菌、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、双歧杆菌Bisn6、双歧杆菌Bma6、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、豚双歧杆菌(Bifidobacterium choerinum)、棒状双歧杆菌(Bifidobacterium coryneforme)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、双歧杆菌DJF_WC44、双歧杆菌F-10、双歧杆菌F-11、双歧杆菌群(Bifidobacterium group)、双歧杆菌h12、双歧杆菌HMLN1、双歧杆菌HMLN12、双歧杆菌HMLN5、双歧杆菌iarfr2341d、双歧杆菌iarfr642d48、双歧杆菌ic1332、蜜蜂双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)、Bifidobacterium kashiwanohense、双歧杆菌LISLUCIII-2、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、双歧杆菌M45、瘤胃双歧杆菌(Bifidobacterium merycicum)、最小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)、双歧杆菌MSX5B、口腔双歧杆菌(Bifidobacterium oral)、双歧杆菌PG12A、双歧杆菌PL1、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumpullorum)、反刍双歧杆菌(Bifidobacterium ruminantium)、双歧杆菌S-10、世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、Bifidobacterium saguini、Bifidobacteriumscardovii、Bifidobacterium simiae、双歧杆菌SLPYG-1、Bifidobacteriumstellenboschense、Bifidobacterium stercoris、双歧杆菌TM-7、双歧杆菌Trm9、双歧杆菌属、嗜胆菌属(Bilophila)、嗜胆菌nlaezlh528、嗜胆菌属、沃氏嗜胆菌(Bilophilawadsworthia)、Blautia、Blautia细菌、Blautia CE2、Blautia CE6、Blautia coccoides、Blautia DJF_VR52、Blautia DJF_VR67、Blautia DJF_VR70k1、Blautia formate、Blautiaglucerasea、Blautia hansenii、Blautia ic1272、Blautia IE5、Blautia K-1、Blautialuti、Blautia M-1、Blautia mpnisolate、Blautia nlaezlc25、Blautia nlaezlc259、Blautia nlaezlc51、Blautia nlaezlc520、Blautia nlaezlc542、Blautia nlaezlc544、Blautia nlaezlh27、Blautia nlaezlh316、Blautia nlaezlh317、Blautia obeum、Blautiaproducta、Blautia productus、Blautia schinkii、Blautia Ser5、Blautia Ser8、Blautia、Blautia WAL、Blautia wexlerae、Blautia YHC-4、Brenneria、Brenneria、短杆菌属(Brevibacterium)、短杆菌属、索丝菌属(Brochothrix)、热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、布丘氏菌57916、乡间布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、Butyricicoccus、Butyricicoccus细菌、Butyricicoccus、Butyricimonas、Butyricimonas 180-3、Butyricimonas 214-4、Butyricimonas细菌、Butyricimonas GD2、Butyricimonas synergistica、Butyricimonas、Butyricimonasvirosa、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、Butyrivibrio hungatei、丁酸弧菌属、Caldimicrobium、Caldimicrobium、Caldisericum、Caldisericum、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、Campylobacter hominis、弯曲杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、二氧化碳嗜纤维菌属、肉杆菌属(Carnobacterium)、类湖底肉杆菌(Carnobacteriumalterfunditum)、肉杆菌属、显核菌属(Caryophanon)、显核菌属、Catenibacterium、Catenibacterium mitsuokai、Catenibacterium、卡托氏菌属(Catonella)、卡托氏菌属、柄杆菌属(Caulobacter)、柄杆菌属、噬纤维素菌属(Cellulophaga)、噬纤维素菌属、Cellulosilyticum、Cellulosilyticum、鲸杆菌属(Cetobacterium)、鲸杆菌属、螯合球菌属(Chelatococcus)、螯合球菌属、绿菌属(Chlorobium)、绿菌属、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、金黄杆菌A1005、金黄杆菌KJ9C8、金黄杆菌属、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、柠檬酸杆菌1、Citrobacter agglomerans、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、Citrobacter ascorbata、柠檬酸杆菌属细菌(Citrobacterbacterium)、柠檬酸杆菌属BinzhouCLT、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、柠檬酸杆菌富集、柠檬酸杆菌F24、柠檬酸杆菌F96、法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、Citrobacter gillenii、柠檬酸杆菌HBKC_SR1、柠檬酸杆菌HD4.9、Citrobacter hormaechei、柠檬酸杆菌I91-3、柠檬酸杆菌ka55、Citrobacterlapagei、柠檬酸杆菌LAR-1、Citrobacter ludwigii、柠檬酸杆菌MEB5、柠檬酸杆菌MS36、Citrobacter murliniae、柠檬酸杆菌nlaezlc269、柠檬酸杆菌P014、柠檬酸杆菌P042bN、柠檬酸杆菌P046a、柠檬酸杆菌P073、柠檬酸杆菌SR3、柠檬酸杆菌T1、柠檬酸杆菌tnt4、柠檬酸杆菌tnt5、Citrobacter trout、柠檬酸杆菌TSA-1、柠檬酸杆菌属、魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、Cloacibacillus、Cloacibacillus adv66、Cloacibacillusnlaezlp702、Cloacibacillus NML05A017、Cloacibacillus、Cloacibacterium、Cloacibacterium、Collinsella、Collinsella A-1、Collinsella aerofaciens、Collinsella AUH-Julong21、Collinsella细菌、Collinsella CCUG、Collinsella、丛毛单胞菌属(Comamonas)、Comamonas straminea、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)、Conexibacter、Conexibacter、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、粪芽孢菌属细菌、Coprobacillus cateniformis、粪芽孢菌TM-40、粪芽孢菌属、粪球菌属(Coprococcus)、粪球菌14505、粪球菌属细菌、尖锐粪球菌(Coprococcus catus)、伴生粪球菌(Coprococcus comes)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)、Coprococcus nexile、粪球菌属、Coraliomargarita、Coraliomargarita fucoidanolyticus、Coraliomargaritamarisflavi、Coraliomargarita、棒杆菌属(Corynebacterium)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、Corynebacterium durum、考克斯氏体属(Coxiella)、考克斯氏体属、阪崎肠杆菌(Cronobacter)、Cronobacter dublinensis、Cronobactersakazakii、Cronobacter turicensis、Cryptobacterium、Cryptobacterium curtum、贪铜菌属(Cupriavidus)、Cupriavidus eutropha、Dechloromonas、Dechloromonas HZ、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫杆菌属、脱硫叶菌属(Desulfobulbus)、脱硫叶菌属、Desulfopila、Desulfopila La4.1、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫弧菌属D4、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、脱硫弧菌DSM12803、脱硫弧菌富集、Desulfovibriofairfieldensis、脱硫弧菌LNB1、Desulfovibrio piger、脱硫弧菌属、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)、戴阿利斯特杆菌属E2_20、戴阿利斯特杆菌GBA27、Dialister invisus、口腔戴阿利斯特杆菌(Dialister oral)、Dialister succinatiphilus、戴阿利斯特杆菌属、Dorea、Dorea auhjulong64、Dorea细菌、Dorea formicigenerans、Dorea longicatena、Dorea mpnisolate、Dorea、Dysgonomonas、Dysgonomonas gadei、Dysgonomonas、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、Eggerthella、EggerthellaE1、Eggerthella lenta、Eggerthella MLG043、Eggerthella MVA1、Eggerthella S6-C1、Eggerthella SDG-2、Eggerthella sinensis、Eggerthella str、Eggerthella、水栖菌属(Enhydrobacter)、水栖菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、肠杆菌1050、肠杆菌1122、肠杆菌77000、肠杆菌82353、肠杆菌9C、肠杆菌A5C、Enterobacter adecarboxylata、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、EnterobacterAJAR-A2、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、肠杆菌B1(2012)、肠杆菌B363、肠杆菌B509、肠杆菌属细菌、肠杆菌Badong3、肠杆菌BEC441、肠杆菌C8、生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、肠杆菌CO、肠杆菌core2、Enterobacter cowanii、肠杆菌dc6、肠杆菌DRSBII、肠杆菌富集、肠杆菌FL13-2-1、肠杆菌GIST-NKst10、肠杆菌GIST-NKst9、肠杆菌GJ1-11、肠杆菌gx-148、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、肠杆菌I-Bh20-21、肠杆菌ICB113、Enterobacter kobei、肠杆菌KW14、肠杆菌l12、Enterobacter ludwigii、肠杆菌M10_1B、肠杆菌M1R3、Enterobacter marine、肠杆菌NCCP-167、Enterobacter of、Enterobacteroryzae、Enterobacter oxytoca、肠杆菌P101、肠杆菌S11、肠杆菌SEL2、肠杆菌SPh、肠杆菌SSASP5、Enterobacter terrigena、肠杆菌TNT3、肠杆菌TP2MC、肠杆菌TS4、肠杆菌TSSAS2-48、肠杆菌属、肠杆菌ZYXCA1、肠球菌属(Enterococcus)、肠球菌020824/02-A、肠球菌1275b、肠球菌16C、肠球菌48、肠球菌6114、肠球菌ABRIINW-H61、Enterococcus asini、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、Enterococcus azikeevi、肠球菌属细菌、肠球菌BBDP57、肠球菌BPH34、肠球菌Bt、Enterococcus canis、铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、肠球菌CmNA2、肠球菌Da-20、Enterococcus 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sanguinicola、肠球菌SCA16、肠球菌SCA2、肠球菌SE138、肠球菌SF-1、肠球菌sulfureus、肠球菌SV6、肠球菌te1a、肠球菌te32a、肠球菌te42a、肠球菌te45r、肠球菌te49a、肠球菌te51a、肠球菌te58r、肠球菌te59r、肠球菌te61r、肠球菌te93r、肠球菌te95a、肠球菌属、Enterorhabdus、Enterorhabduscaecimuris、Enterorhabdus、欧文氏菌属(Erwinia)、Erwinia agglomerans、Erwiniaenterica、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)、Erwinia tasmaniensis、欧文氏菌属、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis aff、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis细菌、Erysipelotrichaceae_incertae_sedisbiforme、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis C-1、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis cylindroides、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis GK12、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis innocuum、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlc332、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlc340、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlg420、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlg425、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlg440、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlg463、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh340、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh354、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh379、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh380、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh385、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis nlaezlh410、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis tortuosum、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、埃希氏菌/志贺氏菌(Escherichia/Shigella)、埃希氏菌/志贺氏菌29(2010)、埃希氏菌/志贺氏菌4091、埃希氏菌/志贺氏菌4104、埃希氏菌/志贺氏菌8gw18、埃希氏菌/志贺氏菌A94、埃希氏菌/Shigellaalbertii、埃希氏菌/志贺氏菌B-1012、埃希氏菌/志贺氏菌B4、埃希氏菌/志贺氏菌属细菌、埃希氏菌/志贺氏菌BBDP15、埃希氏菌/志贺氏菌BBDP80、埃希氏菌/鲍氏志贺氏菌、埃希氏菌/Shigella carotovorum、埃希氏菌/志贺氏菌CERAR、埃希氏菌/大肠志贺氏菌、埃希氏菌/志贺氏菌DBC-1、埃希氏菌/志贺氏菌dc262011、埃希氏菌/痢疾志贺氏菌、埃希氏菌/志贺氏菌富集、埃希氏菌/志贺氏菌埃希氏菌、埃希氏菌/Shigella fecal、埃希氏菌/Shigella fergusonii、埃希氏菌/弗氏志贺氏菌、埃希氏菌/志贺氏菌GDR05、埃希氏菌/志贺氏菌GDR07、埃希氏菌/志贺氏菌H7、埃希氏菌/Shigella marine、埃希氏菌/志贺氏菌ML2-46、埃希氏菌/Shigella mpnisolate、埃希氏菌/志贺氏菌NA、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlg330、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlg400、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlg441、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlg506、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh204、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh208、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh209、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh213、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh214、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh4、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh435、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlh81、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp126、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp198、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp21、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp235、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp237、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp239、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp25、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp252、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp275、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp280、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp51、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp53、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp669、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp676、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp717、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp731、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp826、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp877、埃希氏菌/志贺氏菌nlaezlp884、埃希氏菌/志贺氏菌NMU-ST2、埃希氏菌/志贺氏菌oc182011、埃希氏菌/志贺氏菌of、埃希氏菌/Shigella proteobacterium、埃希氏菌/志贺氏菌Q1、埃希氏菌/Shigella sakazakii、埃希氏菌/志贺氏菌SF6、埃希氏菌/志贺氏菌sm1719、埃希氏菌/志贺氏菌SOD-7317、埃希氏菌/索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、埃希氏菌/志贺氏菌SW86、埃希氏菌/志贺氏菌、埃希氏菌/Shigella vulneris、Ethanoligenens、Ethanoligenens harbinense、Ethanoligenens、真杆菌属(Eubacterium)、真杆菌ARC-2、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)、真杆菌E-1、真杆菌G3(2011)、Eubacteriuminfirmum、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、Eubacterium methylotrophicum、真杆菌nlaezlp439、真杆菌nlaezlp457、真杆菌nlaezlp458、真杆菌nlaezlp469、真杆菌nlaezlp474、口服真杆菌、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、真杆菌属、真杆菌WAL、眼虫目(Euglenida)、Euglenida longa、Faecalibacterium、Faecalibacterium细菌、Faecalibacterium canine、Faecalibacterium DJF_VR20、Faecalibacterium ic1379、Faecalibacterium prausnitzii、Faecalibacterium、Filibacter、Filibacterglobispora、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄杆菌SSL03、黄杆菌属、Flavonifractor、Flavonifractor AUH-JLC235、Flavonifractor富集、Flavonifractor nlaezlc354、Flavonifractor orbiscindens、Flavonifractor plautii、Flavonifractor、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、Francisella piscicida、梭杆菌属(Fusobacterium)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、梭杆菌属、加德纳氏菌属(Gardnerella)、加德纳氏菌属、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、Gemmiger、Gemmiger DJF_VR33k2、Gemmigerformicilis、Gemmiger、地杆菌属(Geobacter)、地杆菌属、Gordonibacter、Gordonibacter细菌、Gordonibacter intestinal、Gordonibacter pamelaeae、Gordonibacter、Gp2、Gp2、Gp21、Gp21、Gp4、Gp4、Gp6、Gp6、颗粒链菌属(Granulicatella)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、颗粒链菌富集、口腔颗粒链菌(Granulicatella oral)、Granulicatella paraadiacens、颗粒链菌属、嗜血菌属(Haemophilus)、嗜血菌属、哈夫尼菌属(Hafnia)、哈夫尼菌3-12(2010)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、哈夫尼菌CC16、Hafnia proteus、哈夫尼菌属、Haliea、Haliea、Hallella、Hallella seregens、Hallella、草螺菌属(Herbaspirillum)、草螺菌022S4-11、织片草螺菌(Herbaspirillumseropedicae)、Hespellia、Hespellia porcina、Hespellia stercorisuis、Hespellia、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、霍尔德曼氏菌AP2、Holdemania filiformis、霍尔德曼氏菌属、Howardella、Howardella、Howardella ureilytica、Hydrogenoanaerobacterium、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、产氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、产氢噬胞菌属细菌、Ilumatobacter、Ilumatobacter、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、紫色杆菌C30An7、紫色杆菌属、Jeotgalicoccus、Jeotgalicoccus、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、克雷伯氏菌属细菌、克雷伯氏菌E1L1、克雷伯氏菌EB2-THQ、克雷伯氏菌富集、克雷伯氏菌F83、克雷伯氏菌G1-6、克雷伯氏菌gg160e、肉芽肿克雷伯氏菌(Klebsiella granulomatis)、克雷伯氏菌HaNA20、克雷伯氏菌HF2、克雷伯氏菌ii_3_chl_1、克雷伯氏菌KALAICIBA17、克雷伯氏菌kpu、克雷伯氏菌M3、克雷伯氏菌MB45、Klebsiella milletis、克雷伯氏菌NCCP-138、克雷伯氏菌ok1_1_9_S16、克雷伯氏菌ok1_1_9_S54、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、Klebsiella poinarii、克雷伯氏菌PSB26、克雷伯氏菌RS、克雷伯氏菌Se14、克雷伯氏菌SRC_DSD12、克雷伯氏菌td153s、克雷伯氏菌TG-1、克雷伯氏菌TPS5、克雷伯氏菌属、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、克雷伯氏菌WB-2、克雷伯氏菌Y9、Klebsiella zlmy、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、克吕沃尔氏菌An5-1、栖冷克吕沃尔氏菌(Kluyvera cryocrescens)、克吕沃尔氏菌属、库克菌属(Kocuria)、库克菌2216.35.31、库特氏菌属(Kurthia)、库特氏菌属、Lachnobacterium、Lachnobacterium C12b、Lachnobacterium、Lachnospiracea_incertae_sedis、Lachnospiracea_incertae_sedis细菌、Lachnospiracea_incertae_sedis contortum、Lachnospiracea_incertae_sedis Eg2、Lachnospiracea_incertae_sedis eligens、Lachnospiracea_incertae_sedisethanolgignens、Lachnospiracea_incertae_sedis galacturonicus、Lachnospiracea_incertae_sedis gnavus、Lachnospiracea_incertae_sedis hallii、Lachnospiracea_incertae_sedis hydrogenotrophica、Lachnospiracea_incertae_sedis ID5、Lachnospiracea_incertae_sedis intestinal、Lachnospiracea_incertae_sedismpnisolate、Lachnospiracea_incertae_sedis pectinoschiza、Lachnospiracea_incertae_sedis ramulus、Lachnospiracea_incertae_sedis rectale、Lachnospiracea_incertae_sedis RLB1、Lachnospiracea_incertae_sedis rumen、Lachnospiracea_incertae_sedis SY8519、Lachnospiracea_incertae_sedis torques、Lachnospiracea_incertae_sedis、Lachnospiracea_incertae_sedis uniforme、Lachnospiracea_incertae_sedis ventriosum、Lachnospiracea_incertae_sedis xylanophilum、Lachnospiracea_incertae_sedis ye62、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳杆菌5-1-2、乳杆菌66c、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、Lactobacillus arizonensis、乳杆菌B5406、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、Lactobacillushominis、乳杆菌ID9203、乳杆菌IDSAc、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinal)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、Lactobacillusmanihotivorans、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、乳杆菌NA、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、乳杆菌P23、乳杆菌P8、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、Lactobacillus rennanqilfy10、Lactobacillus rennanqilfy14、Lactobacillusrennanqilyf9、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、Lactobacillussanfranciscensis、三得利乳杆菌(Lactobacillus suntoryeus)、乳杆菌T3R1C1、乳杆菌属、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、乳球菌属(Lactococcus)、乳球菌56、乳球菌CR-317S、乳球菌CW-1、乳球菌D8、乳球菌Da-18、乳球菌DAP39、Lactococcus delbrueckii、乳球菌F116、Lactococcus fujiensis、乳球菌G22、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Lactococcusmanure、乳球菌RT5、乳球菌SXVIII1(2011)、乳球菌TP2MJ、乳球菌TP2ML、乳球菌TP2MN、乳球菌U5-1、乳球菌属、Lactonifactor、Lactonifactor细菌、Lactonifactor longoviformis、Lactonifactor nlaezlc533、Lactonifactor、勒克氏菌属(Leclercia)、勒克氏菌属、Lentisphaera、Lentisphaera、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉色明串珠菌(Leuconostoccarnosum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、Leuconostoc garlicum、Leuconostocgasicomitatum、硬明串珠菌(Leuconostoc gelidum)、Leuconostoc inhae、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、明串珠菌MEBE2、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、明串珠菌属、Limnobacter、Limnobacter spf3、Luteolibacter、Luteolibacter细菌、Lutispora、Lutispora、Marinifilum、Marinifilum、海杆菌属(Marinobacter)、Marinobacter arcticus、Mariprofundus、Mariprofundus、Marvinbryantia、Marvinbryantia、巨单胞菌属(Megamonas)、巨单胞菌属、巨球形菌属(Megasphaera)、巨球形菌属、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、Melissococcus faecalis、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、Methanobacterium subterraneum、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilus)、Methanobrevibacter millerae、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter oralis、甲烷短杆菌SM9、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、甲烷短杆菌属、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)、甲烷球形菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Methylobacterium adhaesivum、甲基杆菌属细菌、甲基杆菌iEII3、甲基杆菌MP3、Methylobacterium oryzae、甲基杆菌PB132、甲基杆菌PB20、甲基杆菌PB280、甲基杆菌PDD-23b-14、耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)、甲基杆菌SKJH-1、甲基杆菌属、光岗菌属(Mitsuokella)、Mitsuokella jalaludinii、光岗菌属、摩根氏菌属(Morganella)、摩氏摩根氏菌(Morganella morga nii)、摩根氏菌属、嗜冷菌属(Moritella)、嗜冷菌2D2、Moryella、Moryella indoligenes、Moryella naviforme、Moryella、分枝杆菌属(Mycobacterium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、分枝杆菌属、Negativicoccus、Negativicoccus、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、Nitrosomonas eutropha、Novosphingobium、Novosphingobium、Odoribacter、Odoribacterlaneus、Odoribacter splanchnicus、Odoribacter、Olsenella、Olsenella 1832、Olsenella F0206、Olsenella、Orbus、Orbus gilliamella、Oribacterium、Oribacterium、Oscillibacter、Oscillibacter细菌、Oscillibacter富集、Oscillibacter、Owenweeksia、Owenweeksia、草酸杆菌属(Oxalobacter)、产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)、草酸杆菌属、Paludibacter、Paludibacter、泛菌属(Pantoea)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea eucalypti、泛菌属、Papillibacter、Papillibactercinnamivorans、Papillibacter、Parabacteroides、Parabacteroides ASF519、Parabacteroides CR-34、Parabacteroides distasonis、Parabacteroides DJF_B084、Parabacteroides DJF_B086、Parabacteroides dnLKV8、Parabacteroides富集、Parabacteroides fecal、Parabacteroides goldsteinii、Parabacteroides gordonii、Parabacteroides johnsonii、Parabacteroides merdae、Parabacteroides mpnisolate、Parabacteroides nlaezlp340、Parabacteroides、Paraeggerthella、Paraeggerthellahongkongensis、Paraeggerthella nlaezlp797、Paraeggerthella nlaezlp896、Paraprevotella、Paraprevotella clara、Paraprevotella、Paraprevotellaxylaniphila、Parasutterella、Parasutterella excrementihominis、Parasutterella、果胶杆菌属(Pectobacterium)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、Pectobacterium wasabiae、片球菌属(Pediococcus)、片球菌te2r、片球菌属、土地杆菌属(Pedobacter)、土地杆菌属b3N1b-b5、Pedobacter daechungensis、土地杆菌属、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、Peptostreptococcus stomatis、消化链球菌属、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、Phascolarctobacterium faecium、考拉杆菌属、发光杆菌属(Photobacterium)、发光杆菌属MIE、Pilibacter、Pilibacter、浮霉状菌属(Planctomyces)、浮霉状菌属、动球菌科(Planococcaceae)_incertae_sedis、动球菌科_incertae_sedis、Planomicrobium、Planomicrobium、邻单胞菌属(Plesiomonas)、邻单胞菌属、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)、产卟啉杆菌KK348、红棕色单胞菌属(Porphyromonas)、不解糖红棕色单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)、Porphyromonas bennonis、Porphyromonascanine、Porphyromonas somerae、红棕色单胞菌属、普雷沃氏菌属(Prevotella)、普雷沃氏菌属细菌、普雷沃氏菌BI-42、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、口颊普雷沃氏菌(Prevotella buccalis)、人体普雷沃氏菌(Prevotella copri)、普雷沃氏菌DJF_B112、Prevotella mpnisolate、口腔普雷沃氏菌(Prevotella oral)、普雷沃氏菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸杆菌LG、丙酸杆菌属、Proteiniborus、Proteiniborus、Proteiniphilum、Proteiniphilum、变形菌属(Proteus)、变形菌HS7514、普罗威登斯菌属(Providencia)、普罗威登斯菌属、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、假丁酸弧菌属细菌、Pseudobutyrivibrio fibrisolvens、Pseudobutyrivibrio ruminis、假丁酸弧菌属、Pseudochrobactrum、Pseudochrobactrum、Pseudoflavonifractor、Pseudoflavonifractor asf500、Pseudoflavonifractor细菌、Pseudoflavonifractorcapillosus、Pseudoflavonifractor NML、Pseudoflavonifractor、假单胞菌属(Pseudomonas)、假单胞菌1043、假单胞菌10569、假单胞菌127(39-zx)、假单胞菌12A_19、假单胞菌145(38zx)、假单胞菌22010、假单胞菌32010、假单胞菌34t20、假单胞菌3C_10、假单胞菌4-5(2010)、假单胞菌4-9(2010)、假单胞菌6-13.J、假单胞菌63596、假单胞菌82010、假单胞菌a001-142L、假单胞菌a101-18-2、假单胞菌a111-5、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、Pseudomonas amsp1、假单胞菌AU2390、假单胞菌AZ18R1、Pseudomonas azotoformans、假单胞菌B122、假单胞菌B65(2012)、假单胞菌属细菌、假单胞菌BJSX、假单胞菌BLH-8D5、假单胞菌BWDY-29、假单胞菌CA18、假单胞菌Cantas12、假单胞菌CB11、假单胞菌CBZ-4、Pseudomonas cedrina、假单胞菌CGMCC、假单胞菌CL16、假单胞菌CNE、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、Pseudomonas cuatrocienegasensis、假单胞菌CYEB-7、假单胞菌D5、假单胞菌DAP37、假单胞菌DB48、Pseudomonas deceptionensis、假单胞菌Den-05、假单胞菌DF7EH1、假单胞菌DhA-91、假单胞菌DVS14a、假单胞菌DYJK4-9、假单胞菌DZQ5、假单胞菌E11_ICE19B、假单胞菌E2.2、假单胞菌e2-CDC-TB4D2、假单胞菌EM189、假单胞菌富集、Pseudomonasextremorientalis、假单胞菌FAIR/BE/F/GH37、假单胞菌FAIR/BE/F/GH39、假单胞菌FAIR/BE/F/GH94、假单胞菌FLM05-3、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、假单胞菌'FSL、假单胞菌G1013、Pseudomonas gingeri、假单胞菌HC2-2、假单胞菌HC2-4、假单胞菌HC2-5、假单胞菌HC4-8、假单胞菌HC6-6、假单胞菌Hg4-06、假单胞菌HLB8-2、假单胞菌HLS12-1、假单胞菌HSF20-13、假单胞菌HW08、假单胞菌II-44、假单胞菌IpA-92、假单胞菌IV、假单胞菌JCM、Pseudomonas jessenii、假单胞菌JSPB5、假单胞菌K3R3.1A、假单胞菌KB40、假单胞菌KB42、假单胞菌KB44、假单胞菌KB63、假单胞菌KB73、假单胞菌KK-21-4、假单胞菌KOPRI、假单胞菌L1R3.5、假单胞菌LAB-27、假单胞菌LAB-44、假单胞菌Lc10-2、Pseudomonas libanensis、假单胞菌Ln5C.7、假单胞菌LS197、隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、假单胞菌MFY143、假单胞菌MFY146、假单胞菌MY1404、假单胞菌MY1412、假单胞菌MY1416、假单胞菌MY1420、假单胞菌N14zhy、假单胞菌NBRC、假单胞菌NCCP-506、假单胞菌NFU20-14、假单胞菌NJ-22、假单胞菌NJ-24、假单胞菌Nj-3、假单胞菌Nj-55、假单胞菌Nj-56、假单胞菌Nj-59、假单胞菌Nj-60、假单胞菌Nj-62、假单胞菌Nj-70、假单胞菌NP41、假单胞菌OCW4、假单胞菌OW3-15-3-2、假单胞菌P1(2010)、假单胞菌P2(2010)、假单胞菌P3(2010)、假单胞菌P4(2010)、假单胞菌PD、假单胞菌PF1B4、假单胞菌PF2M10、假单胞菌PILH1、Pseudomonas poae、Pseudomonasproteobacterium、假单胞菌ps4-12、假单胞菌ps4-2、假单胞菌ps4-28、假单胞菌ps4-34、假单胞菌ps4-4、Pseudomonas psychrophila、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌R-35721、假单胞菌R-37257、假单胞菌R-37265、假单胞菌R-37908、假单胞菌RBE1CD-48、假单胞菌RBE2CD-42、假单胞菌regd9、假单胞菌RKS7-3、假单胞菌S2、Pseudomonasseawater、假单胞菌SGb08、假单胞菌SGb120、假单胞菌SGb396、假单胞菌sgn、假单胞菌'Shk、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、托拉氏假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)、Pseudomonas trivialis、假单胞菌TUT1023、假单胞菌属、假单胞菌W15Feb26、假单胞菌W15Feb4、假单胞菌W15Feb6、假单胞菌WD-3、假单胞菌WR4-13、假单胞菌WR7#2、假单胞菌Y1000、假单胞菌ZS29-8、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、嗜冷杆菌umb13d、嗜冷杆菌属、Pyramidobacter、Pyramidobacter piscolens、Pyramidobacter、拉恩氏菌属(Rahnella)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、Rahnella carotovorum、拉恩氏菌GIST-WP4w1、拉恩氏菌LR113、拉恩氏菌属、拉恩氏菌Z2-S1、青枯菌属(Ralstonia)、青枯菌属细菌、青枯菌属、Raoultella、Raoultella B19、Raoultella富集、Raoultella planticola、Raoultellasv6xvii、Raoultella SZ015、Raoultella、肾杆菌属(Renibacterium)、肾杆菌G20、根瘤菌属(Rhizobium)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、红球菌属(Rhodococcus)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、红小梨形菌属(Rhodopirellula)、红小梨形菌属、立默氏菌属(Riemerella)、鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)、理研菌属(Rikenella)、理研菌属、Robinsoniella、Robinsoniella peoriensis、Robinsoniella、Roseburia、Roseburia 11SE37、Roseburia细菌、Roseburia cecicola、Roseburia DJF_VR77、Roseburia faecis、Roseburia fibrisolvens、Roseburia hominis、Roseburiaintestinalis、Roseburia inulinivorans、Roseburia、Roseibacillus、Roseibacillus、Rothia、Rothia、Rubritalea、Rubritalea、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、瘤胃球菌25F6、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、瘤胃球菌属细菌、布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)、伶俐瘤胃球菌(Ruminococcus callidus)、Ruminococcus champanellensis、瘤胃球菌DJF_VR87、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、Ruminococcus gauvreauii、酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)、瘤胃球菌NK3A76、瘤胃球菌属、瘤胃球菌YE71、Saccharofermentans、Saccharofermentans、盐水球菌属(Salinicoccus)、盐水球菌属、Salinimicrobium、Salinimicrobium、沙门氏菌属(Salmonella)、Salmonellaagglomerans、沙门氏菌属细菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、Salmonellafreundii、Salmonella hermannii、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、沙门氏菌SL0604、Salmonella subterranea、沙门氏菌属、Scardovia、Scardovia oral、Schwartzia、Schwartzia、Sedimenticola、Sedimenticola、Sediminibacter、Sediminibacter、月形单胞菌属(Selenomonas)、Selenomonas fecal、月形单胞菌属、蛇形菌属(Serpens)、蛇形菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、沙雷氏菌1135、沙雷氏菌136-2、沙雷氏菌5.1R、沙雷氏菌AC-CS-1B、沙雷氏菌AC-CS-B2、Serratia aquatilis、沙雷氏菌属细菌、沙雷氏菌属BS26、Serratiacarotovorum、沙雷氏菌DAP6、沙雷氏菌富集、沙雷氏菌F2、无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)、沙雷氏菌J145、沙雷氏菌JM983、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、变形斑病沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、Serratia proteolyticus、沙雷氏菌ptz-16s、Serratiaquinivorans、沙雷氏菌SBS、沙雷氏菌SS22、Serratia trout、沙雷氏菌UA-G004、沙雷氏菌属、Serratia White、Serratia yellow、希瓦氏菌属(Shewanella)、Shewanella baltica、希瓦氏菌属、Slackia、Slackia intestinal、Slackia isoflavoniconvertens、SlackiaNATTS、Slackia、Solibacillus、Solibacillus、Solobacterium、Solobacterium moorei、Solobacterium、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、鞘脂菌属(Sphingobium)、鞘脂菌属、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘氨醇单胞菌属、Sporacetigenium、Sporacetigenium、Sporobacter、Sporobacter、Sporobacterium、Sporobacterium olearium、葡萄球菌属(Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、葡萄球菌PCA17、葡萄球菌属、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、寡养单胞菌属、链球菌属(Streptococcus)、链球菌1606-02B、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、Streptococcus细菌、牛链球菌(Streptococcusbovis)、Streptococcus ChDC、咽峡炎链球菌(Streptococcus constellatus)、Streptococcus CR-314S、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、Streptococcuscriceti、Streptococcus cristatus、双醋酸乳链球菌(Streptococcus diacetylactis)、汗毛链球菌(Streptococcus downei)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、链球菌富集、马链球菌(Streptococcus equi)、马肠链球菌(Streptococcus equinus)、链球菌ES11、Streptococcus eubacterium、Streptococcus fecal、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、Streptococcus gallinaceus、Streptococcus gallolyticus、Streptococcusgastrococcus、Streptococcus genomosp、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、链球菌I5、Streptococcus infantarius、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、乳链球菌(Streptococcus Lactis)、链球菌Je2、链球菌JS-CD2、链球菌LRC、Streptococcusluteciae、Streptococcus lutetiensis、链球菌M09-11185、缓症链球菌(Streptococcusmitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、链球菌NA、链球菌nlaezlc353、链球菌nlaezlp68、链球菌nlaezlp758、链球菌nlaezlp807、口腔链球菌(Streptococcus oral)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、海豹链球菌(Streptococcus phocae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、猪链球菌(Streptococcus porcinus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、链球菌S16-08、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、Streptococcus symbiont、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌TW1、链球菌属、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、Streptococcus warneri、链球菌XJ-RY-3、链霉菌属(Streptomyces)、Streptomyces malaysiensis、链霉菌MVCS6、Streptophyta、Streptophyta cordifolium、Streptophyta ginseng、Streptophyta hirsutum、Streptophyta oleracea、Streptophyta sativa、Streptophyta sativum、Streptophytasativus、Streptophyta tabacum、Streptophyta、Subdivision3_genera_incertae_sedis、Subdivision3_genera_incertae_sedis、Subdoligranulum、Subdoligranulum细菌、Subdoligranulum ic1393、Subdoligranulum ic1395、Subdoligranulum、Subdoligranulumvariabile、Succiniclasticum、Succiniclasticum、Sulfuricella、Sulfuricella、硫磺单胞菌属(Sulfurospirillum)、硫磺单胞菌属、萨特氏菌属(Sutterella)、萨特氏菌属、Sutterella wadsworthensis、互营球菌属(Syntrophococcus)、互营球菌属、共养单胞菌属(Syntrophomonas)、Syntrophomonas bryantii、共养单胞菌属、互营菌属(Syntrophus)、互营菌属、坦纳菌属(Tannerella)、坦纳菌属、塔特姆氏菌属(Tatumella)、塔特姆氏菌属、热丝菌属(Thermofilum)、热丝菌属、Thermogymnomonas、Thermogymnomonas、Thermovirga、Thermovirga、硫单胞菌属(Thiomonas)、硫单胞菌ML1-46、Thorsellia、Thorselliacarsonella、TM7_genera_incertae_sedis、TM7_genera_incertae_sedis、毛球菌属(Trichococcus)、毛球菌属、Turicibacter、Turicibacter sanguinis、Turicibacter、漫游球菌属(Vagococcus)、漫游球菌bfs11-15、漫游球菌属、吸血弧菌属(Vampirovibrio)、吸血弧菌属、Varibaculum、Varibaculum、贪噬菌属(Variovorax)、贪噬菌KS2D-23、韦荣氏球菌属(Veillonella)、殊异韦荣氏球菌(Veillonella dispar)、韦荣氏球菌MSA12、韦荣氏球菌OK8、口腔韦荣氏球菌(Veillonella oral)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、Veillonella tobetsuensis、韦荣氏球菌属、弧菌属(Vibrio)、弧菌3C1、弧菌属、食物谷菌属(Victivallis)、食物谷菌属、Victivallis vadensis、Vitellibacter、Vitellibacter、Wandonia、Wandonia haliotis、魏斯氏菌属(Weissella)、Weissella cibaria、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、Weissella oryzae、魏斯氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)、耶尔森氏菌9gw38、耶尔森氏菌A125、阿氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)、Yersiniaaleksiciae、耶尔森氏菌b702011、耶尔森氏菌属细菌、伯氏耶尔森氏菌(Yersiniabercovieri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、Yersiniaentomophaga、弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Yersiniaintermedia)、克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)、耶尔森氏菌MAC、Yersiniamassiliensis、莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)、Yersinia nurmii、Yersiniapekkanenii、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)、罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)、耶尔森氏菌s10fe31、耶尔森氏菌s17fe31、耶尔森氏菌s4fe31、耶尔森氏菌属、耶尔森氏菌YEM17B。

在一些实施方案中，所述微生物选自列表1：

列表1

术语“有益微生物“用于本文中意指下述微生物，其缺乏或数量减少与受试者的疾病、病况、病症，或其症状，或任何对受试者健康的不良影响相关。举例而言，在一些实施方案中，所述有益微生物帮助维持受试者的正常机能。在一些实施方案中，所述有益微生物帮助保护受试者免受一种或多种有害微生物的定植或侵入。在一些实施方案中，所述有益微生物阻滞受试者中有害微生物的过度生长。

在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是本申请其他部分所提及的任何疾病、病况、病症。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是大肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是小肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是胃肠道基质肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是结肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是直肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是十二指肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是空肠癌。在一些实施方案中，所述疾病、病况、病症是回肠癌。

在一些实施方案中，所述有益微生物可包含一种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，所述有益微生物可包含至少两种(2、3、4、或全部5种)选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，所述有益微生物是益生菌。在本文中，术语益生菌意指当以充分量施用时，给予宿主健康上的益处的活的微生物。益生菌非限制性的实例包括选自下组的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)有孢子乳酸菌(Sporolactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、漫游球菌属(Vagococcus)、四体球菌属(Tetragenococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、阿托波氏菌属(Atopobium)、魏斯氏菌属(Weissella)、贫养菌属(Abiotrophia)、颗粒链菌属(Granulicatella)、酒球菌属(Oenococcus)、副乳杆菌属(Paralactobacillus)，酵母属(Saccharomyces)或其组合。

属于乳杆菌属的益生菌的非限制性实例包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgarius)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，或其组合。

属于肠球菌属的益生菌的非限制性实例包括：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)，或其组合。

属于乳球菌属的益生菌的非限制性实例包括：乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

属于链球菌属的益生菌的非限制性实例包括：乳脂链球菌(Streptococcuscremoris)、双醋酸乳链球菌(Streptococcus diacetylactis)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、乳链球菌(Streptococcus Lactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，或其组合。

属于双歧杆菌属的益生菌的非限制性实例包括：两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlatis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，或其组合。

属于酵母属的益生菌的非限制性实例包括：布拉迪酵母(Saccharomycesboulardii)。

本发明涉及的有益微生物还可包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、副大肠杆菌(Paracolon)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、变形菌属(Proteus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎杆菌属(Pneumobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母菌属(Saccharomyces)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、Collinsella、乳杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、小毛菌属(Hirsutellia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Dorea、利斯特氏菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphyloccocus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、白色假丝酵母(Candida albicans)、真菌(Fungus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、和细菌噬菌体(Bacteriophages)。

在一些实施方案中，所述有害微生物可包含一种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

在一些实施方案中，所述有害微生物可包含至少两种(2、3、4、或全部5种)选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

本发明涉及的有害微生物可包括但不限于：细菌，如气单胞菌属(Aeromonas)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、毒素A/B(Toxin A/B)、大肠杆菌O157(Escherichia coliO157)、肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli(EAEC))、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli(EPEC))、产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli(ETEC)LT/ST)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli(EIEC))、产志贺样毒素大肠杆菌stx1/stx2(Shiga-like Toxin producing E.coli(STEC)stx1/stx2)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、霍乱弧菌5(Vibrio cholera 5)、和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)；病毒，如腺病毒40/41(Adenovirus 40/41)、诺如病毒GI/GII(Norovirus GI/GII)、轮状病毒A(Rotavirus A)、星状病毒(Astrovirus)、札幌病毒(Sapovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、肝炎病毒(hepatitis)、HIV、和CMV；原生生物，如隐孢子虫(Cryptosporidium)、痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫(Giardia)、和卡耶塔圆孢子虫(Cyclospora cayetanensis)；以及真菌。

实施例

提供以下实施例仅为了说明本发明的各个实施方案，而不意在以任何方式限制本发明。这些实施例，连同本文中所述的方法，是目前优选实施方案的代表，因此仅为示例性的，并不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到其变化和其他用途，这些变化和其他用途均涵盖在由权利要求书范围限定的本发明的精神内。

实施例1：确定样品中的微生物分布谱

首先，从环境获得样品。不经提取步骤，直接将样品裂解。用相对于列表1中的一种或多种微生物具有特异性的引物对样品中的核酸序列进行扩增或测序，从而确定样品中所述列表中的一种或多种微生物的浓度和数量。根据所得到的微生物的种类，以及其浓度和数量，确定样品中的微生物分布谱。

接着，将获得的微生物分布谱与多种参考微生物分布谱相比较。利用计算机辅助算法进行统计分析，确定了与所述获得的微生物分布谱关联度最高的参考微生物分布谱。

最后，根据标记所述关联度最高的参考微生物分布谱的参数的集合，将所述环境及样品标记为具有所述参数的集合。

实施例2：通过16S rRNA基因测序确定微生物分布谱

从环境获得了样品。未经提取，直接向样品添加裂解剂获得裂解液。使用杂交于16S rRNA保守区的引物对裂解液进行扩增。所述引物可分别为CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC(SEQ ID NO:1)和CGGTGTGTACAAGACCC(SEQ ID NO:2)，其用于扩增细菌16S rRNA基因的V6至V8区。用来自ThermoFisher Scientific的Taq DNA Polymerase Kit进行PCR。每个PCR混合物包含dNTP、Taq聚合酶、和上述两种引物。热循环反应如下所述：94℃进行5分钟，35个循环，每个循环包括94℃进行30秒，56℃进行20秒，和68℃进行40秒；最后68℃进行7分钟。根据生产商的实验规程，使用Illumina HiSeq高通量测序系统对扩增产物进行测序。通过将测序结果与GreenGenes细菌16S rRNA基因序列数据库(greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)进行比对来鉴定细菌的分类，并获得每种细菌的浓度和数量。基于测序结果获得细菌的分布谱。

实施例3：通过与参考微生物分布谱确定受试者的健康状态

根据如实施例2所述的方法，利用针对列表1中记载的微生物具有特异性的引物对，通过核酸扩增反应对受试者的粪便样品进行分析，获得了受试者的胃肠道微生物分布谱。将所述受试者的胃肠道微生物分布谱与针对已知处于下述根据American JointCommittee on Cancer(AJCC)大肠癌TNM分期标准所得到不同健康状况的人群所获得的参考微生物分布谱进行比较：

1)原发癌(T)分期：T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、或T4b；

2)淋巴结转移(N)分期：N0、N1、N1a、N1b、N1c、N2a、或N2b；以及

3)远处转移(M)分期：M0、M1、M1a、M1b。

(分期标准具体含义参见本发明其他部分的详述)

根据本发明所述的统计方法，获得了与所述受试者的胃肠道微生物分布谱相关联的参考微生物分布谱。根据上述参考微生物分布谱所对应的大肠癌分期标准，诊断所述受试者的大肠癌分期情况。

由前文所述应当理解，尽管已经图示和描述了特定的实现方式，但本文中设想到并且可以对此作出各种修改。同时，本文并不旨在通过说明书中提供的特定示例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但本文的优选实施方式的描述和图示不应以限制性的意义来解释。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的特定描绘、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。在本发明的实施方式的形式和细节方面的各种修改对于本领域技术人员将会是显而易见的。因此可以设想，本发明还应当覆盖任何这样的修改、改变和等同物。

Claims

1.一种确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的方法，其包括：

2.前述任一项权利要求的方法，其中3)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

3.前述任一项权利要求的方法，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱。

4.前述任一项权利要求的方法，其中当2)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联。

5.前述任一项权利要求的方法，其中所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记。

6.前述任一项权利要求的方法，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记。

7.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品来自受试者。

8.前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者是人。

9.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物样品包括活体组织、全血、血清、血浆、粘膜、唾液、拭子、尿、粪便、细胞、组织、淋巴液、CNS液和病变渗出物或其组合。

10.前述任一项权利要求的方法，其中所述粘膜是胃粘膜。

11.前述任一项权利要求的方法，其中所述拭子是直肠拭子。

12.前述任一项权利要求的方法，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

13.前述任一项权利要求的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

14.前述任一项权利要求的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

15.前述任一项权利要求的方法，其中所述参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史、疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

16.前述任一项权利要求的方法，其中所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

17.前述任一项权利要求的方法，其中所述病史为癌症病史。

18.前述任一项权利要求的方法，其中所述癌症为肠癌。

19.前述任一项权利要求的方法，其中所述肠癌为大肠癌。

20.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

21.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

22.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

23.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

24.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

25.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

26.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

27.前述任一项权利要求的方法，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后。

28.前述任一项权利要求的方法，其中所述诊断包括诊断所述受试者是否罹患所述癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

29.前述任一项权利要求的方法，其中所述癌症为大肠癌。

30.前述任一项权利要求的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

31.前述任一项权利要求的方法，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户。

32.一种确定受试者健康状况的方法，其包括：

33.权利要求32的方法，其中所述正常生物样品来自健康状况正常或被认为正常的个体。

34.权利要求32或33的方法，其中所述正常生物样品来自当处于正常的或被认为正常的健康状况的所述受试者自身。

35.权利要求32-34任一项所述的方法，其中所述正常生物样品的参考微生物分布谱是根据来自多个健康状况正常或被认为正常的个体的生物样品的微生物分布谱通过统计方法获得的。

36.权利要求32-35任一项所述的方法，其中当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常。

37.权利要求32-36任一项所述的方法，其中当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常。

38.权利要求32-37任一项所述的方法，其中所述生物样品为胃肠道样品。

39.权利要求32-38任一项所述的方法，其中所述胃肠道样品选自下组：粪便、活体组织、胃粘膜、直肠拭子，或其组合。

40.权利要求32-39任一项所述的方法，其中当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常。

41.权利要求32-40任一项所述的方法，其中当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常。

42.权利要求32-41任一项所述的方法，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌的风险。

43.权利要求32-42任一项所述的方法，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌。

44.一种确定受试者健康状况的方法，其包括：

3)将所述生物样品的微生物分布谱与多个参考生物样品的参考微生物分布谱进行比较；以及

45.权利要求44的方法，其中所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记。

46.权利要求44或45的方法，其中所述参数值的集合包括一个或多个特征参数值和一个或多个诊断参数值，所述特征参数值描述个体或群体的特征，所述诊断参数值描述相对于所述个体或群体的诊断。

47.权利要求44-46任一项所述的方法，其中在4)之前根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱。

48.权利要求44-47任一项所述的方法，其中4)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

49.权利要求44-48任一项所述的方法，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱。

50.权利要求44-49任一项所述的方法，其中当4)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联。

51.权利要求44-50任一项所述的方法，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记。

52.权利要求44-51任一项所述的方法，其中根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断。

53.权利要求44-52任一项所述的方法，其中所述特征性参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史，或其组合。

54.权利要求44-53任一项所述的方法，其中所述诊断性参数选自下组：疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

55.权利要求44-54任一项所述的方法，其中所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

56.权利要求44-55任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

57.权利要求44-56任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

58.权利要求44-57任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

59.权利要求44-58任一项所述的方法，其中所述癌症为肠癌。

60.权利要求44-59任一项所述的方法，其中所述肠癌为大肠癌。

61.权利要求44-60任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

62.权利要求44-61任一项所述的方法，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

63.权利要求44-62任一项所述的方法，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

64.权利要求44-63任一项所述的方法，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

65.权利要求44-64任一项所述的方法，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

66.权利要求44-65任一项所述的方法，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

67.权利要求44-66任一项所述的方法，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

68.权利要求44-67任一项所述的方法，其中所述对受试者进行诊断包括诊断所述受试者是否罹患癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

69.权利要求44-68任一项所述的方法，其中所述癌症为大肠癌。

70.权利要求44-69任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

71.一种用于确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的计算机辅助的方法，其包括：

72.权利要求71的方法，其中5)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

73.权利要求71或72的方法，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定步骤。

74.权利要求71-73任一项所述的方法，还包括当4)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定步骤。

75.权利要求71-74任一项所述的方法，还包括将多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

76.权利要求71-75任一项所述的方法，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

77.权利要求71-76任一项所述的方法，其中所述生物样品来自受试者。

78.权利要求71-77任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

79.权利要求71-78任一项所述的方法，其中所述生物样品包括活体组织、全血、血清、血浆、粘膜、唾液、拭子、尿、粪便、细胞、组织、淋巴液、CNS液和病变渗出物或其组合。

80.权利要求71-79任一项所述的方法，其中所述粘膜是胃粘膜。

81.权利要求71-80任一项所述的方法，其中所述拭子是直肠拭子。

82.权利要求71-81任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

83.权利要求71-82任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

84.权利要求71-83任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

85.权利要求71-84任一项所述的方法，其中所述参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史、疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

86.权利要求71-85任一项所述的方法，其中所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

87.权利要求71-86任一项所述的方法，其中所述病史为癌症病史。

88.权利要求71-87任一项所述的方法，其中所述癌症为肠癌。

89.权利要求71-88任一项所述的方法，其中所述肠癌为大肠癌。

90.权利要求71-89任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

91.权利要求71-90任一项所述的方法，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

92.权利要求71-91任一项所述的方法，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

93.权利要求71-92任一项所述的方法，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

94.权利要求71-93任一项所述的方法，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

95.权利要求71-94任一项所述的方法，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

96.权利要求71-95任一项所述的方法，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

97.权利要求71-96任一项所述的方法，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后的获得步骤。

98.权利要求71-97任一项所述的方法，其中所述诊断包括诊断所述受试者是否罹患所述癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

99.权利要求71-98任一项所述的方法，其中所述癌症为大肠癌。

100.权利要求71-99任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

101.权利要求71-100任一项所述的方法，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户的发送步骤。

102.一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的方法，其包括：

103.权利要求102的方法，其中所述正常生物样品来自健康状况正常或被认为正常的个体。

104.权利要求102或103的方法，其中所述正常生物样品来自当处于正常的或被认为正常的健康状况的所述受试者自身。

105.权利要求102-104任一项所述的方法，其中所述正常生物样品的参考微生物分布谱是根据来自多个健康状况正常或被认为正常的个体的生物样品的微生物分布谱通过统计方法获得的。

106.权利要求102-105任一项所述的方法，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常的确定步骤。

107.权利要求102-106任一项所述的方法，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常的确定步骤。

108.权利要求102-107任一项所述的方法，其中所述生物样品为胃肠道样品。

109.权利要求102-108任一项所述的方法，其中所述胃肠道样品选自下组：粪便、活体组织、胃粘膜、直肠拭子，或其组合。

110.权利要求102-109任一项所述的方法，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常的确定步骤。

111.权利要求102-110任一项所述的方法，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常的确定步骤。

112.权利要求102-111任一项所述的方法，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌的风险。

113.权利要求102-112任一项所述的方法，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌。

114.权利要求102-113任一项所述的方法，还包括将确定所述受试者的健康状况的结果发送给用户的发送步骤。

115.一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的方法，其包括：

116.权利要求115的方法，还包括将所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

117.权利要求115或116的方法，其中所述参数值的集合包括一个或多个特征参数值和一个或多个诊断参数值，所述特征参数值描述个体或群体的特征，所述诊断参数值描述相对于所述个体或群体的诊断。

118.权利要求115-117任一项所述的方法，还包括在关联步骤之前根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱的确定步骤。

119.权利要求115-118任一项所述的方法，其中所述关联步骤包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平的确定步骤。

120.权利要求115-119任一项所述的方法，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定步骤。

121.权利要求115-120任一项所述的方法，还包括当5)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定步骤。

122.权利要求115-121任一项所述的方法，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记步骤。

123.权利要求115-122任一项所述的方法，还包括根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断的诊断步骤。

124.权利要求115-123任一项所述的方法，其中所述特征性参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史，或其组合。

125.权利要求115-124任一项所述的方法，其中所述诊断性参数选自下组：疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

126.权利要求115-125任一项所述的方法，其中所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

127.权利要求115-126任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

128.权利要求115-127任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

129.权利要求115-128任一项所述的方法，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

130.权利要求115-129任一项所述的方法，其中所述癌症为肠癌。

131.权利要求115-130任一项所述的方法，其中所述肠癌为大肠癌。

132.权利要求115-131任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

133.权利要求115-132任一项所述的方法，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

134.权利要求115-133任一项所述的方法，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

135.权利要求115-134任一项所述的方法，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

136.权利要求115-135任一项所述的方法，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

137.权利要求115-136任一项所述的方法，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

138.权利要求115-137任一项所述的方法，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

139.权利要求115-138任一项所述的方法，其中所述对受试者进行诊断包括诊断所述受试者是否罹患癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

140.权利要求115-139任一项所述的方法，其中所述癌症为大肠癌。

141.权利要求115-140任一项所述的方法，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

142.前述任一项权利要求的方法，其中所述微生物分布谱包含微生物的种类和数量或浓度。

143.前述任一项权利要求的方法，其中所述数量或浓度为相对数量或浓度。

144.前述任一项权利要求的方法，其中所述一种或多种微生物选自细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

145.前述任一项权利要求的方法，其中所述一种或多种微生物包含至少两种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

146.前述任一项权利要求的方法，其中所述一种或多种微生物是选自列表1的一种或多种微生物。

147.前述任一项权利要求的方法，其中所述核酸扩增反应采用选自下组的方法进行：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。

148.前述任一项权利要求的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。

149.前述任一项权利要求的方法，其中所述核酸扩增反应是qPCR。

150.前述任一项权利要求的方法，其中所述核酸扩增反应是ddPCR。

151.前述任一项权利要求的方法，其中在进行核酸扩增反应之前无须进行核酸提取。

152.前述任一项权利要求的方法，其中所述所有步骤在2小时之内完成。

153.前述任一项权利要求的方法，其中确定微生物的种类包括用对所述微生物具特异性的引物进行核酸扩增反应。

154.前述任一项权利要求的方法，其中对所述微生物具特异性的引物是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

155.前述任一项权利要求的方法，其中对所述微生物具特异性的引物不是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

156.前述任一项权利要求的方法，其中所述测序是第二代测序或第三代测序。

157.前述任一项权利要求的方法，其中步骤1)中通过测序获得微生物的种类，其包括：

iii.基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

158.前述任一项权利要求的方法，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应同时进行。

159.前述任一项权利要求的方法，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应分别进行。

160.前述任一项权利要求的方法，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在同一反应体系中进行。

161.前述任一项权利要求的方法，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在不同反应体系中进行。

162.一种用于选自前述任一项权利要求所述的方法的试剂盒，其包含：

1)对所述一种或多种微生物具有特异性的引物对；

2)用于核酸扩增反应的酶；

3)用于核酸扩增反应的缓冲液；

4)dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

163.一种用于前述任一项权利要求所述的方法的试剂盒，其包含：

1)用于对所述一种或多种微生物进行测序的引物；

2)用于测序反应的酶；

3)用于测序反应的缓冲液；

4)修饰和/或未修饰的dNTP；

5)任选地，阴性对照；

6)任选地，阳性对照；以及

7)任选地，定量标准物。

164.检测剂在制备用于前述任一项权利要求所述的方法的试剂盒中的用途，其中所述检测剂是对所述多种微生物中的一种或多种微生物具有特异性的引物对。

165.检测剂在制备用于前述任一项权利要求所述的方法的试剂盒中的用途，其中所述检测剂是用于对所述多种微生物中的一种或多种微生物进行测序的引物。

166.一种用于执行前述任一项权利要求的方法的系统，其包括：

2)计算机处理器，该计算机处理器耦合至所述热循环仪并被编程为执行前述任一项权利要求所述的方法。

167.一种用于执行前述任一项权利要求的方法的系统，其包括：

168.一种用于确定包含多种微生物的生物样品中的微生物分布谱的计算机辅助的系统，其包括：

3)用于存储多个参考微生物分布谱的存储装置；

5)用于根据比较装置的比较结果，将所述生物样品的微生物分布谱与一个或多个候选参考微生物分布谱相关联的关联装置。

169.权利要求168的系统，其中5)中的关联包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平。

170.权利要求168或169的系统，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定装置。

171.权利要求168-170任一项所述的系统，还包括当4)中未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定装置。

172.权利要求168-171任一项所述的系统，还包括将多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

173.权利要求168-172任一项所述的系统，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

174.权利要求168-173任一项所述的系统，其中所述生物样品来自受试者。

175.权利要求168-174任一项所述的系统，其中所述受试者是人。

176.权利要求168-175任一项所述的系统，其中所述生物样品包括活体组织、全血、血清、血浆、粘膜、唾液、拭子、尿、粪便、细胞、组织、淋巴液、CNS液和病变渗出物或其组合。

177.权利要求168-176任一项所述的系统，其中所述粘膜是胃粘膜。

178.权利要求168-177任一项所述的系统，其中所述拭子是直肠拭子。

179.权利要求168-178任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

180.权利要求168-179任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

181.权利要求168-180任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

182.权利要求168-181任一项所述的系统，其中所述参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史、疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

183.权利要求168-182任一项所述的系统，其中所述疾病诊断为对于癌症的诊断。

184.权利要求168-183任一项所述的系统，其中所述病史为癌症病史。

185.权利要求168-184任一项所述的系统，其中所述癌症为肠癌。

186.权利要求168-185任一项所述的系统，其中所述肠癌为大肠癌。

187.权利要求168-186任一项所述的系统，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

188.权利要求168-187任一项所述的系统，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

189.权利要求168-188任一项所述的系统，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

190.权利要求168-189任一项所述的系统，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

191.权利要求168-190任一项所述的系统，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

192.权利要求168-191任一项所述的系统，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

193.权利要求168-192任一项所述的系统，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

194.权利要求168-193任一项所述的系统，其进一步包括获得对所述癌症的诊断或预后的获得装置。

195.权利要求168-194任一项所述的系统，其中所述诊断包括诊断所述受试者是否罹患所述癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

196.权利要求168-195任一项所述的系统，其中所述癌症为大肠癌。

197.权利要求168-196任一项所述的系统，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

198.权利要求168-197任一项所述的系统，还包括将关联结果、标记结果、和/或诊断结果发送给用户的发送装置。

199.一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的系统，其包括：

200.权利要求199的系统，其中所述正常生物样品来自健康状况正常或被认为正常的个体。

201.权利要求199或200的系统，其中所述正常生物样品来自当处于正常的或被认为正常的健康状况的所述受试者自身。

202.权利要求199-201任一项所述的系统，其中所述正常生物样品的参考微生物分布谱是根据来自多个健康状况正常或被认为正常的个体的生物样品的微生物分布谱通过统计系统获得的。

203.权利要求199-202任一项所述的系统，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为正常的确定装置。

204.权利要求199-203任一项所述的系统，还包括当所述生物样品的微生物分布谱与正常生物样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的健康状况为异常的确定装置。

205.权利要求199-204任一项所述的系统，其中所述生物样品为胃肠道样品。

206.权利要求199-205任一项所述的系统，其中所述胃肠道样品选自下组：粪便、活体组织、胃粘膜、直肠拭子，或其组合。

207.权利要求199-206任一项所述的系统，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱不存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为正常的确定装置。

208.权利要求199-207任一项所述的系统，还包括当所述胃肠道样品的微生物分布谱与正常胃肠道样品的参考微生物分布谱存在统计学上显著差异时，确定所述受试者的胃肠道健康状况为异常的确定装置。

209.权利要求199-208任一项所述的系统，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌的风险。

210.权利要求199-209任一项所述的系统，其中所述异常的胃肠道健康状况为罹患大肠癌。

211.权利要求199-210任一项所述的系统，还包括将确定所述受试者的健康状况的结果发送给用户的发送装置。

212.一种用于通过包含多种微生物的、来自受试者的生物样品确定受试者健康状况的计算机辅助的系统，其包括：

3)用于存储多个参考微生物分布谱的存储步骤；

213.权利要求212的系统，还包括将所述多个参考微生物分布谱中的每一个均用特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

214.权利要求212或213的系统，其中所述参数值的集合包括一个或多个特征参数值和一个或多个诊断参数值，所述特征参数值描述个体或群体的特征，所述诊断参数值描述相对于所述个体或群体的诊断。

215.权利要求212-214任一项所述的系统，还包括在关联装置之前根据受试者的特征，确定具有与受试者的特征相对应的特征参数值的候选参考微生物分布谱的确定装置。

216.权利要求212-215任一项所述的系统，其中所述关联装置包括确定所述生物样品的微生物分布谱与所述一个或多个候选参考微生物分布谱中的每一个相关联的置信水平的确定装置。

217.权利要求212-216任一项所述的系统，还包括根据上述置信水平，确定与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱的确定装置。

218.权利要求212-217任一项所述的系统，还包括当5)之前未能确定任何候选参考微生物分布谱时，确定所述生物样品的微生物分布谱不与任何参考生物分布谱相关联的确定装置。

219.权利要求212-218任一项所述的系统，还包括当确定了与所述生物样品的微生物分布谱关联度最高的候选参考微生物分布谱时，将所述生物样品用标记所述候选参考微生物分布谱的所述特定参数值组成的集合进行标记的标记装置。

220.权利要求212-219任一项所述的系统，还包括根据标记所述生物样品的上述特定参数值组成的集合中的诊断参数值，对所述受试者进行诊断的诊断装置。

221.权利要求212-220任一项所述的系统，其中所述特征性参数选自下组：年龄、性别、地域、种族、民族、病史、家族病史、饮食、吸烟、饮酒、遗传特征、肥胖、血压、体育锻炼、肠部疾病、结肠直肠息肉、用药史，或其组合。

222.权利要求212-221任一项所述的系统，其中所述诊断性参数选自下组：疾病诊断结果、疾病预后结果，或其组合。

223.权利要求212-222任一项所述的系统，其中所述疾病诊断结果为对于癌症的诊断。

224.权利要求212-223任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自受试者自身。

225.权利要求212-224任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的个体。

226.权利要求212-225任一项所述的系统，其中所述参考微生物分布谱来自处于健康或认为处于健康状态的受试者自身。

227.权利要求212-226任一项所述的系统，其中所述癌症为肠癌。

228.权利要求212-227任一项所述的系统，其中所述肠癌为大肠癌。

229.权利要求212-228任一项所述的系统，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

230.权利要求212-229任一项所述的系统，其中所述大肠癌的分期选自下组：0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、和IVB。

231.权利要求212-230任一项所述的系统，其中所述大肠癌的原发肿瘤分期(T)选自下组：TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a、和T4b。

232.权利要求212-231任一项所述的系统，其中所述大肠癌的淋巴结肿瘤分期(N)选自下组：NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a、和N2b。

233.权利要求212-232任一项所述的系统，其中所述大肠癌的远处转移分期(M)选自下组：M0、M1a和M1b。

234.权利要求212-233任一项所述的系统，其中所述大肠癌是复发的大肠癌。

235.权利要求212-234任一项所述的系统，其中所述大肠癌是难治的大肠癌。

236.权利要求212-235任一项所述的系统，其中所述对受试者进行诊断包括诊断所述受试者是否罹患癌症，提供所述受试者罹患癌症的风险，或对于罹患癌症的受试者确定预后。

237.权利要求212-236任一项所述的系统，其中所述癌症为大肠癌。

238.权利要求212-237任一项所述的系统，其中所述大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

239.前述任一项权利要求的系统，其中所述微生物分布谱包含微生物的种类和数量或浓度。

240.前述任一项权利要求的系统，其中所述数量或浓度为相对数量或浓度。

241.前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物选自细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

242.前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物包含至少两种选自下组的微生物：细菌、真菌、原生生物、古菌、或病毒。

243.前述任一项权利要求的系统，其中所述一种或多种微生物是选自列表1的一种或多种微生物。

244.前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应采用选自下组的系统进行：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、等温扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链反应、转录介导的扩增、固相扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)和线性扩增。

245.前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。

246.前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是qPCR。

247.前述任一项权利要求的系统，其中所述核酸扩增反应是ddPCR。

248.前述任一项权利要求的系统，其中在进行核酸扩增反应之前无须进行核酸提取。

249.前述任一项权利要求的系统，其中所述所有装置在2小时之内完成。

250.前述任一项权利要求的系统，其中确定微生物的种类包括用对所述微生物具特异性的引物进行核酸扩增反应。

251.前述任一项权利要求的系统，其中对所述微生物具特异性的引物是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

252.前述任一项权利要求的系统，其中对所述微生物具特异性的引物不是针对16S或23S核糖体亚基的引物。

253.前述任一项权利要求的系统，其中所述测序是第二代测序或第三代测序。

254.前述任一项权利要求的系统，其中通过测序获得微生物的种类，其包括：

iii.基于所述比对鉴定所述微生物的种类。

255.前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应同时进行。

256.前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应分别进行。

257.前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在同一反应体系中进行。

258.前述任一项权利要求的系统，其中对多种微生物进行的核酸扩增反应或测序反应在不同反应体系中进行。

259.一种反应混合物，其包含：

1)包含多种微生物的生物样品；

3)用于核酸扩增反应的酶；

4)用于核酸扩增反应的缓冲液；以及

5)dNTP。

260.一种反应混合物，其包含：

1)包含多种微生物的生物样品；

3)用于测序反应的酶；

4)用于测序反应的缓冲液；以及

5)修饰和/或未修饰的dNTP。

261.一种组合物，其包含一种或多种对选自列表1的任一种微生物具有特异性的引物对。

262.一种组合物，其包含对一种或多种用于对选自列表1的任一种微生物进行测序的引物。

263.一种生物样品，其包含一种或多种选自列表1的微生物。