CN111088367A - 鸭源性il-2基因dna标准物质及其用途 - Google Patents

鸭源性il-2基因dna标准物质及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物分析领域。本发明通过对鸭源性IL‑2基因DNA鉴定方法的建立和基因组DNA的制备获得标准物质。本标准物质均匀性良好，在4℃保存可稳定14天，需冷链运输，可冻融10次。在‑20±2℃下可稳定保存达到6个月，特性量值为基因组DNA拷贝数，标准物质认定结果用标准值±扩展不确定度的方式依次表示为：（5.78±0.51）×103 copies/μL。本标准物质每管100μL，使用时取样量为2μL，可用于鸭源性核酸成分的定性和定量检测，还可用于PCR仪的校准、DNA定量方法的验证和实验室质量控制等领域。

Description

鸭源性IL-2基因DNA标准物质及其用途
技术领域
本发明涉及生物分析领域，尤其涉及鸭源性IL-2基因DNA标准物质及其用途。
背景技术
肉和肉制品是人类生活的重要营养来源，随着人们生活水平的提高，对其需求量也越来 越大。但近几年来，国内外一些不法分子在经济利益的驱使下大肆掺杂使假，将相对廉价的 鸡鸭等肉类经深加工后冒充牛羊肉进行销售，不仅侵犯了消费者的合法权益，也严重损害了 本国的国际声誉。因此，肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。然而，由于 动物源性基因组DNA标准物质在国内外仍没有系统的研制单位，使得监管和检测都缺乏依据。 近年来，市场上出现以鸭肉冒充牛羊肉掺假的现象较为普遍。
肉和肉制品是人类生活的重要营养来源。近年来，在经济利益的驱使下，我国一些不法 分子为牟取暴利，大肆掺杂使假，将相对廉价的鸡鸭等肉类经深加工后冒充牛羊肉进行销售， 不仅侵犯了消费者的合法权益，而且严重损害了我国出口牛羊产品的国际声誉。在欧盟国家， 马肉的价格约为牛肉的三分之一，有些供应商就以马肉充当牛肉来获得更高利润。2013年1 月欧盟爆发的“马肉风波”将多个欧洲国家卷入丑闻中，引起涉事国家的轩然大波，引发消 费者反感。因此，肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。因此建立准确、可 靠的肉类鉴别方法具有重要的经济价值和深远的社会意义。但目前由于在监管和检测体系中 缺乏动物源性标准物质，使得监管检测的结果缺乏量值的溯源性。
物种鉴别的传统方法主要包括解剖学、组织学、感官判断、化学方法、电泳法、色谱法 和免疫学等方法。在传统的鉴别方法中：由于动物生理结构及组份的相似性，解剖学、组织 学和感官判断等方法具有较大的局限性；化学法既费时又费力，而且很难检测微量样品；色 谱法样品处理环节多，对硬件和软件均具有较高的要求；所以电泳法和免疫学方法的应用最 为广泛。即便如此，在电泳法中，由于蛋白的上样量、样品的新鲜程度、动物的年龄和性别、 剩余血量、热处理的程度和染色技术均会影响蛋白的电泳速度，灵敏度低和可重复性差成为 限制该技术用于检测肉类物种的最大障碍。而免疫学检测技术的核心在于抗原和抗体两个层 面：(1)热处理后蛋白质发生变性，引起抗原决定簇的改变和蛋白溶解度的降低，常导致交 叉反应和检测灵敏度的降低。(2)免疫学方法的成功与否依赖于所用抗体的质量，而双抗体 夹心法需要两个匹配的抗原决定簇，这对抗体的特异性和灵敏性提出了更高的要求。因此， 免疫学检测方法存在特异性较低、受样品基质影响大、易产生假阳性结果的局限。综上，这 些传统鉴别方法都有一定的局限性。
随着分子生物学技术的发展，核酸水平的检测逐渐得到广泛认可。核酸具有遗传信息丰 富、理化性质稳定(热稳定性与酸碱稳定性均优于蛋白质)、体内广泛存在等优点，将动物 种属间的差异遗传信息作为物种鉴别的检测靶点，再结合具有强特异性、高灵敏度、操作简 单快速和低成本等优点的PCR技术，以DNA检测为基础的肉类及肉制品物种鉴别技术具有特 异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，其检测精度可达属与亚属水平，已成为 食品中动物源性真实性鉴别与溯源性分析技术的主流方法。但目前，动物源的核酸检测，由 于缺乏可用的标准物质，使得检测缺乏重复性、可比性和溯源性。
近年来，我国的动物源性检测技术方法和标准化工作进展迅速，制订了一系列动物源性 产品检测技术标准，而动物源性标准物质在动物产品造假检测、安全监管、定性与定量检测、 检测方法建立与标准化过程中是不可或缺的物质基础。同时我国肉类进口近几年来逐年增 加，2018年进口总量达到421.7万吨。而由于相应标准物质的缺乏，对于产品的身份验证、 进出口检验、企业自控和国际贸易互认带来了一定的影响。应用可靠的标准物质是得到高质 量分析测定数据的保证。建立动物源性标准物质研制与生产技术平台是我国动物食品安全监 管的基本要求。为了对动物源性产品进行有效的安全监管，原则上，每种动物源性都必须研 制对应的标准物质，保障动物产品的检测、监测和溯源。
但现阶段，国内外动物源性标准物质缺乏已经严重影响动物源性检测技术的标准化和已 有标准的采用。我们查阅了COMAR库、欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所 (Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)、美国石油化学家学会 (American Oil Chemists’Society，AOCS)等著名的标准物质相关国际组织与机构以及 国内的标准物质网等，都未查到有证的动物源性基因组DNA标准物质
发明内容
为此，本发明进行了鸭源性IL-2基因DNA标准物质的研发和制备，可有效提高动物源 性产品检测结果的可比性、有效性和溯源性，实现动物源性产品成分分析中的量值传递。本 发明通过对鸭源性IL-2基因DNA鉴定方法的建立和基因组DNA的制备获得标准物质。经均 匀性检验和稳定性检验结果表明，本发明标准物质的均匀性良好，在4℃保存可稳定14天， 需冷链运输，可冻融10次。在-20℃下可稳定保存达到6个月。本发明标准物质的特性量值 为基因组DNA拷贝数，标准物质认定结果用标准值±扩展不确定度的方式依次表示为：(5.78 ±0.51)×103copies/μL。本发明标准物质每管100μL，使用时取样量为2μL，可用于鸭 源性的定性和定量检测，还可用于PCR仪的校准、DNA定量方法的验证和实验室质量控制等 领域。
本发明的一个目的是提供一种鸭源性IL-2基因DNA标准物质，其中含有鸭源性基因组 DNA，基因拷贝数为5.78×103拷贝/μl，扩展不确定度为0.51×103拷贝/μl，-20±2℃可 稳定保存6个月以上，冻融10次仍可保持稳定，且产品均匀度良好，符合标准物质的要求。
本发明的另一目的是提供鸭源性IL-2基因DNA标准物质，所述鸭源性IL-2基因DNA标 准物质可以为初始的浓度或为多个浓度梯度稀释的形式。
本发明的另一目的是提供上述DNA标准物质的制备方法，包括如下步骤：鸭肉前处理； 基因组DNA提取、质量鉴定；分装保存；均匀性评估、稳定性评估、定值及不确定度评估，从而得到所述标准物质。进一步地，其中鸭肉前处理是对鸭腿肉进行匀浆；得到的匀浆液用于提取基因组DNA；采用动物组织大提试剂盒进行基因组DNA提取。进一步地，其中动物组织大提试剂盒采用杭州新景生物试剂开发有限公司的动物组织大提试剂盒，具体步骤如下：
1)将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL 56℃预热的Buffer AT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来；
2)将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；
3)加入2mL Buffer SL，旋涡振荡15秒；将离心管置于70℃水浴15min；
4)加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀；
5)将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min；
6)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，在核酸纯化柱中加 入5mL Buffer WB，盖上盖子，≥4500rpm离心2min；
7)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，最高速离心5min；
8)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置于另外一个洁净的50mL离心管中，放入 56℃恒温培养箱中静置10min；
9)在核酸纯化柱中央加1-2mL 56℃温育的Buffer TE，盖上盖子，56℃温育恒温培养 箱中静置5min，≥4500rpm离心2min；
10)弃纯化柱，洗脱DNA。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，其中含有所述的鸭源性IL-2基因DNA标准物质。 进一步地，其中还含有选自针对IL-2基因、COX3基因、16SrRNA基因或Cytb基因的引物和 探针，优选选自表2-1的九种引物和探针组合之一。进一步地，其中还含有检测鸭IL-2基 因的引物和/或探针，优选的引物和探针组合如下：
Figure BDA0002345597020000021
Figure BDA0002345597020000031
本发明的另一个目的是提供所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质作为阳性质控物的用途。
本发明的另一个目的是提供所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质在定性和/或定量鸭源性 核酸成分中的用途，或用于DNA定量方法的验证的用途，或用于实验室质量控制的用途。
本发明的另一个目的是提供一种定性和/或定量检测待检测样品中鸭源性核酸成分的方 法，包括如下步骤：将鸭腿肉提取DNA后进行梯度稀释，建立标准曲线；将鸭源性IL-2基 因DNA标准物质作为阳性质控物，提取待检测样品中的DNA作为样本，进行实时荧光定量PCR 检测，根据检测结果结合标准曲线判断是否存在鸭源性核酸成分以及所含拷贝数。
本发明的另一个目的是提供一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，包括如下步骤：配制 未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；将鸭源性 IL-2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r。
本发明的另一个目的是提供所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质用于DNA定量方法的验证 的用途。
本发明的另一个目的是提供所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质用于实验室质量控制的用 途。
在上述任一用途或方法中，进一步地，其中使用的PCR反应条件如下：PCR反应程序如 下：95℃变性5min；然后95℃变性10s，58℃退火延伸32s，40个循环；PCR反应体 系如下：
试剂 终浓度 体积
TaqMan反应液 1× 12.5μL
10μmol/L正向引物 0.8μmol/L 2.0μL
10μmol/L反向引物 0.8mol/L 2.0μL
10μmol/L探针 0.2μmol/L 0.5μL
DNA模板 / 2.0μL
无菌水 / 6.0μL
总体积 / 25.0μL
本发明的有益效果如下：
本标准物质的特性量值为八家实验室采用数字PCR联合定值的鸭源性基因组DNA拷贝 数。鸭源性IL-2基因DNA标准物质的拷贝数为5.78×103copies/μL，扩展不确定度为0.51 ×103copies/μL。通过数字PCR检测标准物质的均匀性和稳定性，结果表明标准物质的均匀 性和稳定性良好，在-20±2℃条件下可以稳定保存6个月以上，本实验室将标准物质保存在 -20℃。
本标准物质目标基因为细胞核基因组中的IL-2基因，同时也适用于检测细胞色素c氧 化酶亚基3基因(COX3)，涉及标准：《在食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第五部分： 鸭成分检测PCR法》(SN/T 3731.5-2013)、《动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法》(DB 22/T 2049-2014)、《肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR检测方法(深圳市)》(SZDB/Z258-2017)；适合检测16S rRNA基因，涉及标准：《饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法(SN/T 2727-2-10)》；适合检测Cytb基因，涉及标准：《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR方法》(SN/T报批稿)。
本发明鸭源性IL-2基因DNA标准物质的使用将有效地解决我国动物源性实验室间检测 结果不可比的问题，为我国动物源性产品的检测、监测提供技术保障。
附图说明
图1IL-2基因序列及引物/探针设计位置图。第1和3个框区域是引物序列，第2个框区域是探针序列。
图2IL-2核基因引物/探针序列荧光定量扩增曲线。
图3荧光定量PCR扩增曲线分析。
图4种间特异性实时荧光定量扩增曲线分析。
图5种内特异性荧光定量扩增曲线分析。
图6不同鸭品种中IL-2基因(部分)的序列比对图。
图7NCBI数据库中鸭科动物IL-2基因mRNA序列比较。画框部分为引物序列。
图8.NCBI数据库中绿头鸭IL-2基因组序列(AY821656和AY707747)比较图(部分)。画框部分为引物和探针序列。
图9鸭源性基因组DNA实时荧光定量PCR方法灵敏度分析。
图10鸭源性基因组DNA IL-2核基因实时荧光定量PCR方法扩增曲线。
图11鸭源性基因组DNA IL-2核基因实时荧光定量PCR方法标准曲线。
图12数字PCR引物探针浓度优化PCR扩增热图。
图13数字PCR退火温度优化PCR扩增热图。
图14鸭源性基因组DNA/IL-2核基因数字PCR特异性检测扩增热图。其中B图中1：金定 麻鸭 2：攸县麻鸭 3：高邮麻鸭 4：绍兴鸭 5：北京鸭 6：山麻鸭 7：马太湖鸭 8：缙云麻鸭 9：攸县鸭 10：绿头鸭 11：斑嘴鸭 12：媒鸭 13：湖州群大老鸭 14：樱桃鸭 15：H2O。
图15数字PCR的线性范围测试，X轴表示DNA溶液的预期拷贝数浓度，Y轴表示通过数 字PCR测量出的拷贝数浓度。
图16IL-2核基因引物/探针的质谱图和扩增效率检测图。
图17鸭源性成分基因组DNA标准物质制备技术路线。
图18基因组DNA电泳图谱。1，1.0μL基因组DNA；2，2.0μL基因组DNA。
图19鸭源性基因组DNA标准物质标准曲线。A：标准曲线 B：扩增曲线
图20本发明标准物质用于具体检测及定量检测结果。
图21鸭成分检测PCR法(SN/T 3731.5-2013)扩增图谱。A：DB22/T2049-2014；B：ddH20；C：SN/T 3731.5-2013；D：ddH20
图22：SN/T 2727-2010标准扩增曲线。
图23：SZDB/Z 258-2017标准扩增曲线。
图24：常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR方法标准扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细描述本发明，不能将其解释为限制本发明的范围。
实施例1发明研究的范围
本发明收集了北京鸭、绍兴鸭、樱桃鸭、湖州群大老鸭、绿头鸭、媒鸭、斑嘴鸭、攸县麻鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、马太湖鸭、金定麻鸭、攸县鸭、高邮麻鸭等十四个我国主要鸭子 品种，采用细胞核基因组DNA中的白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)为靶基因，进行了 方法的建立。IL-2是淋巴细胞受抗原刺激后所分泌的具有免疫调节作用的细胞因子，对机体 的免疫应答和抗病毒感染等具有重要作用，且为单拷贝基因。不同种属的IL-2具有其种属特异性的序列，通过对不同鸭品种IL-2基因的序列比对，我们发现所有收集的鸭中都存在此特 异性序列，且该特征性序列在鸭亚科内具有共性，基因序列如图1。
鸭肉由于其相对的廉价性，目前以作为造假者使用的主要掺假肉类。但由于市场缺乏鸭 源性成分的标准物质，使得监测检测结果缺乏可比性和溯源性。通过对鸭源性IL-2基因DNA 标准物质的研制，将建立起鸭源性基因组DNA标准物质制备、定量检测、质量控制和量值溯 源技术平台，形成一套完整的、标准化的动物源性基因组标准物质制备技术体系，为肉制品 的安全监管提供有证标准物质，在各实验室间实现数据可比和量值统一，为我国肉制品的检 测和安全评价提供技术、信息和标准物质服务。同时鸭源性IL-2基因DNA标准物质可用于 校准分子生物学相关仪器设备、评价动物源性分析方法等领域，其研制和制备平台的建设， 将为我国动物源性系列标准物质的开发储备技术基础。
实施例2.鸭源性成分检测方法
DNA具有遗传信息丰富、理化性质稳定(热稳定性与酸碱稳定性均优于蛋白质)、体内广 泛存在等优点，以DNA为基础的PCR方法检测肉类及肉制品物种鉴别技术具有特异性高、方 法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，其检测精度可达属与亚属水平，已成为食品中动物 源性成分鉴别与分析技术的主流方法。目前，依据PCR反应的平台不同，定量检测可分为实 时荧光定量PCR和数字PCR。实时荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反 应，数字PCR是在数字PCR平台上进行PCR扩增反应。
在本发明中，采用实时荧光定量PCR和数字PCR进行了引物/探针的筛选、反应条件的 优化，采用数字PCR对鸭源性成分基因组DNA标准物质的均匀性、稳定性和拷贝数进行了准 确测量。
2.1鸭源性成分特异性检测引物/探针筛选
通过文献及相关标准检索到8组引物/探针和自行设计一组引物/探针(表2-1)，经实时 荧光定量PCR测试筛选其在种间特异性表现，仅白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)引物 /探针具有良好的特异性，仅能扩增出鸭源性基因组DNA，而在其他物种中均未有扩增(表2-2、 图2)。
在PCR模板的选择上，我们对线粒体DNA和细胞核基因组DNA进行了比较研究。用于肉 类成分鉴别的PCR方法通常选用线粒体DNA或细胞核基因组DNA作为PCR的模板。动物线粒 体DNA的特点在于：一个细胞中含多个线粒体DNA，且组织不同，线粒体的拷贝数不同，如心肌细胞和肝细胞中线粒体数量要远多于皮肤细胞中的线粒体数量；线粒体DNA是裸露的环 状DNA双链分子，基因组通常较小，为15-20kb；线粒体DNA不含非编码区域；线粒体DNA进化速度较快并遵循一定规律，因此被广泛应用于进化遗传学的研究中。而细胞核基因组DNA 的特点在于其高度的保守性和一致性：除极特殊的细胞种类会发生基因组DNA部分重排外， 体细胞的序列具有高度保守性；细胞核基因组DNA突变率低；在同一物种的不同细胞中的细 胞核基因组DNA的拷贝数基本一致，利于进行DNA的定量。因此，相较于线粒体DNA，细胞 核基因组DNA具有不受组织来源、拷贝数和进化速率影响的优势，是动物源性成分鉴别体系 中模板及标准物质的最佳选择。
表2-1鸭源性基因组DNA标准物质研制过程中使用的引物和探针序列
Figure BDA0002345597020000051
Figure BDA0002345597020000061
表2-2 IL-2核基因引物/探针序列种间特异性扩增荧光定量Ct值
种类 Ct值 种类 Ct值
鸭 25.14 狐狸 N/A
牛 N/A 小鼠 N/A
羊 N/A 马 N/A
鸡 N/A 鹿 N/A
猪 N/A 狗 N/A
2.2实时荧光定量PCR方法确认
2.2.1引物/探针浓度优化实验
通过IL-2引物/探针几种浓度配比进行实时荧光定量PCR，优化反应体系中引物/探针的 终浓度，设置了引物/探针浓度的不同组合(表2-3)。对反应效率进行考察后确定了本发明 后续测试引物终浓度为0.8μmol/L，探针终浓度为0.2μmol/L(图3)。在CFX96荧光PCR 仪(Bio-rad，Hercules，CA，USA)上进行PCR扩增，PCR反应程序如下：95℃变性5min； 40个循环(95℃变性10s，58℃退火延伸32s)。最终确认鸭源性基因组DNA定量PCR 扩增体系(表2-4)。
表2-3引物和探针浓度组合
引物终浓度 探针终浓度 引物探针质量 来源 Ct值
0.8μmol/L 0.2μmol/L 4∶1 本发明 25.52
0.15μmol/L 0.05μmol/L 3∶1 本发明 26.77
0.2μmol/L 0.1μmol/L 2∶1 本发明 28.75
0.4μmol/L 0.2μmol/L 2∶1 本发明 26.12
表2-4鸭源性基因组DNA定量PCR扩增体系
Figure BDA0002345597020000062
Figure BDA0002345597020000071
2.2.2荧光定量PCR方法特异性、灵敏度
2.2.2.1种间特异性
通过对牛、羊、鸡、鸭、猪、狐狸、小鼠、马、鹿、狗以及近缘物种鸽子、鹌鹑、鹅的 实时荧光定量PCR测试种间特异性。测试结果表明：只有IL-2核基因在鸭源性基因组DNA 中有典型扩增曲线(表2-5、图4)。
表2-5种间特异性实时荧光定量PCR Ct值
Figure BDA0002345597020000072
2.2.2.2种内非特异性
通过对不同品种鸭源性基因组DNA进行实时荧光定量PCR测试种内特异性。测试结果表 明：IL-2核基因在不同鸭品种基因组DNA中都有典型扩增曲线(表2-6、图5)。同时，对不同鸭子品种的PCR产物进行了测序比对(如图6)，有比对结果可知，14个品种间的扩增 序列完全一致，具有高度保守性，符合预期。
表2-6种内特异性荧光定量Ct值
鸭子品种 Ct值 鸭子品种 Ct值
斑嘴鸭 25.46 金定麻鸭 25.46
媒鸭 25.53 攸县鸭 25.48
绿头鸭 25.36 攸县麻鸭 25.61
湖州群大老鸭 25.42 绍兴鸭 25.26
樱桃鸭 25.45 高邮麻鸭 25.41
山麻鸭 25.53 缙云麻鸭 25.56
马太湖鸭 25.55 北京鸭 25.23
以“duck interleukin-2”为关键词，在NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中共可以检索到15条鸭科动物的IL-2mRNA序列，对这15条IL-2基因进行多序列比对，结果 发现，除近缘种(鸿雁、斑头雁、白额雁)外(图7)，其他鸭科物种IL-2基因呈现高度保守 性，且引物：IL-2-F：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’和 IL-2-R：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’在这些物种中高度保守(图7)，其中IL-2-F位 于第一个外显子中，而IL-2-R位于第二个外显子中。
JX239770、AY392557为Anser cygnoides(鸿雁)，JX239766为Anser indicus(斑头雁)，.JX239769为Anser albifrons(白额雁)，KX943297为Anatidae sp，Sansui SheldrakeDuck(三穗鸭)，JX239768为Anas poecilorhyncha(斑嘴鸭)，AY193713、DQ666278为Cairinamoschata(疣鼻栖鸭)，AF294323、AF294322、NM_001310373、AY173028、AY232490、JX239765、HQ008784为Anas platyrhynchos(绿头鸭)。
由于脊椎动物IL-2基因含4个外显子和3个内含子，而探针序列横跨第1个外显子和 第1个内含子，以“duck interleukin-2gene”为关键词，在NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中仅可检索到2条绿头鸭的IL-2基因序列，序列比对 结果显示两者高度相似(图8)。基于IL-2mRNA序列的高度保守性，我们推测该探针序列在 鸭中也存在高度保守性，而种内特异性实验也证明了我们的推测是正确的。
2.2.2.3灵敏度
将鸭肉基因组DNA进行梯度稀释，浓度分别为13930、6965、2786、557、112、23、11、6和3copies，考察定量检测方法的灵敏度。发现当DNA模板量低至3copies时，无典型扩 增曲线；而模板量为6copies时，产生典型的扩增曲线，因此定量PCR反应的检测灵敏度约 为6个拷贝的DNA分子(图9)。
2.2.3实时荧光定量PCR方法的标准曲线
实时荧光定量PCR扩增产物在初期呈指数增长，经过一定循环次数扩增后，由于反应底 物的消耗，进入平台期。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别。定量检 测一般在PCR扩增的指数期进行，将荧光信号超过一定阈值的反应循环数定义为Ct(cycle threshold)值，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数 越多，Ct值越小。利用每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系的原理， 以已知起始拷贝数的标准品绘制标准曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标 代表Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可根据标准曲线，计算出该样品中鸭源性成 分基因组DNA的量(总基因组DNA的量)。
将鸭源性基因组DNA浓度进行梯度稀释，用梯度稀释的DNA溶液做标准品，绘制标准曲 线，考察鸭肉基因组DNA定量检测方法的各项技术参数。扩增曲线及绘制的标准曲线如图10 和11所示。
鸭源性基因组DNA标准曲线的决定系数R2值为0.995，大于0.98；鸭源性基因组DNA标 准曲线的斜率为-3.434，在-3.6～-3.1之间；鸭源性基因组DNA定量方法的扩增效率为95.5％，在90％～110％之间。每个梯度样品重复间Ct值的RSD值均小于25％。
2.3数字PCR方法建立及确认
数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术，与传统定量PCR技术不同的是， 数字PCR是一种不依赖于标准物质和标准曲线的DNA拷贝数绝对定量技术。数字PCR不根据 扩增曲线的循环阈值(Ct值)进行定量，因此不受扩增效率的影响，具有很好的准确度和重 现性，可以实现绝对定量分析。迄今为止Fludigym、Bio-rad、ABI等几家公司相继推出了 数字PCR产品，这些产品已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨 大的技术优势和应用前景。在标准物质制备方面，数字PCR已成功用于白血病诊断质粒DNA 标准物质(ERM-AD623a-ERM-AD623f)和乳腺癌诊断基因组DNA标准物质(SRM2373)的定 值，并得到了可靠的定值结果。
微滴式数字PCR是对样品进行微滴化处理，在微滴生成器中将含有核酸分子的反应体系 形成成千上万个纳升级的油包水微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个 至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微 滴分析仪(droplet reader)对油包水微滴逐个进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有 荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件QuantaSoft 可计算给出待检靶分子的拷贝数浓度。微滴数字PCR反应包括配制体系、生成微滴、扩增循 环和信号读取4个步骤。
2.3.1微滴数字PCR反应体系优化
微滴数字PCR应用的引物/探针序列同实时荧光定量PCR，序列见表2-1。在微滴生成卡 中加入20μL PCR体系和70μL微滴生成油生成微滴，将生成的微滴转移到PCR管中进行PCR 扩增反应。通过IL-2引物/探针几种浓度配比进行数字PCR，优化反应体系中引物/探针的终 浓度，设置了引物/探针浓度的不同组合(表2-7)。经考察，当引物探针质量比为2∶1，其 终浓度分别为0.5μmol/L和0.25μmol/L，没有明显的下雨现象(图12)，确定了本发明数字PCR后续测试引物探针浓度。PCR反应程序中退火温度的高低对微滴下雨现象有显著的影响，在反应程序的退火环节，设置了温度梯度。根据PCR反应的热图，鸭源性基因组DNA在 不同的退火温度下，微滴的荧光强度存在较显著差异(图13)。比较不同退火温度的数字PCR扩增热图，发现在退火温度为60℃时，没有明显的下雨现象，确定数字PCR的最佳退火温 度60℃。
表2-7引物和探针浓度组合
引物终浓度 探针终浓度 引物探针质量 来源
0.2μmol/L 0.1μmol/L 2∶1 本发明
0.5μmol/L 0.25μmol/L 2∶1 本发明
0.8μmol/L 0.2μmol/L 4∶1 本发明
0.15μmol/L 0.05μmol/L 3∶1 本发明
因此，经优化后，微滴数字PCR体系为20μL，包含10μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L正向引物和反向引物各1.0μL、探针0.5μL，DNA模板2μL。微滴式数字PCR反应 程序为95℃变性10min；40个循环(94℃变性15s，60.0℃退火延伸1min)；98℃ 变性10min；4℃保存。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软 件QuantaSoft Version1.6.6.0320分析实验数据，获得绝对定量结果。
2.3.2数字PCR的特异性检测
为考察鸭源性基因组DNA/IL-2基因数字PCR种间特异性，分别以绍兴鸭、牛、羊、鸡、 猪、狐狸基因组DNA和ddH2O(空白对照)为模板，进行数字PCR扩增。只有绍兴鸭基因组DNA/IL-2基因有阳性微滴，其他模板扩增结果为阴性。扩增结果显示，绍兴鸭基因组DNA/IL-2 基因数字PCR系统具有良好的种间扩增特异性(图14A)。
为考察鸭源性基因组DNA/IL-2基因数字PCR种内非特异性，分别金定麻鸭、攸县麻鸭、 高邮麻鸭、绍兴鸭、北京鸭、山麻鸭、马太湖鸭、缙云麻鸭、攸县鸭、绿头鸭、斑嘴鸭、 媒鸭、湖州群大老鸭、樱桃鸭基因组DNA和ddH2O(空白对照)为模板，进行数字PCR扩 增。ddH2O为模板时，无阳性微滴；其他模板扩增结果均为阳性。扩增结果显示，鸭源性基 因组DNA/IL-2基因数字PCR系统具有良好的种内扩增特异性(图14B)。
2.3.3数字PCR的线性范围
微滴式数字PCR的理论有效线性范围是1-100000个拷贝，但20μL反应液在微滴生成器中只能产生12000-16000个有效微滴，微滴数大于10000为有效反应。为了测试数字PCR系统的线性范围，将鸭源性基因组DNA进行梯度稀释，拷贝数分别为13859、6929.5、2772、554.5、111、22，微滴数字PCR的测量值分别为13060、6535、2690、529.5、113、22.5。 分析预期值和测量值的相关性发现，当模板量在20-14000copies之间时，通过微滴数字PCR 获得的测量值与预期拷贝数浓度间具有良好的相关性，决定系数R2值等于1，线性方程 y＝0.9412x+22.037(y代表测量拷贝数，x代表预期拷贝数，见图15)。
2.3.4数字PCR的检测极限和定量极限
为了测定数字PCR系统的检测极限和定量极限，将鸭源性基因组DNA梯度稀释至22、 11和6copies/μL，进行数字PCR扩增。每个浓度重复4次，当DNA浓度低至11copies 时，依然可以稳定的检测到阳性信号，阳性微滴在9-12copies之间；当DNA浓度低至6copies时，一个反应有阳性信号，其余均无阳性微滴；推测数字PCR的检测极限是11copies/μL。 当DNA浓度为22copies/μL时，重复反应间测量值的相对标准偏差为4.06％，小于25％，推 测数字PCR的定量极限是22copies的鸭源性基因组IL-2核基因。
2.3.5数字PCR的重复性
以梯度稀释的鸭源性基因组DNA为模板进行数字PCR扩增，每个模板重复4次反应。对 4个重复间测量值的标准偏差和相对标准偏差进行数据统计，随着模板拷贝数的降低，测量 重复间的标准偏差(表2-8)。在数字PCR的线性范围内，随着拷贝数的降低，相对标准偏差 升高，但低于25％。
表2-8鸭源性基因组DNA/IL-2数字PCR测量结果稳定性分析
Figure BDA0002345597020000101
综上，为保证测量具有较小的不确定度，推荐微滴数字PCR体系和程序见2.3.1。从重 复性测试结果表明，项目优化的数字PCR系统具有良好的重复性，重复间测量结果稳定、可 靠。
实施例3.引物/探针合成及确认
在鸭源性IL-2基因DNA标准物质研制过程中，标准物质均匀性、稳定性检测、标准物 质定值等都要用到引物/探针，因此，引物/探针的合成质量对研制过程和定值至关重要。
3.1引物/探针合成
为了保证引物/探针的合成质量，研制单位及合作定值实验室用到的引物/探针均由生工 生物工程(上海)股份有限公司合成。用于标准物质研制的引物/探针由研制单位委托生工 生物(上海)合成，收到合成的引物后，研制单位负责对引物/探针的合成质量进行确认。 用于标准物质联合定值的引物/探针由联合定值组织单位中国农业科学院生物技术研究所委 托生工生物(上海)合成，收到合成的引物后，联合定值组织单位负责对引物/探针的合成 质量进行确认。
3.2确认方法
引物/探针质量确认的原则是确保引物/探针在定性、定量扩增中能够高效的扩增，扩增 效率达到90-110％。通常从两个方面进行引物/探针的质量确认：(1)确认公司提供的引物/ 探针具有很高的纯度。收到引物/探针后，核查公司提供的“DNA合成报告单”，确认引物/ 探针的核苷酸序列及分子量是否与预期一致。通过观测DNA质谱检测图谱，判断引物/探针 的纯度及分子量，要求质谱只有一个单一的峰，且分子量大小与预期一致。(2)引物/探针 的扩增效率达到90-110％。确认方法是将含有靶标序列的DNA溶液梯度稀释，作为标准样品 进行实时荧光PCR扩增，扩增结束后，根据初始模板拷贝数的对数与Ct值间的线性关系， 绘制标准曲线y＝ax+b。根据标准曲线的斜率，利用公式E＝(10(-1/a)-1)×100计算出扩增效 率。本报告中标准物质的研制主要采用了IL-2核基因的定量检测方法，引物/探针质谱图和 扩增效率检测图，如图16所示，引物/探针的峰图单一，分子量大小与预期一致；IL-2核基 因引物/探针的扩增效率为94.9％，在90-110％之间。引物/探针质量确认结果证明合成的引 物/探针能够高效扩增，质量良好，可以用于标准物质研制及定值。
实施例4.标准物质制备
4.1制备策略
鸭源性IL-2基因DNA标准物质制备的技术路线如图17所示，主要包括基因组DNA候选 物制备、基因组DNA拷贝数浓度测量、标准物质候选物分装及保存、标准物质均匀性检验、 稳定性检验，标准物质联合定值以及不确定度评估等。
4.2基因组DNA候选物制备
4.2.1鸭腿采集
鸭腿采集于浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，绍兴鸭鸭腿肉，用于基因组DNA的大量 提取。
4.2.2鸭腿肉匀浆
鸭腿肉用无菌手术刀剔除皮后，将其切成小块，放入洁净的飞利浦匀浆器中进行匀浆， 匀浆完毕后将匀浆液转移到50mL离心管中，用于后续DNA提取。
4.2.3基因组DNA的提取
前期经预试验，筛选出较为合适本发明的试剂盒。本发明可以采用动物组织大提试剂盒 提取基因组DNA，优选杭州新景生物试剂开发有限公司的动物组织大提试剂盒。其原理为被 溶解的动物组织经蛋白酶K消化后DNA将结合到纯化柱上，降解的蛋白与PCR抑制物则被过 滤除去，DNA经Buffer洗涤后，再洗脱，即可用于分子实验中。
DNA提取操作流程如下：
11)将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL 56℃ 预热的Buffer AT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来。
12)将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；
13)加入2mL Buffer SL，旋涡振荡15秒。将离心管置于70℃水浴15min。
14)加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀。
15)将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min。
16)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，在核酸纯化柱中加 入5mL Buffer WB，盖上盖子，≥4500rpm离心2min。
17)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，最高速离心5min。
18)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置于另外一个洁净的50mL离心管中，放入 56℃恒温培养箱中静置10min。
19)在核酸纯化柱中央加1-2mL 56℃温育的Buffer TE，盖上盖子，56℃温育恒温培养 箱中静置5min，≥4500rpm离心2min。
20)弃纯化柱，洗脱的DNA可立即使用。
4.2.4基因组DNA候选物的质量评价和浓度测定
(1)琼脂糖凝胶电泳分析
分别取1.0μL、2.0μL提取的基因组DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带清晰明亮、条带单一、无杂带，说明提取的基因组DNA质量很好。图18为本发明提取 的基因组DNA，条带亮、单一、无弥散，因此质量符合要求。
(2)分光光度法测定浓度与纯度
采用紫外分光光度法测定所提DNA的纯度(OD260/OD280值应在1.8到2.0之内)。然后， 使用Qubit 2.0荧光计测定DNA浓度。鸭源性基因组DNA质量浓度和拷贝数浓度按下面公式 进行换算：
Cc＝(Cm×NA×10-9)/(M×S×2)
式中：
Cc-基因组DNA拷贝数浓度，copies/μL
Cm-基因组DNA质量浓度，mg/L
NA-阿伏伽德罗常数，6.02×1023copies/mol
M-核苷酸的平均分子量，g/mol
S-鸭基因组大小，1.1Gb
通过紫外分光光度法利用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，USA)测定的基因组DNA 标准物质候选物的吸光值，测6个平行反应，OD260/OD280的平均值为1.98，介于1.8至2.0 之间；OD260/OD230的平均值为2.28，大于2.0。测试结果表明基因组DNA纯度符合要求。
然后通过Qubit 2.0初步估测DNA浓度，DNA浓度约为100ng/μL。根据测量值，用0.1×TE将基因组DNA稀释到约6.5ng/μL。
(3)PCR反应抑制物检测
为考察本发明提取的基因组DNA中是否含有干扰PCR反应的抑制物、以及是否适用于荧 光定量PCR检测。将提取的鸭源性基因组DNA进行梯度稀释，稀释6个梯度，大约对应100 ng/μL-0.02ng/μL的浓度范围。以稀释后的6个浓度梯度DNA为模板进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，检验检测方法的线性范围。检测结果如图19所示。以模板拷贝数对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为：Y＝-3.415X+42.632，R2＝0.998，斜率：-3.415，扩增效率96.3％。表明提取的鸭源性基因组DNA扩增效率正常，不含有干扰PCR反应的抑制物。绘制的标准曲线的各项技术参数在规定的范围内，适于定量检测鸭源性成分 使用。标准曲线的线性范围对应100ng/μL-0.02ng/μL，相当于的鸭源性基因组DNA 1.69×105-34copies/μL，覆盖了常规鸭源性定量检测的浓度范围。
实施例5.标准物质分装及保存
将经过质量评估及浓度测定的基因组DNA在生物安全柜中进行分装。分装过程始终保持 低温状态。分装的基因组DNA每管100μL，共分装500管。将分装的基因组DNA置于100格冷冻盒中，保存于-20℃超低温冰箱中。
实施例6.均匀性检验
根据我国《JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》中规定的检验方法 对鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行统计检验。
本发明鸭源性IL-2基因DNA标准物质共制备了500管，从中随机抽取15管，分别标记 1-15，每管取3个子样，共有45份样品。每份取样量为2μL，采用数字PCR扩增IL-2核基因，采用方差分析法(F检验法)对拷贝数进行均匀性检验，根据均匀性检验的结果合成均匀性不确定度。
1.1 6.1均匀性检验方案
采用数字PCR技术对DNA标准物质的瓶间均匀性进行检测。数字PCR结束后，采用方差 分析法(F检验法)对数据进行统计分析。方差分析法是通过组间方差和组内方差的比较来 判断各组测量值之间有无系统性差异，如果二者的比值小于统计检验的临界值，则认为样品 是均匀的。
为检验样品均匀性，设抽取了m瓶最小包装单元，每瓶最小包装单元抽取n份样品。在 相同条件下得m组等精度测量数据如下：
1.x11，x12，……
Figure BDA0002345597020000131
平均值
Figure BDA0002345597020000132
2.x21，x22，……
Figure BDA0002345597020000133
平均值
Figure BDA0002345597020000134
…………
m，xm1，xm2，
Figure BDA0002345597020000135
……，平均值
Figure BDA0002345597020000136
设
Figure BDA0002345597020000137
Figure BDA0002345597020000138
则组间差方和
Figure BDA0002345597020000139
组内差方和
Figure BDA00023455970200001310
记
ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
Figure BDA00023455970200001311
作统计量F：
Figure BDA00023455970200001312
由此可见，该统计量是自由度(ν1，ν2)的F分布变量。
根据自由度(ν1，ν2)及给定的显著性水平α，可由F表查得临界的Fa值。若F＜Fa， 则认为组内与组间无明显差异，样品是均匀的，若F≥Fa，则怀疑各组间有系统差异。
瓶间均匀性标准偏差可以用以下公式计算。等同于管间不均匀性导致的不确定度分量 ubb。
Figure BDA00023455970200001313
当均匀性检验的测量方法重复性较差，有可能导致
Figure BDA00023455970200001314
此时均匀性产生的标准偏差 可按下式计算：
Figure BDA00023455970200001315
6.2均匀性检验结果
对抽取的各样品在相同的实验条件下进行测定，从而使各个样品间的差异完全由样品的 不均匀性反映出来。同时对45份基因组DNA进行数字PCR检测，测得的拷贝数据见表6-1。 采用F检验方法分析测定数据，统计分析结果表明F＜F0.05(14.30)(表6-1)，即此批次基因组 DNA标准物质具有良好的均匀性。
表6-1瓶间均匀性检验结果
Figure BDA0002345597020000141
6.3最适取样重
本发明通过对数字PCR线性范围测试发现，当模板量在20-14000copies之间时，微滴 数字PCR获得的测量值与预期拷贝数间具有良好的相关性，决定系数R2值等于1。由此可知， 最适取样量应在线性范围内。数字PCR实验常用的反应体系为20μL，行业常规做法为加入 2μL DNA模板进入20μL反应体系。本发明的定值结果为5780copies，在线性范围内， 因此确定了本发明次标准物质最适取样量为2μL，即PCR反应时取样量为2μL。
另外，本发明在进行标准物质的管内、管间均匀性实验时，以2μL基因组DNA溶液作为模板进行测试，测试结果证实本发明标准物质在管内和管间具有良好的均匀性。
6.4均匀性引入的不确定度评估
均匀性检验结果表明，基因组DNA标准物质在瓶间具有良好的均匀性。由于
Figure BDA0002345597020000143
(表 6-1)，基因拷贝数这一特性量值均匀性引入的不确定度采用下面公式进行计算：
Figure BDA0002345597020000142
相对不确定度为：
Figure BDA0002345597020000151
实施例7.稳定性检验
7.1稳定性检验方案
标准物质的稳定性是衡量标准物质的另外一个重要参数。标准物质的长期稳定性与贮存 条件有关，短期稳定性与样品运输过程中的外部因素有关。稳定性研究有两种基本实验设计： 经典稳定性研究和同步稳定性研究。
在经典稳定性研究中，同时(如同一批次)制备的样品在同样的条件下随着时间变化进 行测量。这种情况下，工作是在(实验室内)再现性条件下进行的，导致了相对较高的不确 定度，因为它也包括了测量系统的不稳定性；同步稳定性研究中，所有稳定性研究的测量能 在重复性条件下进行，它强调所有测量同时进行，而不是像经典稳定性研究中那样分配在稳 定性研究的时间间隔上。同步法减少了时间点上的离散性，从而改进了稳定性研究的“分辨 力”。因此，基于测量重复性和(实验室内)再现性之间的差异，同步稳定性研究通常比经 典方法得到的不确定度要小。这种设计的先决条件是能规定一定条件，在此条件下不发生降 解或至少以不同于选定的贮存条件下的速率发生降解。
在鸭源性IL-2基因DNA标准物质的稳定性研究中，结合国际上其他DNA标准物质的研 究结果，以-70℃条件下储存的DNA标准物质为参照，认为DNA标准物质在该条件下不发生 变化，并将其他温度条件下的量值与-70℃下的量值进行比较，采用的研究方法为同步稳定 性法。
稳定性的评价是通过在不同时间测定标准物质的特性值，以时间为X轴，以特性量值为 Y轴，描绘出特性量值与时间的关系。
稳定性评估基本模型可表示为Y＝β0+β1X
式中：
β1，β0-回归系数；
X-时间；
Y-标准物质候选物的特性值
对于稳定的标准物质，β1的期望值为零。
假定有n对X，Y的观测值(Xi，Yi)，每个模拟直线上的Yi可用公式
Figure BDA0002345597020000152
估算。
式中：
Xi-第i个时间点；
Yi-第i个时间点的观测值；
Figure BDA0002345597020000153
-所有时间点的平均值；
Figure BDA0002345597020000154
-所有观测值的平均值。
截距可用公式
Figure BDA0002345597020000155
计算。
β1的标准偏差s(β1)由公式
Figure BDA0002345597020000156
计算。
式中s-直线上每点的标准偏差，按
Figure BDA0002345597020000161
计算。
式中：
Xi-第i个时间点；
Yi-第i个时间点的观测值；
β1，β0-回归系数；
n-测量次数
基于β1的标准偏差，可用t-检验进行以下判断：若|β1|＜t0.9s，n-2·s(β1)，则表明斜率不 显著，没有观察到不稳定性。
根据公式推算由稳定性引入的不确定度：μs＝s(β1)·X
式中：
us-由稳定性引入的不确定度
s(β1)-β1的标准偏差
X-给定的保存期限
7.2短期稳定性
结合国际上其他DNA标准物质的研究结果，认为DNA标准物质在-70℃条件下不发生变 化。短期稳定性测试旨在考察标准物质的运输稳定性，在运输过程中不能排除极端高温的情 况，因此将样品分别存储在4℃、25℃、37℃、60℃，分别在第0天、第1天、第3天、第 7天、第14天后取样并储存于-70℃，每次每个贮存温度随机选取3管，每管重复取样3次 (N＝3，n＝3)，待取样完毕后统一进行检测。采用数字PCR扩增IL-2基因的方法进行稳定性 检验。IL-2核基因的拷贝数(表7-1)，对数据进行T检验(表7-2)，评价样品的短期稳定 性。
结果分析发现，储存14天后，在4℃、25℃、37℃储存条件下DNA标准物质拷贝数未发生 显著变化，表现出良好的短期稳定性。60℃由于温度高，只有放置1天表现出了良好的短期稳 定性。因此，短期稳定性考察结果表明DNA标准物质可以在常温下稳定储存和运输14天，特性 量值不会发生显著变化，要求采用冷链运输方式。
表7-1短期稳定性检验IL-2基因拷贝数
Figure BDA0002345597020000162
表7-2短期稳定性检验结果
Figure BDA0002345597020000171
短期稳定性结果经过T-test对数据进行分析，结果表明变化的差异未达到显著水平。 样品在37℃储存14天后，拷贝数变化趋势不显著，而此样品60℃下最多稳定一天，因此夏 季运输过程中为确保该标准物质运输的稳定性，要求采用冷链运输方式。
7.3长期稳定性
长期稳定性检验是将样品分别存储在-20℃，分别在第0月、第1月、第2月、第4月、第6月后取样，每次每个贮存温度随机选取3瓶，每瓶重复取样3次(N＝3，n＝3)。数字PCR 测试得到IL-2基因拷贝数(表7-3)，对数据进行T检验(表7-4)。通过检测其拷贝数变化 情况，考察其长期稳定性。
表7-3长期稳定性检验IL-2基因拷贝数值
Figure BDA0002345597020000172
表7-4长期稳定性检验结果
Figure BDA0002345597020000173
Figure BDA0002345597020000181
故此，稳定性考察结果表明，鸭源性IL-2基因DNA标准物质在-20℃温度下， |β1|＜t0.95，n-2·s(β1)直线斜率未发生显著性变化，6个月存储稳定性良好。因此鸭源性IL-2 基因DNA标准物质在6个月内均处于稳定状态。
7.4冻融稳定性
由于标准物质使用时最小取样量为2μL，本发明标准物质每管100μL，实验中鸭源性IL-2基因DNA标准物质取3管样品，反复冻融10次，每次每管样品取样3次，检测鸭源 性IL-2基因DNA标准物质的量值是否发生变化。标准物质复融性拷贝数数据见表7-5，拷贝 数结果统计表见表7-6。
表7-5冻融稳定性检验结果
复融次数 重复1 重复2 重复3 平均值
1 5.74E+03 5.72E+03 5.91E+03 5.79E+03
2 5.72E+03 5.82E+03 5.91E+03 5.82E+03
3 5.72E+03 5.67E+03 5.64E+03 5.68E+03
4 5.82E+03 5.91E+03 5.80E+03 5.84E+03
5 5.84E+03 5.61E+03 5.67E+03 5.71E+03
6 5.71E+03 5.71E+03 5.83E+03 5.75E+03
7 5.71E+03 5.83E+03 5.84E+03 5.79E+03
8 5.84E+03 5.86E+03 5.71E+03 5.80E+03
9 5.78E+03 5.59E+03 5.65E+03 5.67E+03
10 5.74E+03 5.82E+03 5.67E+03 5.74E+03
表7-6冻融稳定性检验统计分析结果
Figure BDA0002345597020000182
反复冻融10次的统计结果(表7-6)显示斜率不显著，表明鸭源性基因组标准物质在反 复冻融10次使用中无明显的上升或下降趋势，且变化范围均在特性量值及其不确定度范围 内。因此，鸭源性基因组标准物质在反复冻融10次的使用过程中是稳定的。
7.5标准物质稳定性引入的不确定度的评估
拷贝数稳定性的不确定度贡献采用公式：us＝s(β1)·X。
长期稳定性不确定度计算：
-20℃条件下，有效期t＝6个月的长期稳定性不确定度us＝17.88×6＝107.28copies/μL
Figure BDA0002345597020000191
为5553.11copies/μL，相对不确定度urel(S)为0.020。
短期稳定性不确定度计算：由表7-2结果计算可得25℃时标准偏差较大，短期稳定性引 入的不确定度为：
usts＝13.69×14＝191.70copies/μL，
Figure BDA0002345597020000192
相对不确定度为：
urel(sts)为：0.035。
实施例8.定值
本报告描述的鸭源性IL-2基因DNA标准物质采用绍兴鸭鸭腿作为原材料制备而成。目 前各检测机构主要采用实时荧光定量PCR方法和数字PCR方法进行动物源性成分的定量检 测，检测靶标为基因组总DNA。为便于检测结果的溯源，本发明标准物质的特性量值是鸭源 性总基因组DNA的拷贝数，该特性量值由八家实验室采用不依赖标准物质的数字PCR联合测 定。
8.1定值实验室的选择
本标准物质定值按照JJF1343-2012标准要求，通过多个实验室协作定值，本次参加定 值的实验室的数目为8个。8家实验室均长期从事DNA测量工作，具有一定的技术权威性， 在测定标准物质特性量方面具有必备条件以及同等的技术能力和经验。
8.2实验室定值能力验证的目的和方法
通过给8家实验室发放盲样(盲样为国家一级标准物质)：转基因水稻G6H1基因组DNA 标准物质[GBW10141])，用数字PCR仪定值盲样拷贝数来验证8家实验室具有同等的技术能 力，以保证所提供的结果具有较高的准确度及可信度。
8家实验室(表8-1)分别检测盲样2管，每管重复检测2次，对实验数据进行统计分析并将实验数据返回浙江省农业科学院进行确认。
表8-1参加定值实验室
Figure BDA0002345597020000193
8.3实验室定值能力验证实验结果
表8-2实验室定值能力验证实验结果(copies/μL)
Figure BDA0002345597020000201
实验结论
实验结果表明：8家实验室检测结果RSD％均小于25％，且其量值均落于转基因水稻G6H1 基因组DNA标准物质的量值【标准值±不确定度(2.66±0.25)×105copies/uL】的不确定 度区间范围内，证明8家实验室的检测能力稳定，满足联合定值能力要求。(表8-2)
8.4计量溯源性描述
数字PCR是一种不依赖标准物质的核酸绝对定量方法，其原理是将原始PCR反应体系进 行分割，进而对所有小型反应体系(油包水微滴或者芯片反应室)进行扩增，通过阳性率和 泊松分布计算获得样品中靶序列拷贝数或拷贝数浓度。目前该方法已成为核酸精确定量的主 要方法。本发明次鸭源性IL-2基因DNA标准物质制备原材料是绍兴鸭鸭腿肉经DNA提取稀 释获得。通过数字PCR方法经8家实验室联合对鸭基因组中IL-2核基因拷贝数进行定量， 实现对标准物质拷贝数的定量。
研制过程中，本发明对数字PCR测定方法体系进行了充分优化，在实验室内对该方法的 线性范围、精密度、定量限和检出限等进行了确认，对所建立的测试方法进行了充分的研究 以确保满足定值需要。
本发明单位所在实验室具备国家认监委检验检测机构资质认定(CMA)质量管理体系， 建立有相关仪器设备的检定/校准计划、校准确认程序、期间核查程序、供应商评价程序等， 确保所涉及的相关仪器设备定值结果的准确、有效和可溯源。
联合定值的8家单位选择具有CMA或CNAS等质量体系保证的机构，且长期从事DNA的 测试。在定值前，发放盲样(国家一级标准物质转基因水稻G6H1基因组DNA)进行了实验室 能力考核，结果显示8家实验室检测结果量值均落于该标准物质的量值【标准值±不确定度 (2.66±0.25)×105copies/uL】的不确定度区间范围内，证明8家实验室的检测能力稳定， 保证了所提供的结果具有较高的准确度及可信度。
本发明单位参加了2019年7月由LGC和SIMT组织的数字PCR定量检测能力验证，使用 的数字PCR仪QX200由仪器厂家的提供了运行检查报告。共考核盲样两个，通过数字PCR测 试分析后，提供定量数据，符合预期值(Z值为-0.73)，结果为满意。该能力验证的结果，可为数字PCR仪的准确性、可比性提供计量证明。
8.5定值方法
本发明鸭源性IL-2基因DNA标准物质基因组拷贝数由多家实验室采用数字PCR方法联 合测定。鸭基因组定量PCR方法的引物/探针设计、筛选、浓度优化。通过不同的引物/探针 组合进行比对筛选，从中筛选出了最佳引物探针组合IL-2-F/IL-2-R/IL-2-P作为候选引 物，引物探针序列详见表2-1，扩增产物长212bp，反应体系详见2.3.5。在定量检测过程中， 用IL-2核基因拷贝数来表征基因组DNA总量。
数字PCR仪是生命科学领域的最新实验平台，数字PCR技术是目前认为最为精确的核酸 定量检测技术，它是一种不依赖标准物质的绝对定量技术。该技术目前已被美国国家标准技 术研究院(NIST，National Institute of Standards and Technology)用于核酸标准物质 的量值测定，也被应用于欧盟IRMM转基因检测标准物质研制的定值中。如欧盟IRMM研制的 白血病诊断质粒标准物质(ERM-AD263a-ERM-AD263f)和美国发布的乳腺癌诊断基因组DNA 标准物质(HER2)均采用数字PCR方法定值。在本发明中利用伯乐微滴数字PCR平台进行检 测，数字PCR反应体系详见2.3.5。利用优化的反应体系，在微滴式数字PCR平台上可进行 鸭源性基因组DNA IL-2核基因的数字PCR扩增，在可接受的线性范围内，可明确的区分阳 性微滴和阴性微滴，结果表明可以在微滴数字PCR平台上进行鸭源性IL-2基因DNA标准物 质IL-2核基因的绝对定量分析。
8.6联合定值实施
为测量标准物质拷贝数，浙江省农业科学院农产品质量标准研究所组织了8家实验室利 用数字PCR方法进行联合定值，包括：1.农业农村部农产品及加工品质量安全监督检验测试 中心(杭州)(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所)、2.农业农村部植物及植物用微生 物生态环境安全监督检验测试中心(北京)(中国农业科学院生物技术研究所)、3.农业农村 部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)(黑龙江省农业科学院)、4.浙江省检验检疫 科学技术研究院、5.农业农村部转基因植物环境安全监督检验测试中心(杭州)(中国农业 科学院水稻研究所)、6.农业农村部植物及植物用微生物生态环境安全监督检验测试中心(广 州)(华南农业大学)、7.农业农村部农产品及转基因产品监督检验测试中心(天津)、8.农 业农村部植物生态环境安全监督检测测试中心(上海)(上海交通大学)。
在实施本次联合定值前，浙江省农业科学院农产品质量标准研究所制定了详细的实施方 案。浙江省农业科学院农产品质量标准研究所将经过质量验证的引物/探针和制备好的基因 组DNA标准物质分发给8家实验室，测定完成后，将数据反馈给组织者浙江省农业科学院农 产品质量标准研究所。由组织者汇总并处理数据，8家实验室的数字PCR实验数据汇总如表 8-3所示。
表8-3鸭源性IL-2基因DNA标准物质IL-2核基因拷贝数值联合定值数据
Figure BDA0002345597020000211
Figure BDA0002345597020000221
8.7联合定值数据的分析
(1)实验室内数据可疑值检验
用狄克逊法和格拉布朗法分别检验8家实验室8组数据的可疑值(数据详见表8-3)。狄 克逊法中，将测定数据按从小到大的顺序排列，分别计算r1值和rn值， r1＝(X(2)-X(1))/(X(n)-X(1))，rn＝(X(n)-X(n-1))/(X(n)-X(1))。若r1＞rn，且r1＞f(a，n)，则判定X(1)为异常值；若r1＜rn且rn＞f(a，n)，则判定X(n)为异常值；若r1和rn值均小于f(a，n)，则所有数据 保留。经狄克逊检验，本次联合定值中实验室内的所有数据无异常，均保留。格拉布朗法中， 残差
Figure BDA0002345597020000226
当|vi|＞λ(a，n)*s时，则xi应被剔除。经查表得λ(0.05，8)＝2.126经格拉布朗法检验，本次联合定值中实验室内所有数据均保留。
(2)联合定值数据正态性分布检验
由于合作定值的数据均无可疑值，将所有联合定值的原始数据进行正态分布检验。采用 达戈斯提诺法进行检验。
Figure BDA0002345597020000222
式中：
Figure BDA0002345597020000223
n为测定次数。
对本次8家实验室联合定值的数据进行统计分析，计算得到Y拷贝数＝1.05，落在达戈斯提 诺法检验临界区间，多家定值数据符合为正态分布。
(3)实验室间数据组数据等精度检验
采用科克伦法检验平均值间是否等精度，先计算m组数据的各组n个数据的方差，再计 算其中的最大方差与m个方差和之比：
Figure BDA0002345597020000224
根据所取显著性性水平α，数据组 数m，重复测定次数n，查科克伦检验临界值表得到：鸭源性IL-2基因DNA标准物质的 C(α，m，n)＝C(0.05，8，8)＝0.3043，本次计算出来的C值分别为：
C拷贝数＝0.2261
计算得到C值均小于临界值C(a，m，n)，表明各组数据平均值间为等精度。
鸭源性IL-2基因DNA标准物质结果表8-3数据经统计分析后数据结果符合JJF1343的 要求。取总平均值作为标准值。
8.8标准物质的标准值
由统计结果可知，联合定值测量数据是等精度数据，并且组间平均值无显著性差异，故 此，测量结果可用算术平均值表示，见表8-4。
表8-4鸭源性成分基因组DNA定值的多参数统计结果
Figure BDA0002345597020000225
8.9不确定度评估
8.9.1定值过程引入的不确定度
标准物质定值过程带来的合成不确定度uc由两部分组成，第一部分是通过测量数据的 标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出A类不确定度。第二部分是通过 对测量影响因素的分析，以非统计分析的方法评定出其大小的B类不确定度。
(1)鸭源性基因组DNA拷贝数联合定值引入的A类不确定度
数字PCR测定标准物质的标准值，测定数据服从正态分布，经过检验
Figure BDA00023455970200002310
间等精度，将各 实验的平均值汇总，其算术平均值则为标准值的平均值
Figure BDA0002345597020000231
因此鸭源性成分基因组DNA定值 引入的不确定度具体计算方法依据JJF1343-2012的7.3.2部分，具体如下：
Figure BDA0002345597020000232
鸭源性成分基因组DNA的A类不确定度为：
uA拷贝数＝33.55copies/μL，urel(4)＝0.0059
(2)定值过程中引入的B类不确定度
B类不确定主要来源于数字PCR错误识别阳性微滴和阴性微滴产生的不确定度、数字PCR 微反应体积不一致产生的不确定度。阳性微滴和阴性微滴的准确识别通过采用特别设计的自 动识别软件，以及采用优化的数字方法而得到保证，在优化建立数字PCR方法过程中，以不 产生难以识别的微滴为标准，其不确定度忽略不计。因此B类不确定度主要统计数字PCR微 滴体积不一致产生的不确定度。
在制备微滴的过程中，会发生微滴体积不一致的情况(Demeke和Dobnik，2018)。本发 明中微滴数字PCR用的均为8通道微滴生成仪(D68)，欧盟联合实验室与澳大利亚计量院发 表的论文中给出了此方法微滴引入的扩展不确定度为2％(Philippe Corbisier等，2015)。 本发明选取此测量不确定度作为微滴体积不一致引入的不确定度，则其相对不确定度为：
Figure BDA0002345597020000233
本发明中IL-2核基因采用单重数字PCR进行扩增，则本发明联合定值过程中数字PCR 带来的不确定度为：0.01。
(3)合成标准物质定值过程引入的相对标准不确定度
标准物质定值过程中引入的相对不确定度合成为：
Figure BDA0002345597020000234
8.9.2均匀性引入的不确定度
均匀性检验结果表明，基因组DNA标准物质在瓶间具有良好的均匀性。由于
Figure BDA0002345597020000235
(表 6-1)，IL-2基因拷贝数这一特性量值均匀性引入的不确定度采用下面公式进行计算：
Figure BDA0002345597020000236
相对不确定度为：
Figure BDA0002345597020000237
8.9.3稳定性引入的不确定度
拷贝数稳定性的不确定度贡献采用公式：us＝s(β1)·X。
长期稳定性不确定度计算：
-20℃条件下，有效期t＝6个月的长期稳定性不确定度us＝17.88×6＝107.28copies/μL
Figure BDA0002345597020000238
为5553.11copies/μL，相对不确定度urel(S)为0.020。
短期稳定性不确定度计算：由表7-2结果计算可得25℃时标准偏差较大，短期稳定性引 入的不确定度为：
usts＝13.69×14＝191.70copies/μL，
Figure BDA0002345597020000239
相对不确定度为：
urel(sts)为：0.035。
8.9.4合成标准不确定度
标准物质定值结果的总不确定度由三个部分组成。第一部分是标准物质定值过程带来的 A类和B类不确定度的合成不确定度uc；第二部分是物质不均匀性所引起的标准不确定度ubb； 第三部分是物质在有效期内的不稳定性所引起的标准不确定度us。
合成标准不确定度为：
Figure BDA0002345597020000241
扩展不确定度U＝ku(k＝2，置信概率95％)，则鸭源性基因组DNA拷贝数相对标准不确 定度为：
Figure BDA0002345597020000242
鸭源性基因组DNA拷贝数的相对扩展不确定度为：
Urel＝2×0.044＝0.088(k＝2，置信概率95％)，扩展不确定度U＝0.088×5780.94＝508.73 copies/μL，因此鸭源性IL-2基因DNA标准物质拷贝数的量值及不确定度为(5.78±0.51) ×103copies/μL。
本标准物质的特性量值为八家实验室采用数字PCR联合定值的鸭源性基因组DNA拷贝 数。鸭源性IL-2基因DNA标准物质的拷贝数为5.78×103copies/μL，扩展不确定度为0.51 ×103copies/μL。通过数字PCR检测标准物质的均匀性和稳定性，结果表明标准物质的均匀 性和稳定性良好，在-20±2℃条件下可以稳定保存6个月以上，本实验室将标准物质保存在 -20℃。
本标准物质目标基因为细胞核基因组中的IL-2基因，同时也适用于检测细胞色素c氧 化酶亚基3基因(COX3)，涉及标准：《在食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第五部分： 鸭成分检测PCR法》(SN/T 3731.5-2013)、《动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法》(DB 22/T 2049-2014)、《肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR检测方法(深圳市)》(SZDB/Z258-2017)；适合检测16S rRNA基因，涉及标准：《饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法(SN/T 2727-2-10)》；适合检测Cytb基因，涉及标准：《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR方法》(SN/T报批稿)。
本发明鸭源性IL-2基因DNA标准物质的使用将有效地解决我国动物源性实验室间检测 结果不可比的问题，为我国动物源性产品的检测、监测提供技术保障。
实施例10本发明标准物质用于具体检测及定量检测
标准物质研制单位从超市购买了某品牌火腿肠，包装上标注有鸭肉成分。
将实验室保存的鸭腿肉提取DNA后进行梯度稀释，建立标曲。同时，将鸭源性标准物质 作为阳性质控物，提取的火腿肠DNA为样本，参考标准物质说明书，以IL-2基因为靶基因， 进行实时荧光PCR检测。结果如图20。
从图20中，我们可以看到，构建的标准曲线的R2＝0.999，斜率-3.336，扩增效率99.4％ 都符合要求，计算得标准物质的拷贝数5600拷贝，在标准物质的不确定范围内，样本拷贝 数为270拷贝。
因此，从实际检测中可以看到，鸭源性IL-2基因基因组DNA标准物质完全能满足实际 检测的需求，能作为检测用阳性质控物使用，也可用于准确定量样本中鸭源性成分的拷贝数。 实施例11本发明标准物质对实时荧光定量PCR仪进行校准
参考《聚合酶链反应分析仪校准规范》(JJF1527-2015)，应用鸭源性IL-2基因组DNA 标准物质，对实验室实时荧光定量PCR仪进行校准检测。
1.标本示值误差：
依据规范要求，配制未知样品1(U1)和未知样品2(U2)，样品配制后充分震荡混匀，测试其拷贝数浓度。结果如下：
按公式计算样本示值误差：
Figure BDA0002345597020000251
2.将鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行稀释，进行标曲验证。
Figure BDA0002345597020000252
R2＝0.999
如果标准曲线符合R2要求，且样本不确定度在许可范围内，则说明仪器没有问题。通过 实验，该标准物质满足《聚合酶链反应分析仪校准规范》的要求。
实施例12本发明标准物质用于实验室质量控制的实例
为检测鸭源性IL-2基因DNA标准物质是否能满足实验室质量控制的要求，我们查找了 目前现行有效的鸭源性成分检测标准，并以鸭源性IL-2基因DNA标准物质为质量控制样品， 使用标准中的引物/探针、反应体系、反应程序进行了测试。测试结果如下：
一、食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第五部分：鸭成分检测PCR法(SN/T3731.5-2013)(扩增图谱见图21)
1.引物序列
表12-1引物序列
Figure BDA0002345597020000253
2.PCR反应体系
表12-2 PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002345597020000254
3.PCR反应条件
表12-3 PCR反应条件
Figure BDA0002345597020000255
4.测序结果
>Contig\2
ctagttcgggggttggtactaggcttgagtggaagaatgcccagaaaaatcctaggaagaagaaagcttc ggatgtgatgaagaggattatgccgtatcgtaggcctttttggactgtaggtgtgtggtggccttggaag gtgctctctcggacaatgtcccgtcatcattggagtatcactaggagcattgataagaggccggcggctagcaggatagatgaga
5.Blast结果
对应基因为：细胞色素c氧化酶亚基3，Cytochrome C oxidase subunit III，缩写为COX3。
二、动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法(DB 22/T 2049-2014)(扩增图谱见图1)
1.引物序列
表12-4引物序列
Figure BDA0002345597020000261
2.PCR反应体系
表12-5 PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002345597020000262
3.PCR反应条件
表12-6 PCR反应条件
Figure BDA0002345597020000263
4.测序结果
DBS22018-2013
>Contig\1
cttgagtggaagaatgcccagaaaaatcctaggaagaagaaagcttcggatgtgatgaagaggattatgc cgtatcgtaggcctttttggactgtaggtgtgtggtggccttggaaggtgctctctcggacaatgtcccg Tcatcattggagtatcactaggagcattgataagaggccggcggctagcaggatag
5.Blast结果
对应基因为：细胞色素c氧化酶亚基3，Cytochrome C oxidase subunitIII，缩写为COX3。
三、饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法(SN/T 2727-2010)(扩增曲线见图22)
1.引物探针序列
表12-7引物探针序列
Figure BDA0002345597020000264
2.qPCR反应体系
表12-8 qPCR反应体系(50μL)
Figure BDA0002345597020000265
Figure BDA0002345597020000271
3.qPCR反应条件
表12-9 qPCR反应条件
Figure BDA0002345597020000272
4.测序结果
TGAGCACTAAGATCCCACTAATTAAGACTTAACTAAAGCATTTTATACGA
5.Blast结果
目的基因：16S rRNA
四、肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR检测方法(深圳市)(SZDB/Z 258-2017)(扩增曲线 见图23)
1.引物探针序列
表12-10引物探针序列
Figure BDA0002345597020000273
2.qPCR反应体系
表12-11 qPCR反应体系(20μL)
Figure BDA0002345597020000274
3.qPCR反应条件
表12-12 qPCR反应条件
Figure BDA0002345597020000275
4.测序结果
>Contig\1
tcttactcacaacctcagggctagtcatgtgattccactacaactcatctatcctgctagccgccggcctcttatcaat gctcctagtgatactccaatgatgacgggacattgtccgagagagcaccttccaaggccaccacacacctacaa
5.Blast结果
对应基因为：细胞色素c氧化酶亚基3，Cytochrome C oxidase subunit III，缩写为 COX3。
五、常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR方法(SN/T报批稿)(扩增曲线见图24)
1.引物探针序列
表12-13引物探针序列
Figure BDA0002345597020000281
2.qPCR反应体系
表12-14 qPCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002345597020000282
3.qPCR反应条件
表12-15 qPCR反应条件
Figure BDA0002345597020000283
4.测序结果
GCATGGCATGCCTACACCGCAGACACATCCCTTGCTTTATCCTCAGTCGCCAACACAAC
5.Blast结果
目的基因：Cytb基因
通过对5个标准的测试，鸭源性IL-2基因DNA标准物质具有良好的适用性，可作为目 前现行有效标准阳性质控物。
以上以具体实施方式描述了本发明，本领域技术人员在不背离本发明精神的情况下，可 以做出等同的修改或变型，其同样在权利要求的范围之内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 鸭源性IL-2基因DNA标准物质及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 865
<212> DNA
<213> 鸭(duck)
<400> 1
ttctatgggg gagtgggaca gcgcatgagg gaaaaagtgt ttcatgcaga aagcacaaag 60
agactgccaa aagtgagtgt gggcttctct ttccccaatg aatgtaggta aaatccctct 120
tgctttaaaa aaattccaaa gtgtcatcag gggaggaaaa acaaaagtaa tgattcttgc 180
catacaggta aagcatatga aaaaatgtgt aataaaacct cttttacatg acgcccccat 240
ctttttccct ccagaaagaa gagtataaat acactaaaca gcctaatgac aacatatcag 300
ctctcattac atatcacaac tgaaatacta gcacagagac aaccagaaca ctgacaagat 360
gtgcaaagta ctcatcttca gctgcctttc agtactaatg cttatgacta cagcttatgg 420
agcacctcta tcagagaaag acaacactct taaaacttta ataaaagatt tagaaaacct 480
gggaacaagc atgaatgtaa gtggatggtt ttcctgtatt aattctttac tatttgtctt 540
ttctacttat ttttgtctat taactttgtt cacaaaaatt aactttttcc ccctcttctc 600
tacaggggat tgatcttgag ctctacacac caaatgacac aaaggtaagt tcaagttttc 660
tgtcttcagg actgctaaga tacggctatt ttgaagttat gtgttattga attagaccaa 720
agtaattcac ttaccagaag gcccgataca aaagacaaat ctgagctgtc tgaactttgt 780
gtgaggatag cataagctaa cctagaagta ctgggcacaa ggatagcagg ctaacctaga 840
agacatttct gcttttgatt tgtat 865

Claims (10)

1.一种鸭源性IL-2基因DNA标准物质，其特征在于其中含有鸭源性基因组DNA，基因拷贝数为5.78×103拷贝/μl，扩展不确定度为0.51×103拷贝/μl，-20±2℃可稳定保存6个月以上，冻融10次仍可保持稳定，且产品均匀度良好，符合标准物质的要求。
2.根据权利要求1的DNA标准物质，其特征在于其为多个浓度梯度稀释的形式。
3.根据权利要求1的DNA标准物质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：鸭肉前处理；基因组DNA提取、质量鉴定；分装保存；均匀性评估、稳定性评估、定值及不确定度评估，从而得到所述标准物质。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于其中鸭肉前处理是对鸭腿肉进行匀浆；得到的匀浆液用于提取基因组DNA；采用动物组织大提试剂盒进行基因组DNA提取。
5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
1)将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL 56℃预热的Buffer AT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来；
2)将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；
3)加入2mL Buffer SL，旋涡振荡15秒；将离心管置于70℃水浴15min；
4)加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀；
5)将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min；
6)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，在核酸纯化柱中加入5mL Buffer WB，盖上盖子，≥4500rpm离心2min；
7)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，最高速离心5min；
8)弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置于另外一个洁净的50mL离心管中，放入56℃恒温培养箱中静置10min；
9)在核酸纯化柱中央加1-2mL 56℃温育的Buffer TE，盖上盖子，56℃温育恒温培养箱中静置5min，≥4500rpm离心2min；
10)弃纯化柱，洗脱DNA。
6.一种试剂盒，其特征在于其中含有权利要求1或2所述的鸭源性IL-2基因DNA标准物质。
7.根据权利要求6的试剂盒，其特征在于其中还含有选自针对IL-2基因、COX3基因、16SrRNA基因或Cytb基因的引物和探针，优选选自表2-1的九种引物和探针组合之一。
8.根据权利要求6的试剂盒，其特征在于其中还含有检测鸭IL-2基因的引物和/或探针，优选的引物和探针组合如下：
6-F GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA 6-R GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC 6-P FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1
9.根据权利要求1或2的鸭源性IL-2基因DNA标准物质，其特征在于作为阳性质控物的用途，或用于DNA定量方法的验证的用途，或用于实验室质量控制的用途。
10.根据权利要求9的用途，其特征在于使用的PCR反应条件如下：PCR反应程序如下：95℃变性5min；然后95℃变性10s，58℃退火延伸32s，40个循环；PCR反应体系如下：
试剂 终浓 体积 TaqMan反应 1× 12.5μL 10μmol/L正 0.8 2.0μL 10μmol/L反 0.8 2.0μL 10μmol/L探 0.2 0.5μL DNA模板 / 2.0μL 无菌水 / 6.0μL 总体积 / 25.0μL
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