CN113088531A - 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 - Google Patents

牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113088531A
CN113088531A CN202110317748.4A CN202110317748A CN113088531A CN 113088531 A CN113088531 A CN 113088531A CN 202110317748 A CN202110317748 A CN 202110317748A CN 113088531 A CN113088531 A CN 113088531A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
beef
standard
ref
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110317748.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113088531B (zh
Inventor
马炳存
陈学强
李琰歆
贺巧玲
曹乾超
王灿
崔学文
刘阳
李增婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Food And Drug Inspection And Testing Institute (sichuan Institute Of Pharmaceutical Quality And Sichuan Medical Device Testing Center)
Original Assignee
Sichuan Food And Drug Inspection And Testing Institute (sichuan Institute Of Pharmaceutical Quality And Sichuan Medical Device Testing Center)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Food And Drug Inspection And Testing Institute (sichuan Institute Of Pharmaceutical Quality And Sichuan Medical Device Testing Center) filed Critical Sichuan Food And Drug Inspection And Testing Institute (sichuan Institute Of Pharmaceutical Quality And Sichuan Medical Device Testing Center)
Priority to CN202110317748.4A priority Critical patent/CN113088531B/zh
Publication of CN113088531A publication Critical patent/CN113088531A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113088531B publication Critical patent/CN113088531B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及食品检验技术领域，公开了一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，将beef基因与ref基因串联得beef‑ref基因，再将beef‑ref基因克隆入pUC 57质粒中，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒；还公开了标准质粒，分析方法和应用。本发明本发明建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析的方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。

Description

牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用
技术领域
本发明涉及食品检验技术领域，具体涉及牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用。
背景技术
我国及欧盟食品标准均要求肉制品包装中应明确标识产品中动物源成分组成及含量，但市场上肉制品中动物源性成分含量虚标、掺假事件屡禁不止。肉制品掺假给消费者的身体健康(过敏反应)、宗教信仰等方面均带来了风险。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分定性、定量鉴别技术的研究成为食品安全领域的研究热点。
目前使用的动物源性成分鉴定分析方法主要基于蛋白质和DNA分析。蛋白质分析技术包括免疫、色谱和质谱，肉制品加工过程中的热处理工艺、酸碱盐环境变化使蛋白质变性，生物活性丧失，很难满足检测的需要，且亲缘关系较近的物种蛋白质分析易出现交叉反应，限制了蛋白质分析技术在这一领域的应用。基于DNA分析的检测方法可以克服这些困难，DNA的热稳定性、酸碱稳定性优于蛋白质，并且DNA有更丰富的种间多态性，高温处理过的食品中仍能提取出片段化的DNA，在深加工肉制品的鉴别检测中DNA分析方法具有灵敏度高和特异性强的明显优势。但现行标准中的检测方法主要存在以下局限性：第一，只能进行定性检测，无法完成定量分析；第二，检测灵敏度过高，在检测过程中，无法排除在生产、储存、运输、销售等过程中样品交叉污染或原料带入所带来的阳性结果，很难为市场监管提供有力的技术支撑。
现行检测技术无法定量分析样品中动物源性成分的根本原因在于检测使用的引物和探针是针对线粒体基因设计的。线粒体基因进化速度快，对物种的区分度较高，常用于物种的细致分类，研究生物的进化过程。但是，线粒体基因在不同组织细胞中拷贝数不同，因此针对线粒体DNA的检测方法只能进行定性检测，无法完成定量分析；线粒体的拷贝数普遍较高，以线粒体基因作为检测靶位进行检测时灵敏度过高，在检测过程中，无法区分产品交叉污染、原料带入和生产者恶意掺假造成的阳性检测结果。以细胞核染色体基因组中单拷贝基因作为检测靶位设计引物和探针，建立动物源性成分定量分析方法，可以克服现有定性检测方法的缺点。但已报道的定量分析方法存在以下不足，严重限制了这些方法的推广应用。第一，用于定量的基因拷贝数与样品质量分数之间的对应关系无法准确计算；第二，以质量分数计算样品中牛肉含量时要求DNA提取效率接近100％，但由于不同肉制品肉源性成分、加工工艺、原辅料不同，DNA提取效率很难达到100％；第三，定量过程需要绘制标准曲线，但无法获得定量准确的标准品。因此，建立基于细胞核染色体基因组中单拷贝基因的相对定量Q-PCR方法对肉制品中动物源性成分进行定量分析，准确鉴别肉制品掺假，可为市场监管、执法检验提供可靠的技术支撑。
发明内容
基于以上问题，本发明提供牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用，本发明可满足牛肉制品掺假鉴别的检测需求，有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。
为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef-ref基因，beef-ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef-ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef-ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。
为解决以上技术问题，本发明还提供了标准质粒。
为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000021
之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：
p％＝bt÷rt×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数。
进一步的，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。
为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
PCR扩增体系
Figure BDA0002991889750000031
PCR扩增程序
Figure BDA0002991889750000032
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000033
Figure BDA0002991889750000041
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
为解决以上技术问题，本发明还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，按照下表中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
PCR扩增体系
Figure BDA0002991889750000042
PCR扩增程序
Figure BDA0002991889750000043
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000051
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
为解决以上技术问题，本发明还提供了标准质粒在制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析的方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。
附图说明
图1为本发明的实施例1、实施例2和实施例3中的定量分析方法技术路线图；
图2为本发明的实施例1的ref引物和beef引物特异性扩增曲线及熔解度曲线图；
图3为本发明的实施例1的Ct值比较法beef基因和ref基因扩增效率图；
图4为本发明的实施例1的beef基因与ref基因串联策略示意图；
图5为本发明的实施例2的beef基因和ref基因检测限(10copies/μl)DNA扩增及熔解度曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
本实施例以Genbank中普通牛(Bos taurus)肌肉生长抑制素基因(myostatin,GDF8)全长序列为模板，设计内参基因(ref)扩增引物。以牛科动物(Bovine)基因组中单拷贝环GMP磷酸二酯酶基因(cyclic GMPphosphodiesterase，PDE)非编码区为模板，设计牛肉特异性基因(beef)扩增引物。利用NCBI的BLAST工具对引物设计模板DNA序列进行比对分析，结果表明ref基因在100多种哺乳动物中广泛存在，beef基因在普通牛(Bos taurus)、瘤牛(Bos indicus)、牦牛(Bos mutus)、北美野牛(Bison)中均存在。将设计的引物输入Primer Premier6软件进行引物特异性验证，结果表明ref引物在肌肉生长抑制素基因全长序列中存在唯一的特异性结合位点，beef引物在环GMP磷酸二酯酶基因全长序列中存在唯一的特异性结合位点，表明本实施例设计的检测引物能够特异性扩增靶基因，符合实验要求。
本实施例设计的内参ref基因及牛肉特异性beef基因扩增引物见表1：
表1内参ref基因及牛肉特异性beef基因扩增引物
Figure BDA0002991889750000061
本实施例用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按照说明书操作分别提取黄牛肉、牦牛肉、水牛肉、麻辣牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组DNA。以提取的DNA为模板，用本实施例设计的引物分别进行PCR扩增，以验证本实施例设计的引物对靶基因的选择性。ref引物和beef引物的SYBR green试剂扩增曲线及熔解度曲线见附图2，结果表明，本实施例设计的beef引物能够特异性扩增黄牛肉、牦牛肉和麻辣牛肉基因组中的PDE基因，且未发现非特异性扩增；ref引物能够特异性扩增黄牛肉、牦牛肉、水牛肉、麻辣牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组中的GDF8基因，且未发现非特异性扩增。说明本研究设计的beef引物和ref引物能够特异性扩增靶基因，且靶基因在目标样品中存在，引物选择性符合实验要求。
由于目前尚无用于构建标准定量准确的标准品，本研究前期设计拟采用不依赖标准曲线的Ct值比较法分析样品中beef基因和ref基因的相对含量。见附图3，通过PCR扩增体系优化，当PCR体系中引物为浓度900nM，探针浓度为200nM时，beef基因的扩增效率为96.537％，ref基因的扩增效率为96.721％。使用优化的PCR反应条件分别扩增牛肉含量为50％的人工制备样品中beef基因和ref基因，比较两者Ct值，计算标准牛肉中牛源性成分含量。结果表明ref基因的量是beef基因的17倍，样品中牛源性成分含量为5.8％，实验结果不可靠。Ct值比较法的原理基础是beef基因和ref基因的Ct值之差ΔCt恒定不变。随着样品中牛肉含量的减少，beef基因减少，ref基因增加，导致ΔCt值随着牛肉含量的不同而变化，因此Ct值比较法用于相对定量分析结果不可靠，不能满足实验要求。
前期实验数据表明本研究拟采用的不依赖标准曲线的Ct值比较相对定量分析方法不适用，因而本实施例改用标准曲线相对定量分析方法对肉制品中牛源性成分进行定量分析。由于目前尚无准确标定牛源性成分含量的标准物质，因而本实施例为制备用于绘制标准曲线的标准品，将beef基因和ref基因串联后得beef-ref基因(图4)，beef-ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，克隆入pUC 57质粒中，成功制备了beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2，并将标准质粒转化入宿主细菌(E.coli TOP10)中形成了配套的标准菌株，见附图4，为本实施例的beef基因与ref基因串联策略示意图。
标准质粒pUC57-beef-ref的构建及鉴定方法见下文。本实施例将含有载体质粒pUC57的宿主大肠杆菌Top10过夜培养后，按照质粒提取试剂盒说明书提取载体质粒pUC57。beef-ref串联基因的双酶切体系如下：10×Q-Cut Buffer 5μl，EcoR I 1μl，Bgl II 1μl，beef-ref串联基因30μl，ddH2O 13μl，总体积50μl，混匀后置37℃酶切3h；取5μl酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果；胶回收试剂盒纯化酶切后的beef-ref串联基因；载体质粒pUC57的双酶切体系如下：10×Q-Cut Buffer 5μl，EcoR I 1μl，Bgl II 1μl，pUC5730μl，ddH2O 13μl，总体积50μl，混匀后置37℃酶切3h；取5μl酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果；胶回收试剂盒纯化酶切后的pUC57载体；beef-ref串联基因与pUC57载体的连接体系如下：beef-ref基因7μl，pUC571μl，T4 DNAligase 1μl，10×T4 DNAligase buffer 1μl，总体积10μl，混匀后置16℃连接过夜。
见附图1，利用本实施例构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(数字PCR法)，具体包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从-80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X-Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；
pUC57-beef-ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/mlAmp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef-ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57-beef-ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；
S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000081
之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：
p％＝bt÷rt×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数。
本实施例制备的标准质粒可应用于制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中。
本实施例使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒(DP103)，按照说明书操作提取构建的标准质粒，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按照说明书操作分别提取黄牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉基因组DNA。将提取的标准质粒及基因组DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司进行数字PCR检测，准确标定beef基因和ref基因拷贝数，见表2，结果表明，猪肉(16.36％)、羊肉(10.62％)、鸡肉(2.34％)、鸭肉(3.51％)在销售或DNA提取过程中存在不同程度的牛肉基因组DNA污染，可作为牛肉低水平含量样品进行后续方法比对实验。
表2标准质粒及样品基因组DNA数字PCR定标结果
Figure BDA0002991889750000091
实施例2：
见附图1，本实施例利用实施例1中构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(SYBR green染料法)，具体包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从-80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X-Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；
pUC57-beef-ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/ml Amp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef-ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57-beef-ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；
S2：提取步骤S1中的标准菌株中的标准质粒，以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照表3配制PCR扩增体系，按照表4中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
表3PCR扩增体系
Figure BDA0002991889750000101
表4PCR扩增程序
Figure BDA0002991889750000102
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000103
Figure BDA0002991889750000111
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
本实施例对上述方式制备的标准曲线的线性范围及线性进行了确认，利用上述方法绘制标准曲线，经6次实验分别统计beef基因和ref基因的相关系数(R2)值评价标准曲线性能。见表5，经检测，beef基因6次实验R2均值为0.9985，ref基因6次实验R2均值为0.9977，标准曲线R2总均值为0.9981，说明标准曲线性能符合实验要求。
表5标准曲线线性性能统计
Figure BDA0002991889750000112
见附图5，标准曲线分析结果表明，在beef基因和ref基因DNA最低浓度为100copies/μl时标准曲线线性R2为0.9981，线性符合实验要求，故本方法定量限为100copies/μl。当样品中beef基因和ref基因DNA浓度为10copies/μl时依然能够检测到DNA扩增，本方法检测限为10copies/μl。
根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％的8份样品。采用前期研究确定的实验条件检测8份样品中牛肉含量，用beef基因含量为100.83％的标准牛肉样品校正测量值，每份样品重复6次测量，以校正测量值对约定参考值(牛肉理论含量)的偏差作为本方法正确度的评价指标。见表6，实验结果表明，各样品6次测量的偏差均值在1.88％～7.68％之间，偏差总均值为4.78％，本方法正确度符合实验要求。
根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％、100％的9份样品，采用本研究前期确定的实验条件，重复测量9份样品中beef基因和ref基因拷贝数，每份样品重复测量3次，每次3个平行，分别计算每次平行测量beef基因和ref基因拷贝数的相对标准偏差(RSD)及均值，评价本方法的重复性精密度。结果表明，beef基因的重复性测量精密度为9.96％，ref基因的重复性测量精密度为9.29％，总平均重复性精密度为9.62％，本方法重复性精密度符合实验要求。
根据数字PCR定标结果，人工混合提取的DNA样品，制备牛肉含量分别为2.34％、3.51％、10.62％、16.36％、28.93％、40.17％、49.35％、80.28％的8份样品，采用本研究前期确定的实验条件，重复测量8份样品中牛肉校正含量，每份样品重复测量3次，每次3个平行，计算每份样品牛肉校正含量的再现性测量相对标准偏差(RSD)及均值，评价本方法的再现性精密度。结果表明，本方法再现性精密度在7.9％～25.18％之间，平均再现性精密度为17.60％，符合实验要求。
表6 8份不同牛肉含量样品检测正确度结果统计
Figure BDA0002991889750000121
Figure BDA0002991889750000131
以质量分数计算肉源性成分含量时，要求样品中靶标DNA充分提取，以便将靶标DNA拷贝数与肉源性成分质量进行换算。不同肉制品肉源性成分、加工工艺、原辅料不同，导致不同样品DNA提取效率不相同，需要复杂的样品前处理以充分提高DNA提取效率。深加工肉制品中基质成分复杂，样品前处理过程并不能完全消除基质对DNA提取的干扰。本研究建立的牛源性成分定量分析方法，通过计算细胞中beef基因和ref基因的相对含量，检测样品中牛肉源性成分含量，不要求100％的DNA提取效率，仅要求样品中不同肉源性成分DNA提取效率相同。基质对样品中所有肉源性DNA提取的干扰是等效的，当样品中牛肉DNA提取效率降低时，其他肉源性成分DNA的提取效率同时降低。本研究在鲜牛肉、香辣牛肉干中掺入不同比例的猪肉，制备牛肉含量为15％左右和85％左右的检测样品，由两名实验员，重复3次提取检测样品DNA，评价DNA提取效率对本方法的影响。实验结果表明，与鲜牛肉相比深加工手撕牛肉干(香辣味)样品的DNA提取效率显著降低，但对定量结果影响不显著；含有不同比例的猪肉成分样品DNA提取效率对定量结果影响不显著(表7)。基质对定量结果影响的总体偏差为12.73％，符合实验要求。
表7不同牛肉含量样品DNA提取效率对结果的影响统计
Figure BDA0002991889750000132
本实施例为测试本方法对实际样品的检测能力，本实施例购买市售鲜牛肉(n＝13)、麻辣牛肉(n＝1)、牛排(n＝6)、牛肉粒(n＝5)、牛丸(n＝4)、牛肉卷(n＝1)样品共30份样品，用本方法对样品中牛源性成分含量进行定量检测分析。检测结果表明，13份牛肉样品中，当样品DNA提取效率太低(牛肉4、牛肉5、牛肉11)，beef基因拷贝数接近定量限时，定量结果不可靠；其余10份牛肉样品定量偏差≤25％。6份牛排样品中，有2份(牛排4、牛排5)牛肉含量＜50％，存在掺假问题。5份牛肉粒样品中，牛肉含量在4.57％～41.55％之间，均存在掺假问题。4份牛丸样品中，均不含有牛肉成分，存在掺假问题。1份牛肉卷样品中，牛肉含量为73.09％，有可能掺假。
参考国际食品法典《检测、鉴定和量化食品中特定基因序列和蛋白质的执行标准和方法确认准则CAC/GL 74-2010》、欧盟GMO网络实验室发布的(European Network ofGMOLaboratories,ENGL)《GMO检测分析方法最低性能要求-2015(Definition of MinimumPerformance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing-2015)》和《GMO检测分析方法验证--实验室内部方法确认第二版-2017(Verification of analyticalmethods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methodsVersion 2-2017)》中关于PCR方法确认的指导原则，对本方法的检测限、定量限、选择性、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究，同时利用该方法对实际样品进行了检测。结果数据显示，本方法性能指标符合实验要求，样品检测结果稳定可靠，初步建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法。
本实施例针对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究，同时利用该方法对实际样品进行了检测。初步建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了技术支撑。
实施例3：
见附图1，本实施例利用实施例1中构建的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法(Taqman探针法)，具体包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株，具体方法如下：从-80℃冰柜中取出大肠杆菌Top10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，混匀后冰上静置30min，42℃热激90s，取出置冰浴中静置2min；加入37℃预热的1ml LB液体培养基(不含Amp抗生素)，上下颠倒混匀后，置37℃、160rpm条件下振荡培养1h；取200μl转化的感受态细胞，涂布于含100μg/mlAmp的LB固体培养皿中(含X-Gal)；37℃倒置培养，12h后观察结果；
pUC57-beef-ref质粒阳性转化子的鉴定：挑取白色单菌落于含100μg/mlAmp的液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜培养；离心收集部分菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组菌质粒；以提取质粒为模板，用beef上游引物和ref下游引物扩增beef-ref串联基因；配制如下PCR扩增体系：SYBR green Mix10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；之后用SYBR green试剂进行PCR扩增，扩增程序如下：55℃2min；95℃15s；95℃15s；95℃10min；60℃1min，信号采集，40循环；60℃1min，0.05℃/s升温至95℃，信号采集；将验证正确的重组质粒命名为pUC57-beef-ref，取部分交由上海生工公司测序鉴定；
S2：提取步骤S1中的标准菌株中的标准质粒，以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照表8配制PCR扩增体系，按照表9中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
表8PCR扩增体系
Figure BDA0002991889750000151
表9PCR扩增程序
Figure BDA0002991889750000152
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：
Figure BDA0002991889750000161
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
本实施例对上述方式制备的标准曲线的线性范围及线性进行了确认，见表10，并对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度进行了分析，数据结果见表11。
表10标准曲线线性性能统计
Figure BDA0002991889750000162
表11方法性能统计
Figure BDA0002991889750000163
Figure BDA0002991889750000171
本实施例针对方法的选择性、检测限、定量限、正确度、重复性精密度、再现性精密度、线性范围、线性、DNA提取效率影响等方法学性能开展了方法确认研究。建立了深加工肉制品中牛源性成分定量分析方法，能够定量分析样品中牛源性成分含量，满足了食品检测领域对肉制品中肉源性成分定量分析的需求，能够有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了技术支撑。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 四川省食品药品检验检测院
<120> 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用
<130> 20210306
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcactc ctacccatca tgcagattct aacatcagga tttttgctgc atttgcttca 60
tctgtccttt tagagttttc tttttttctt agctgaaata tttaaaaaca aagctttcta 120
gattgtgcaa atcctgagac tcatcaaacc catgaaagac ggtacaaggt atactggaat 180
ccgatctctg aaacttgaca tgaacccagg cactggtata gatct 225
<210> 2
<211> 2896
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cactcctacc catcatgcag 420
attctaacat caggattttt gctgcatttg cttcatctgt ccttttagag ttttcttttt 480
ttcttagctg aaatatttaa aaacaaagct ttctagattg tgcaaatcct gagactcatc 540
aaacccatga aagacggtac aaggtatact ggaatccgat ctctgaaact tgacatgaac 600
ccaggcactg gtatagatct ggatcccggg cccgtcgact gcagaggcct gcatgcaagc 660
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 720
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 780
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 840
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 900
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 960
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1020
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1080
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1140
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1200
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1260
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1320
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1380
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 1440
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 1500
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 1560
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 1620
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 1680
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 1740
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 1800
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1860
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1920
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1980
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 2040
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 2100
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 2160
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 2220
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 2280
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 2340
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 2400
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 2460
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 2520
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 2580
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 2640
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 2700
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 2760
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 2820
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2880
acgaggccct ttcgtc 2896

Claims (7)

1.一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，其特征在于，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef-ref基因，beef-ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef-ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef-ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述的制备方法制备的标准质粒。
3.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：
Figure FDA0002991889740000011
之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：
p％＝bt÷rt×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。
5.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
PCR扩增体系
Figure FDA0002991889740000021
PCR扩增程序
Figure FDA0002991889740000022
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：
Figure FDA0002991889740000023
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
6.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102-108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，按照下表中的PCR扩增程序用Taqman试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
PCR扩增体系
Figure FDA0002991889740000031
PCR扩增程序
Figure FDA0002991889740000032
S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：Taqman master Mix 10μl，900nM上游引物1μl，900nM下游引物1μl，200nM探针1μl，模板1μl，ddH2O 6μl；扩增程序见下表：
Figure FDA0002991889740000033
之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
p％＝k×(bt÷rt)×100
其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；bt为样品中beef基因绝对拷贝数；rt为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝bs÷rs，其中bs为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，rs为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。
7.权利要求2所述的标准质粒在制备检测肉制品中牛源性成分含量的试剂盒中的应用。
CN202110317748.4A 2021-03-25 2021-03-25 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 Active CN113088531B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110317748.4A CN113088531B (zh) 2021-03-25 2021-03-25 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110317748.4A CN113088531B (zh) 2021-03-25 2021-03-25 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113088531A true CN113088531A (zh) 2021-07-09
CN113088531B CN113088531B (zh) 2023-10-17

Family

ID=76669936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110317748.4A Active CN113088531B (zh) 2021-03-25 2021-03-25 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113088531B (zh)

Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2377402A1 (en) * 2003-05-01 2011-10-19 Medgenics, Inc. A genetically modified dermal micro-organ expressing interferon
CN102242192A (zh) * 2011-05-04 2011-11-16 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒、试剂盒及该质粒的构建方法
CN102634581A (zh) * 2012-04-05 2012-08-15 上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 牦牛源性纤维成分荧光定量pcr定性检测方法
AU2013200516A1 (en) * 2006-07-12 2013-02-21 University Of Tennessee Research Foundation Substituted Acylanilides and Methods of Use Thereof
CN103773847A (zh) * 2013-12-10 2014-05-07 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种食品及饲料中牛源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用
CN105274246A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 华中农业大学 牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
CN105274099A (zh) * 2015-10-23 2016-01-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用
CN105648087A (zh) * 2016-03-07 2016-06-08 苏州百源基因技术有限公司 一组用于牛源性实时荧光pcr检测的特异性引物和探针
CN105950717A (zh) * 2016-04-28 2016-09-21 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒
CN106148509A (zh) * 2016-06-01 2016-11-23 山东省食品药品检验研究院 一种动物源性成分的肉类检测技术和方法
WO2017098187A1 (fr) * 2015-12-09 2017-06-15 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
CN107043818A (zh) * 2017-04-06 2017-08-15 西北民族大学 一种基于实时荧光pcr定量检测肉制品猪源性成分的方法
CN107130014A (zh) * 2016-02-29 2017-09-05 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法
CN107338316A (zh) * 2017-08-23 2017-11-10 山东省食品药品检验研究院 牛源性成分pcr检测用阳性标准分子、制备及检测方法
WO2017201527A2 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 President And Fellows Of Harvard College Gene therapy methods for age-related diseases and conditions
CN107586853A (zh) * 2017-09-12 2018-01-16 苏州博尔达生物科技有限公司 基于rpa技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用
CN107974513A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 西北民族大学 一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
CN108504747A (zh) * 2018-04-03 2018-09-07 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于数字pcr方法检测肉制品中牛源性成分含量的方法
CN109517902A (zh) * 2018-11-28 2019-03-26 无锡市食品安全检验检测中心 一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测牛肉成分的方法
CN109777819A (zh) * 2019-01-14 2019-05-21 深圳鑫泰康生物科技有限公司 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组cva16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用
CN110343766A (zh) * 2018-04-03 2019-10-18 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于qpcr定量检测畜禽肉中牛源性成分的方法
CN111088367A (zh) * 2019-12-30 2020-05-01 浙江省农业科学院 鸭源性il-2基因dna标准物质及其用途
CN111808887A (zh) * 2020-09-10 2020-10-23 中国农业大学 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法
CN112921103A (zh) * 2021-03-25 2021-06-08 四川省食品药品检验检测院(四川省药品质量研究所、四川省医疗器械检测中心) 定量分析肉制品中牛源性成分的引物组及其应用
CN114540540A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 北京民海生物科技有限公司 检测重组cva10疫苗外源基因拷贝数的标准质粒及其制法和应用

Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2377402A1 (en) * 2003-05-01 2011-10-19 Medgenics, Inc. A genetically modified dermal micro-organ expressing interferon
AU2013200516A1 (en) * 2006-07-12 2013-02-21 University Of Tennessee Research Foundation Substituted Acylanilides and Methods of Use Thereof
CN102242192A (zh) * 2011-05-04 2011-11-16 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒、试剂盒及该质粒的构建方法
CN102634581A (zh) * 2012-04-05 2012-08-15 上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 牦牛源性纤维成分荧光定量pcr定性检测方法
CN103773847A (zh) * 2013-12-10 2014-05-07 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种食品及饲料中牛源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用
CN105274099A (zh) * 2015-10-23 2016-01-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用
CN105274246A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 华中农业大学 牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒
WO2017098187A1 (fr) * 2015-12-09 2017-06-15 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
CN107130014A (zh) * 2016-02-29 2017-09-05 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法
CN105648087A (zh) * 2016-03-07 2016-06-08 苏州百源基因技术有限公司 一组用于牛源性实时荧光pcr检测的特异性引物和探针
CN105950717A (zh) * 2016-04-28 2016-09-21 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒
WO2017201527A2 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 President And Fellows Of Harvard College Gene therapy methods for age-related diseases and conditions
CN106148509A (zh) * 2016-06-01 2016-11-23 山东省食品药品检验研究院 一种动物源性成分的肉类检测技术和方法
CN107043818A (zh) * 2017-04-06 2017-08-15 西北民族大学 一种基于实时荧光pcr定量检测肉制品猪源性成分的方法
CN107338316A (zh) * 2017-08-23 2017-11-10 山东省食品药品检验研究院 牛源性成分pcr检测用阳性标准分子、制备及检测方法
CN107586853A (zh) * 2017-09-12 2018-01-16 苏州博尔达生物科技有限公司 基于rpa技术检测牛源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用
CN107974513A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 西北民族大学 一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
CN108504747A (zh) * 2018-04-03 2018-09-07 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于数字pcr方法检测肉制品中牛源性成分含量的方法
CN110343766A (zh) * 2018-04-03 2019-10-18 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于qpcr定量检测畜禽肉中牛源性成分的方法
CN109517902A (zh) * 2018-11-28 2019-03-26 无锡市食品安全检验检测中心 一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测牛肉成分的方法
CN109777819A (zh) * 2019-01-14 2019-05-21 深圳鑫泰康生物科技有限公司 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组cva16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用
CN111088367A (zh) * 2019-12-30 2020-05-01 浙江省农业科学院 鸭源性il-2基因dna标准物质及其用途
CN111808887A (zh) * 2020-09-10 2020-10-23 中国农业大学 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法
CN114540540A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 北京民海生物科技有限公司 检测重组cva10疫苗外源基因拷贝数的标准质粒及其制法和应用
CN112921103A (zh) * 2021-03-25 2021-06-08 四川省食品药品检验检测院(四川省药品质量研究所、四川省医疗器械检测中心) 定量分析肉制品中牛源性成分的引物组及其应用

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.IWOBI 等: "A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat", 《FOOD CHEMISTRY》 *
A.IWOBI 等: "A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat", 《FOOD CHEMISTRY》, 8 August 2014 (2014-08-08), pages 306 *
周李华 等: "牛源性成分核酸检测方法研究进展及技术标准分析", 《中国测试》 *
周李华 等: "牛源性成分核酸检测方法研究进展及技术标准分析", 《中国测试》, 31 December 2017 (2017-12-31) *
沙才华 等: "Taqman荧光PCR法检测肉制品中牛源性成分及定量研究", 《中国动物检疫》 *
沙才华 等: "Taqman荧光PCR法检测肉制品中牛源性成分及定量研究", 《中国动物检疫》, 7 December 2016 (2016-12-07) *
王旭东等: "yeaI基因对奶牛源大肠杆菌NJ17生物学特性的影响", 《微生物学报》 *
王旭东等: "yeaI基因对奶牛源大肠杆菌NJ17生物学特性的影响", 《微生物学报》, no. 10, 11 July 2020 (2020-07-11) *
王行 等: "内参基因加标法定量土壤微生物目标基因绝对拷贝数", 《微生物学通报》 *
翟清燕 等: "两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立", 《食品研究与开发》 *
翟清燕 等: "两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立", 《食品研究与开发》, 20 May 2018 (2018-05-20) *
苗丽等: "肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用", 《肉类研究》 *
苗丽等: "肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用", 《肉类研究》, no. 09, 30 September 2015 (2015-09-30) *
赵新 等: "基于单拷贝核基因的数字PCR定量 检测肉制品中羊源性成分", 《食品工业科技》 *
郭颖慧 等: "3种动物源性成分阳性质粒构建及检测研究", 《食品研究与开发》 *
郭颖慧 等: "3种动物源性成分阳性质粒构建及检测研究", 《食品研究与开发》, 20 March 2018 (2018-03-20) *
金鹭等: "基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量", 《食品与发酵工业》 *
金鹭等: "基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量", 《食品与发酵工业》, no. 08, 20 January 2020 (2020-01-20) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113088531B (zh) 2023-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109735479B (zh) 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
US20050260625A1 (en) Process and system for crosslinking polynucleotide molecules
CN107190001A (zh) 一种基因合成方法
CN100510107C (zh) 一种分子量内标的制备方法及用该方法制备的分子量内标
CN107988202B (zh) 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN113088531B (zh) 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用
CN113215155A (zh) 一种针对表位点为flyalalll的tcr所设计的引物及其应用
CN113388612A (zh) 一种针对表位点为iyvlvmlvl的tcr所设计的引物及其应用
CN110331164B (zh) Lilra3基因敲入小鼠的打靶载体和lilra3基因敲入小鼠的构建方法
CN115247166A (zh) 一种蛋白酶突变体
CN113308466A (zh) 一种针对表位点为tygpvfmsl的tcr所设计的引物及其应用
CN109706149B (zh) 一种改进的16S-seq方法及其应用
CN116064728A (zh) 一种染色体外环状dna的建库以及测序方法
CN113943782B (zh) 一种评估水体中2-甲基异莰醇浓度的方法
US6708119B2 (en) Method and apparatus for automatically removing vector unit in DNA base sequence
CN111378677A (zh) 一种dna组装的方法及其应用
CN110777146A (zh) 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法
CN116497052A (zh) 一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法
Archambault Building an Improved Suicide Vector for Creating Mutations in Specific Genes
CN115521937A (zh) 一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用
CN112359059B (zh) 用于表达rFC蛋白的84E突变载体及其制备方法和应用
KR101901990B1 (ko) 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하는 방법
US20030213009A1 (en) Promoter and intron from maize actin depolymerizing factor
GGCGAAACCCGACAGGACTA Supplementary data Table S1-S9
CN112342240B (zh) 用于表达rFC蛋白的59R突变载体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 611731 No.8 Xinwen Road, high tech West District, Chengdu, Sichuan

Applicant after: Sichuan Institute of drug inspection (Sichuan Medical Device Testing Center)

Address before: 611731 No.8 Xinwen Road, high tech West District, Chengdu, Sichuan

Applicant before: Sichuan Food and Drug Inspection and Testing Institute (Sichuan Institute of Pharmaceutical Quality and Sichuan Medical Device Testing Center)

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant