CN107385079A

CN107385079A - Pcr和rpa扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒

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Publication number: CN107385079A
Application number: CN201710770992.XA
Authority: CN
Inventors: 宋雪梅; 曹宇浩; 蒋永清; 姜俊芳; 吴建良
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: CN107385079B

Abstract

本发明涉及一种肉类生物检测技术，尤其涉及一种PCR和RPA扩增方法检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒。本发明设计了鸭、牛、羊、鸡、猪动物源成分PCR和RPA检测引物。PCR检测的最低靶序列拷贝数为10²个拷贝；猪、鸡源特异性引物RPA检测最低靶序列拷贝数为10²个，鸭、羊源特异性引物最低靶序列拷贝数为10¹个，牛源特异性引物最低靶序列拷贝数为10⁰个。

Description

PCR和RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肉类生物检测技术，尤其涉及一种PCR和RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒。

背景技术

近年来，牛、羊肉掺假事件时有发生。多地出现了羊肉中掺入猪肉、鸭肉、狐狸肉等其他价值较低的肉类，或是直接用猪肉、鸭肉掺上羊油、香精、羊肉粉等违法案件。这些连续曝光的制售假羊肉案件，引发了社会广泛关注。牛、羊肉掺假事件的原因主要有三个方面：

1.我国畜禽肉类及肉制品的消费市场十分巨大。建国以来，我国年人均肉类消费量增长了近13倍，肉类消费需求经过了从量到质的变化，目前正处于稳步上升的趋势。2013年张天佐等预测之后的10年，我国肉类产品需求量的平均增长速度不会低于5％。

2.中国畜禽养殖量庞大交易市场分布零散，监管部门难以全部覆盖，监管力度不能达到要求。有关资料统计，我国现存的肉牛隐藏在各种小乡镇与农村的街边的交易市场约有3000 余个，这类交易市场不仅大部分规模小，交易方式不规范，市场监管不到位，存在很多监管上的漏洞，让黑心商贩找到了可乘之机。

3.牛、羊肉等通过掺假可以获得大量的利润。受饲养成本增加等因素的影响，牛、羊肉等肉品市场价格逐渐提高。2011年我国牛、羊肉的市场售价分别为36元/kg和40元/kg，2017 年售价已经增加至70元/kg和60元/kg。而国内外都不乏不法商贩受利益的驱使，将低价的肉掺入高价的牛、羊肉中出售的事件，如2013年1月英国和爱尔兰爆出将马肉掺入牛肉汉堡中进行售卖的“马肉风波”；2013年2月江苏无锡侦破制售假羊肉案件。

猪肉、鸭肉掺入到牛、羊肉出售，以次充好，扰乱市场秩序的事件频发，不仅严重侵害消费者权益，甚至威胁到消费者的身体健康。而依据感官判断与形态学(如色泽、气味、弹性、等感官以及肌肉纹理等)等手段判断动物源的方式局限性较大，不能完全满足目前肉制品市场，特别是肉制品深加工产品的快速检测需求。因此，如何利用现代分子生物学技术提高动物源检测的水平，研发一套迅速、快捷、有效的检测体系，对于保护消费者利益，维护食品安全，具有重要意义。

目前动物源成分检测主要分为两大类，一类是基于蛋白质水平的检测，主要有电泳法、色谱法以及酶联免疫法；另一类是基于核酸水平的检测，主要有限制性片段长度多态性、PCR、多重PCR及实时荧光定量PCR，以及环介导等温扩增法等。

无论是蛋白质或核酸水平的检测技术大都需要昂贵、专业的仪器，操作过程繁琐，还需要具备扎实专业背景的操作人员，这些要求使得其中很多技术无法脱离实验室，进一步应用到生产实际当中。

要对我国目前混杂的肉类销售市场进行严格监管，亟需建立一种快速、简便、准确的肉类成分检测方法。与其他检测动物源成分的方式相比，RPA具有明显的优势。如能建立不同动物肉类RPA的核酸扩增体系，既符合消费者对于食品安全检测的迫切需求，也可以为国家质检部门提供新的技术支撑。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种同时适用PCR、RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的引物组；本发明的第二个目的是提供一种同时适用PCR、 RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的试剂盒；本发明的第三个目的是提供PCR扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，本发明的第四个目的是提供RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法。本发明设计了鸭、牛、羊、鸡、猪动物源成分PCR和 RPA检测引物。PCR可检测出的靶序列最低拷贝数为10²个拷贝；猪、鸡源特异性引物RPA 检测靶序列最低拷贝数为10²个，鸭、羊源特异性引物靶序列最低拷贝数为10¹个，牛源特异性引物靶序列最低拷贝数为10⁰个。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种同时适用PCR、RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的引物组，该引物组的序列如下：

鸭：

YA-F:CCTAGTCCTCAGTCTCGCAT

YA-R:CTTGTAGGACTTCTGGGAATC；

牛：

NIU-F:GATTCAGTGCATCTAACCCT

NIU-R:CCTTGCGGTACTTTCTCTAT；

羊：

YANG-F:GCAGGGTTCATTATCTCTAATAA

YANG-R:GGCTTGTGATTGTGGTGGATAT；

鸡：

JI-F:TACCATGTTCTAACCCATTTGG

JI-R:AGTTCAGGAGTTATGCATGG；

猪：

ZHU-F:CACGCGCATATAAGCAGGTAA

ZHU-R:CAGATTGTGGGCGTATACT。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种同时适用PCR、RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

PCR扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，该方法包括以下的步骤：

1)按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作方法，提取基因组DNA，或者参照分子克

隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或纯水中保存备用；

2)分别采用权利要求1所述的引物组，按照以下的体系配制PCR反应液；

3)PCR反应条件设置如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min，4度保存；

4)反应结束后，取10μL目的PCR扩增产物与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，在紫外灯下观察、拍照；鸭、牛、羊、鸡、猪的扩增片段长度338bp、292bp、349bp、208bp、 324bp。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，该方法包括以下的步骤：

1)按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作方法，提取基因组DNA，或者参照分子克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或纯水中保存备用；

2)分别采用权利要求1所述的引物组，使用TwistAmp^TMBasic试剂盒，按照以下体系配制RPA反应液；

3)反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入1.25μL 280mM的MgAc₂，充分混匀；将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，37℃，保温40min；

4)RPA反应结束后，在0.2mL的eppendorf管内加入100μL的Tris饱和酚，震荡混匀；4℃，12000rpm离心10min；

5)取10μL上清液与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳 15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，紫外灯下观察及拍照；鸭、牛、羊、鸡、猪的扩增片段长度338bp、292bp、349bp、208bp、324bp。

作为优选，所述的步骤3)采用人体体表温度进行RPA反应。

本发明通过分析牛、羊，及市场上牛、羊肉掺假时常使用的鸭、鸡、猪物种的线粒体DNA，设计了鸭、牛、羊、鸡、猪动物源成分PCR和RPA检测引物。PCR检测的最低靶序列拷贝数为10²个拷贝；猪、鸡源特异性引物RPA检测最低靶序列拷贝数为10²个，鸭、羊源特异性引物最低靶序列拷贝数为10¹个，牛源特异性引物最低靶序列拷贝数为10⁰个。本发明确定利用人体体温可以完成动物源检测的RPA扩增反应。

附图说明

图1鸭源成分检测引物的PCR扩增(泳道1～5扩增产物的模板分别对应鸭、牛、羊、鸡和猪的总DNA；M，DNA Marker。下同)

图2牛源成分检测引物的PCR扩增。

图3羊源成分检测引物的PCR扩增。

图4鸡源成分检测引物的PCR扩增。

图5猪源成分检测引物的PCR扩增。

图6鸭源成分检测引物的RPA扩增。

图7牛源成分检测引物的RPA扩增。

图8羊源成分检测引物的RPA扩增。

图9鸡源成分检测引物的RPA扩增。

图10猪源成分检测引物的RPA扩增。

图11 PCR扩增检测鸭源成分检测引物灵敏度(泳道1～8扩增产物的模板分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝的质粒DNA溶液；泳道9为阴性对照；M，DNA Marker。下同)。

图12 RPA扩增检测鸭源成分检测引物灵敏度。

图13 PCR扩增检测牛源成分检测引物灵敏度。

图14 RPA扩增检测牛源成分检测引物灵敏度。

图15 PCR扩增检测羊源成分检测引物灵敏度。

图16 RPA扩增检测羊源成分检测引物灵敏度。

图17 PCR扩增检测鸡源成分检测引物灵敏度。

图18 RPA扩增检测鸡源成分检测引物灵敏度。

图19 PCR扩增检测猪源成分检测引物灵敏度。

图20 RPA扩增检测猪源成分检测引物灵敏度。

图21利用体表温度进行羊源检测引物的RPA扩增(M：DL2000plus DNA marker；1泳道1扩增产物的模板为羊总DNA。)

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

1材料与方法

1.1试验动物

中国荷斯坦牛外周血样品采自浙江省金华市伊康乳业奶牛场核心群，湖羊外周血样品采自湖州怡辉生态农业有限公司湖羊肉用系核心群，Ross鸡血样品采自浙江大学正大肉鸡有限公司购买个体，番鸭基因组DNA由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所家禽育种研究室卢立志研究员惠赠，金华猪基因组DNA由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所家禽育种研究室徐如海副研究员惠赠。

1.2试验试剂

TwistAmp^TMBasic(TwistAmp，英国)

Taq DNA Polymerase(TaKaRa，日本)

蛋白酶K(Amersco，美国)

载体pEASY^TM-T5Zero Cloning Vector(全式金，北京)

XL10-Gold感受态细胞(全式金，北京)

Plasmid DNA Mini Kit(Simgen，杭州)

dNTPs(TaKaRa，日本)

DL2000Plus DNA Marker(全式金，北京)

无水乙醇(杭州常征化学试剂有限公司，杭州)

(试剂配方见附录)

1.3基因组DNA的提取

1.3.1 DNA提取试剂的配制

1M Tris-HCl(pH 8.0)：将121.1g Tris溶于800mL双蒸水中，加浓盐酸调pH至8.0，定容至1000mL,高压灭菌。

0.5M EDTA(pH8.0)：800mL双蒸水中加入186.1g乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)，调节pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。

10％SDS：10g SDS溶于双蒸水中，68℃的温度下使之溶解，定容至100mL，0.2μm的滤膜过滤除菌保存。

0.5M NaCl：5.844g NaCl溶于双蒸水中，定容至200mL，高压灭菌。

TE缓冲液(pH8.0)含20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)：2mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，0.2mL 0.5M EDTA(pH8.0)，加双蒸水定容至100mL，高压灭菌。

蛋白酶K(20mg/mL)：100mg蛋白酶K溶于5mL双蒸水，400μL管分装，－20℃保存。

3M NaAc(pH5.2)：12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50mL，加冰乙酸调节 pH至5.2，高压灭菌。

PBS：8.0g NaCl，0.2g KCl，3.48g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，定容至200mL，高压灭菌。

组织DNA提取液(STE)配方：

Tris饱和酚的配制

试剂：苯酚40g，2-巯基乙醇90μL

0.5M EDTA(pH8.0)90μL

0.5M Tris-HCl(pH8.0)60mL

0.1M Tris-HCl(pH8.0)60mL

取出固体酚，室温放置65℃水浴溶化，切勿立即放入68℃的水浴中，以防玻璃炸裂。

取40g苯酚放入100mL蓝盖瓶中，加入0.04g 8-羟基喹啉，加0.5M Tris-HCl(pH8.0) 至80mL处。

盖上瓶盖后，放入65℃水浴中，使苯酚充分溶解。

搅拌器搅拌10min，使溶液充分混匀。

静置15min，弃去上层的水层。

再向瓶中加入0.5M Tris-HCl(pH8.0)，重复4)5)中的操作。

向瓶中加入0.1M Tris-HCl(pH8.0)，搅拌器搅拌10min，使溶液充分混匀，静置15min 后去水层。

重复上述操作至溶液PH达到7.8以上。

向其中加入约10mL 0.1M Tris-HCl(pH8.0)，然后加入2-巯基乙醇90μL，0.5MEDTA (PH8.0)90μL。混匀。

最后，用铝箔包好瓶口，记录日期，4℃保存。

1.3.2基因组DNA的提取

外周血基因组DNA提取采用酚/氯仿抽提，结合核酸纯化柱吸附法。将EDTA抗凝血液样品解冻、混匀后，吸取0.7mL至已经编号的1.5mL eppendorf管，12000rpm离心10min，吸弃上层液体。

在该eppendorf管内加入500μL PBS(pH7.2)重悬管底沉淀的细胞，并裂解红细胞，充分混匀后，12000rpm离心10min，吸弃上层液体。重复重悬及离心操作，直至重悬后的溶液呈无色或粉红色，12000rpm离心10min，吸弃上层液体，并以200μL超纯水重悬沉淀。

在同一eppendorf管内加入400μL STE和20μL(20mg/mL)的蛋白酶K，充分混匀。55℃振荡水浴3h，直至溶液消化至澄清透明。在经蛋白酶K充分消化的溶液内加入600μL的Tris 饱和酚，轻柔摇动混匀15min，然后12000rpm离心10min。重复本操作一次。

吸取上清液至一新的eppendorf管，加入500μL氯仿，轻柔摇动混匀10min，12000rpm 离心10min。重复本操作一次。

吸取上清液至一新的eppendorf管，加入400μL核酸结合液，充分混匀。若溶液颜色变为无色或粉红色，需向其中加入适量醋酸至溶液颜色变为黄色。

将核酸纯化柱置于2mL的收集管上，将裂解液与核酸结合液加到核酸纯化柱内，13000rpm离心1min。弃收集管内的液体，并将核酸纯化柱重新置于收集管上。

在核酸纯化柱内加入500μL清洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体，并将核酸纯化柱重新置于收集管上。重复本操作一次。

将核酸纯化柱置于新离心管内，室温干燥5min。在核酸纯化柱膜上加200μL的双蒸水 (pH7.0)或Elution buffer(pH8.0)，室温放置2min后，12000rpm离心2min，管底即为纯化好的DNA溶液。

1.4种属特异性的引物设计

鸭(EU009397.1)、牛(NC_006853.1)、羊(AF010406.1)、鸡(NC_001323.1)、猪 (NC_000845.1)线粒体基因组全序列下载自NCBI，经DNAMAN 8.0进行多重比对后，获取种属特异性序列(对应基因见表2-1)，并设计引物，设计原则如下：

1.物种间引物PCR退火温度一致，扩增产物介于200～350bp；

2.具有物种特异性，不会在非本物种模板下发生非特异性扩增；

3.可以在PCR与RPA中通用。

引物交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，如表2-1所示。

表2-1动物源成分检测用引物序列

1.5物种动物源性成分检测用引物目的序列的克隆

1.5.1目的序列的PCR扩增

表2-2动物源性成分检测用引物PCR反应体系

按照表2-2的体系配制PCR反应液。反应条件设置如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min，4度保存。

反应结束后，取10μL目的PCR扩增产物与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min。待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳。EB染色5min，在紫外灯下观察、拍照。

在紫外灯下用干净刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，置于1.5mL灭菌eppendorf管中。加入500μL Binding Buffer(Qiagen，美国)。55℃水浴，间歇摇动eppendorf管，直至胶块完全融化(若溶液变为无色或粉红色，需加入适量醋酸至溶液颜色变为黄色)并将溶胶液放置至室温。

将吸附柱置于一新的收集管上，将上述操作所得的溶胶液转移至吸附柱中，静置1min。12000rpm离心1～2min，弃收集管内废液。在吸附柱中加入500μL Binding Buffer清洗吸附柱，12000rpm离心1～2min，弃收集管内废液。重复该操作。

将核酸纯化柱放于2mL收集管内，最大转速离心3min，弃收集管。将吸附柱放入一个干净的eppendorf管中，室温干燥3min。在吸附柱膜中央加入30μL的灭菌蒸馏水(加热至60℃，洗脱效果更好)，室温静置2min。12000rpm离心2min，离心管底即为纯化后的PCR 扩增产物。

1.5.2目的产物的连接转化

PCR扩增产物经纯化后，按照表2-3所示体系进行连接。

表2-3动物源性成分目的序列PCR产物的连接

连接产物经吸打混匀后，瞬时离心，25℃反应10min。连接反应结束后，将连接产物加入100μL刚刚解冻的感受态细胞中，手指轻弹管壁混匀，于冰上孵育30min。42℃，热激90s，迅速取出置于冰上静置3min。然后向离心管中加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃， 270rpm摇床复苏1h后，将菌液4000rpm离心5min，除去950μL的LB液体培养基。重旋菌体后，将剩余菌液均匀地涂布于含有Amp(100μg/mL)的LB固体培养基上，待液体被完全吸收后，于37℃恒温培养箱中倒扣平板，培养10～14h，直至出现单菌落。

1.5.3转化产物的筛选及测序

取干净无菌的1.5mL eppendorf管，管中加入500μL含有Amp(100μg/mL)的LB液体培养基，用镊子夹取灭菌10μL小枪头挑取平板上的单菌落，置于eppendorf管中。将eppendorf 管置于摇床上，37℃，270rpm培养10～14h，至培养基浑浊。

在0.2mL的PCR反应管内配制25μL反应体系。具体成分如表2-4。

PCR反应结束后，取5μL目的PCR扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶电泳，200V电泳10min。待溴酚蓝移至凝胶下1/2处时结束电泳。EB染色5min，在紫外灯下观察、拍照。选择PCR扩增结果条带单一、明亮，且与表2-1标注大小对应的单克隆菌液，吸取100μL菌液置一灭菌后1.5mL的eppendorf管中，交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

表2-4动物源成分目的序列转化产物检测时的PCR反应体系

1.5.4阳性克隆质粒DNA的提取

使用质粒DNA小量提取试剂盒(杭州新捷生物科技有限公司，杭州)。取1～5mL过夜培养的菌液12000rpm离心30s，吸弃液体培养基，收集的菌体以250μL的Buffer I(加入RNase A)重悬，至呈均一的悬浊液。

加入250μL Buffer II，温和并充分地翻转离心管4～6次，至溶液呈粘稠的半透明状。

向管中加入350μL Buffer III，温和并充分地翻转离心管，直至上层淡蓝色溶液全部消失，形成淡黄色的絮状沉淀。13000rpm离心10min。

将上清液加入已经装入收集管的核酸纯化柱，盖上核酸纯化柱管盖，12000rpm离心30s。弃收集管内的滤液。

将核酸纯化柱放回收集管内，在核酸纯化柱中加入500μL Buffer W1，盖上核酸纯化柱管盖，12000rpm离心30s。弃收集管内的滤液。

将核酸纯化柱放回收集管内，最大转速离心1min。弃收集管。

将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL eppendorf管中，在纯化柱膜中央加入50μL洗脱液，盖上核酸纯化柱管盖，室温静置1min，12000rpm离心30s，弃纯化柱。1.5mLeppendorf管内为纯化好的质粒DNA。

以紫外分光光度计测出质粒DNA的OD₂₆₀值，按照公式OD260:1OD＝50μg/mL dsDNA，及鸭、牛、羊、鸡、猪各物种扩增片段对应的重组质粒的分子量计算质粒DNA的拷贝数。

获得的不同拷贝数的质粒DNA溶液于-20℃冻存备用。

1.6 5种动物源成分检测用引物的RPA扩增

经PCR、克隆转化验后的引物进行RPA扩增。使用TwistAmp^TMBasic(TwistAmp，英国)试剂盒，按照表2-5的体系配制RPA反应液。反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入1.25μL 280mM的MgAc₂，充分混匀。将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，37℃，保温40min。

RPA反应结束后，在0.2mL的eppendorf管内加入100μL的Tris饱和酚，震荡混匀。4℃， 12000rpm离心10min。

取10μL上清液与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min。待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳。EB染色5min，紫外灯下观察及拍照。

表2-5动物源成分检测用引物RPA反应体系

1.7 5种动物源成分检测引物的最低检测拷贝数

1.5.4获得的质粒DNA溶液按照拷贝数十倍稀释法进行稀释，获得10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹和10⁰质粒拷贝数/μL的DNA溶液。

按照1.5.3所示的PCR反应体系，和1.6中所示的RPA反应体系进行扩增，扩增时设置阴性对照(以同体积的ddH₂O代替DNA溶液)。反应结束后，取10μL扩增产物(RPA产物须经纯化后)与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳10min。待溴酚蓝移至凝胶下1/2处时结束电泳。EB染色5min，在紫外灯下观察、拍照，根据扩增条带的有无确定引物的最低检测拷贝数。

1.8用人体体表温度进行RPA反应

由于RPA的反应温度为37℃，探索利用人体体温进行RPA检测动物源成分的可能。以 2ng/μL湖羊基因组DNA为模板，按1.6中所示的RPA反应体系配制反应液。反应液配制完毕后，用胶布将0.2mL eppendorf管粘于试验者的腹部，利用人的体温进行RPA反应，反应时间1h。反应结束后，按照1.6的方式进行检测。

2结果与分析

2.1 5种动物源成分检测引物的筛选

按照1.4的原则设计、合成5个物种的动物源成分检测用引物，并以这5个物种的基因组DNA溶液作为模板进行PCR扩增，反应结果如图1～图5所示。扩增产物仅在目的检测物种中出现扩增条带，产物大小与表2-1一致，条带单一、明亮，具有很好的物种特异性。

获得物种特异性动物源PCR检测引物后，在RPA体系中进行扩增，确定该引物能否用于RPA扩增体系。由于RPA没有PCR过程中变性、退火的步骤，因此RPA扩增产物可能会以串联的方式存在于扩增体系内，表现为存在扩增产物及其2倍，甚至3倍长度的扩增产物。这样的产物可视为单一产物。对以上5对引物的RPA检测结果显示(图6～图10)，扩增产物仅在目的检测物种中出现扩增条带，产物大小与表2-1一致，有时会同时出现其2倍，甚至3倍长度的产物。条带明亮，具有很好的物种特异性。

2.2引物进行PCR与RPA扩增的灵敏度

以10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝的质粒对各动物源成分检测引物进行灵敏度分析，并设置以等体积双蒸水代替质粒DNA模板的阴性对照。反应结束后，取10μL 扩增产物(RPA产物须经纯化后)与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳10min。经EB染色后，根据紫外灯下扩增条带的有无确定引物的最低检测拷贝数。

鸭源成分检测引物进行PCR扩增时，模板浓度为10¹个拷贝数时，扩增条带极其微弱或无可见扩增条带(图11)；进行RPA扩增时，当模板浓度为10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图12)。

牛源成分检测引物进行PCR扩增时，模板浓度为10²个拷贝数时，扩增条带极其微弱，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图13)；进行RPA扩增时，当模板浓度低至10⁰个拷贝数时，仍有可见扩增条带(图14)。

羊源成分检测引物进行PCR扩增时，模板浓度为10²个拷贝数时，扩增条带极其微弱，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图15)；进行RPA扩增时，当模板浓度低至10¹个拷贝数时，仍有微弱扩增条带，模板浓度为10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图16)。

鸡源成分检测引物进行PCR扩增时，模板浓度为10²个拷贝数时，扩增条带极其微弱，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图17)；进行RPA扩增时，模板浓度为10²个拷贝数时，扩增条带极其微弱，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带 (图18)。

猪源成分检测引物进行PCR扩增时，模板浓度为10³、10²个拷贝数时，扩增条带极其微弱，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图19)；进行RPA扩增时，当模板浓度低至10²个拷贝数时，仍有微弱扩增条带，模板浓度为10¹和10⁰个拷贝数时，无可见扩增条带(图20)。

5种动物源成分检测引物灵敏度试验显示，PCR反应中各物种引物灵敏度均可达到10²个的水平；在RPA中猪、鸡源特异性引物检测灵敏度为10²个，鸭、羊源特异性引物检测灵敏度为10¹个，牛源特异性引物检测灵敏度可达到10⁰个。从以上结果可知，除了鸡、猪源成分检测引物RPA的检测灵敏度与PCR的检测水平相同外，另外3种动物源成分检测引物均优于PCR的检测灵敏度。

2.3用人体体表温度进行RPA反应

选取羊特异性引物，以羊肉基因组DNA为模板，在0.2mL eppendorf管中混匀RPA反应体系后，将eppendorf管粘于试验者的腹部，反应1h后，经Tris饱和酚提取进行琼脂糖凝胶电泳，产生了大小为349bp羊的目的片段(图21)。试验结果表明，可以利用人体体表温度可以进行RPA反应。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> PCR和RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctagtcctc agtctcgcat 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgtaggac ttctgggaat c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gattcagtgc atctaaccct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttgcggta ctttctctat 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagggttca ttatctctaa taa 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcttgtgat tgtggtggat at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taccatgttc taacccattt gg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agttcaggag ttatgcatgg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacgcgcata taagcaggta a 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagattgtgg gcgtatact 19

Claims

1.一种同时适用PCR、RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的引物组，该引物组的序列如下：

鸭：

YA-F:CCTAGTCCTCAGTCTCGCAT

YA-R:CTTGTAGGACTTCTGGGAATC；

牛：

NIU-F:GATTCAGTGCATCTAACCCT

NIU-R:CCTTGCGGTACTTTCTCTAT；

羊：

YANG-F:GCAGGGTTCATTATCTCTAATAA

YANG-R:GGCTTGTGATTGTGGTGGATAT；

鸡：

JI-F:TACCATGTTCTAACCCATTTGG

JI-R:AGTTCAGGAGTTATGCATGG；

猪：

ZHU-F:CACGCGCATATAAGCAGGTAA

ZHU-R:CAGATTGTGGGCGTATACT。

2.一种同时适用PCR、RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.PCR扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

4)反应结束后，取10μL目的PCR扩增产物与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，在紫外灯下观察、拍照；鸭、牛、羊、鸡、猪的扩增片段长度338bp、292bp、349bp、208bp、324bp。

4.RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

2)分别采用权利要求1所述的引物组，使用TwistAmpTMBasic试剂盒，按照以下体系配制RPA反应液；

5)取10μL上清液与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，紫外灯下观察及拍照；鸭、牛、羊、鸡、猪的扩增片段长度338bp、292bp、349bp、208bp、324bp。

5.根据权利要求4所述的RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法，其特征在于步骤3)采用人体体表温度进行RPA反应。