CN108504747A - 一种基于数字pcr方法检测肉制品中牛源性成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于数字PCR方法检测肉制品中牛源性成分含量的方法。该方法应用生物信息学手段，从15种动物基因组序列中筛选单拷贝基因序列，设计内参引物和牛源种属特异性引物。该方法基于微滴数字PCR技术对肉制品中的牛源性成分含量进行绝对定量分析，无需标准品，无需构建标准曲线，弥补了部分标准品不易获取的缺陷，同时也有效避免了标准品与样品之间的工艺差异产生的量值偏差，进而应用内参基因校正牛源种属特异性基因的百分含量，获得真实可信的食品掺假数值。本发明的检测方法在3h之内即可完成牛源性成分含量鉴定工作，具有简单易行、高效灵敏等特点，为动物源成分量化掺伪鉴定开辟了广阔前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学分析领域，具体涉及肉制品中牛源性成分含量的鉴定方法，是一种在实时荧光定量PCR技术基础上利用内参基因校正牛源种属特异性基因对牛源性成分进行定量检测的方法。
背景技术
多源化的肉类品种是人们餐桌文化日趋丰富的重要组成部分，然而随着市场上牛肉价格的不断大幅上涨，部分不法企业及商贩，为了自身经济利益的最大化，在高成本的牛肉或牛肉中掺入低廉的其他肉类品种，或通过牛油浸泡、作料添加等方式处理后冒充牛肉进行销售。
因此，大力提高市场监管水平，配合营养标签制度的顺利实施，适时修订和完善技术标准，依据掺假轻重情节(即掺假量化数值)针对性地加大处罚及治理力度，稳定市场秩序已显得尤为重要，然而，要想达到及时有效的市场监管效果，快速、精准、量化的肉类鉴别方法是必不可少的关键技术手段。
传统的肉类鉴别方法对熟肉制品的检测有很大的局限性，如耗时长、操作繁琐、无法鉴别近缘品种、不能量化样品中异源动物成分含量等问题。在所有动物源性成分的检验技术中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术广泛应用于肉及肉制品的定性检测，特别是荧光定量PCR，不但能用于定性检测，还可以根据反应中的循环数Ct值与初始DNA模板浓度进行相对定量。但由于实时荧光定量PCR是一种相对定量技术，必须依赖于标准曲线和标准物质进行定量分析，而标准物质的种类有限、昂贵价格不能满足所有试验的需求，使得动物源成分定量技术还需进一步完善。
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，将含有DNA或RNA的PCR反应体系分成约20000个微滴，经PCR扩增后，逐个对每个微滴反应进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，然后用终点法PCR、泊松分布和阳性微滴的个数与比例计算出样品的起始拷贝数。由于其不需要建立标准曲线，在低浓度的核酸含量下，也可高度灵敏和准确的对核酸的拷贝数进行绝对定量，使得ddPCR技术广泛用于基因表达分析、拷贝数变异分析、致病菌检测、转基因食品检测等，具有较好的应用前景。同时引入合适的内参基因对肉源品种的整体DNA损伤程度和提取效率进行监控，校正外源目的基因百分含量，消除量值结果的偏差，由此获得真实可信的食品掺假数值，有效提高检测方法的灵敏度和准确性。
本发明旨在建立鲜冻畜、禽肉中牛源性成分的定量检测方法，该方法简单易行、高效灵敏、便于推广，为动物源成分量化掺伪鉴定提供科学可靠的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于克服传统的肉类鉴别方法耗时长、操作繁琐、不能量化样品中异源动物成分含量等缺点，公开了一种应用内参基因快速检测肉制品中牛源性成分含量的方法。本发明的牛源性成分含量鉴定方法具有简单易行、高效灵敏、便于推广等优势。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于鉴定牛源性成分含量的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因Ref-1引物正向序列：5′-AATGATGCACCTTGTGAAGATGA-3′，Ref-1反向序列：5′-CCCCTCAAAACCCAGTTCTCT-3′，Ref-1探针序列：5′-FAM-AAAAGGCATTTGGTTGCG-MGB-3′；牛源种属特异性基因Cattle-3引物正向序列：5′-GACAGAATTCATCTTTCAGG-3′，Cattle-3反向序列：5′-CCAGAGCTACAAGTGATG-3′，Cattle-3探针序列：5′-FAM-CTCCAGGTCCTCTTCTTCAGCC-BHQ1-3′；
本发明所述快速检测牛源性成分含量的方法，该方法以供试样品基因组DNA为模板，应用内参基因校正牛源种属特异性基因计算牛源性成分含量，其包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的内参基因PCR引物和探针及ddPCR Supermix forprobes预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；
微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；
PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
(2)微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。
本发明所述的检测方法，公式中A为牛源性成分种属特异性基因百分含量，B为Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度，C为Ref-1内参基因的拷贝数浓度，D为牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细说明。
1、原理
首先在GeneBank上搜索牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的基因组序列信息，应用生物信息学分析筛选15种动物共有的种间保守区域，筛选单拷贝基因序列设计一对通用引物，通用引物可同时扩增牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等多种动物源性DNA；同时分析筛选牛种属特异性区域，筛选单拷贝基因序列设计一对特异性引物，特异性引物只能扩增牛源性DNA。采用微滴数字PCR技术，根据每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，按照公式进行计算，从而对肉制品中牛源性成分进行定量检测。
2、引物设计
本发明依据牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的DNA特征序列的种间保守区域和种内特异性区域设计1对PCR扩增内参基因和1对牛源种属特异性引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
3、反应条件
采用内参基因PCR引物和探针及ddPCR Supermix for probes预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；
微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；
PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
4、计算试样中牛源性成分种属特异性基因含量
将牛源性成分种属特异性基因Cattle-3的拷贝数浓度和内参基因Ref-1的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：
A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，
式中：
A—试样中牛源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；
B—Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度；
C—Ref-1内参基因的拷贝数浓度；
D—牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
附图说明:
图1盲样S1牛源性成分含量扩增结果图。
图2盲样S2牛源性成分含量扩增结果图。
图3盲样S3牛源性成分含量扩增结果图。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。试样模板DNA的提取：SDS-硅胶柱改良法提取(见附件)。
实施例1
(1)样品S1：牛源性成分为70％的自制模拟混合样品，混合方式70g牛肉+30g马肉。
(2)试剂：伯乐公司生产的ddPCR Supermix for probes预混液；上海生工合成的内参基因和牛源种属特异性基因扩增引物和探针。
(3)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
(4)微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。将Cattle-3牛源性成分种属特异性基因的拷贝数浓度和Ref-5内参基因的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量为57.14％，结果如图1。计算试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量的公式：
A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，
式中：
A—试样中牛源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；
B—Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度；
C—Ref-1内参基因的拷贝数浓度；
D—牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
表2盲样S1测试结果
实施例2
(1)样品S2：牛源性成分为30％的自制模拟混合样品，混合方式30g牛肉+70g鸡肉。
(2)试剂：伯乐公司生产的ddPCR Supermix for probes预混液；上海生工合成的内参基因和牛源种属特异性基因扩增引物和探针。
(3)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
(4)微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。将Cattle-3牛源性成分种属特异性基因的拷贝数浓度和Ref-1内参基因的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量为33.41％，结果如图2。计算试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量的公式：
A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，
式中：
A—试样中牛源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；
B—Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度；
C—Ref-1内参基因的拷贝数浓度；
D—牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
表3盲样S2测试结果
实施例3
(1)样品S3：牛源性成分为30％的自制模拟混合样品，混合方式30g牛肉+70g猪肉。
(2)试剂：伯乐公司生产的ddPCR Supermix for probes预混液；上海生工合成的内参基因和牛源种属特异性基因扩增引物和探针。
(3)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
(4)微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。将Cattle-3牛源性成分种属特异性基因的拷贝数浓度和Ref-1内参基因的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量为37.39％，结果如图3。计算试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量的公式：
A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，
式中：
A—试样中牛源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；
B—Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度；
C—Ref-1内参基因的拷贝数浓度；
D—牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
表4盲样S3测试结果
附件：SDS-硅胶柱改良法提取肉制品DNA
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
序列表
<110> 天津市农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种基于数字PCR方法检测肉制品中牛源性成分含量的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatgcac cttgtgaaga tga 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccctcaaaa cccagttctc t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaggcatt tggttgcg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacagaattc atctttcagg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagagctac aagtgatg 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccaggtcc tcttcttcag cc 22
Claims (3)
1.用于鉴定牛源性成分含量的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因Ref-1引物正向序列：5′-AATGATGCACCTTGTGAAGATGA-3′，Ref-1反向序列：5′-CCCCTCAAAACCCAGTTCTCT-3′，Ref-1探针序列：5′-FAM-AAAAGGCATTTGGTTGCG-MGB-3′；牛源种属特异性基因Cattle-3引物正向序列：5′-GACAGAATTCATCTTTCAGG-3′，Cattle-3反向序列：5′-CCAGAGCTACAAGTGATG-3′，Cattle-3探针序列：5′-FAM-CTCCAGGTCCTCTTCTTCAGCC-BHQ1-3′。
2.一种采用权利要求1所述内参基因和牛源种属特异性基因，快速鉴定牛源性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的内参基因PCR引物和探针及ddPCR Supermix for probes预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×ddPCR Supermix for probes预混液10μL，上下游引物各1.0μL(浓度为10μmol/L)，探针引物1.0μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1.0μL(浓度为30/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL，混匀后离心；
微滴生成：将20μL反应体系小心转移至微卡发生器，切忌产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入重油70μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后吸取40μL反应产物，小心转移至数字PCR96孔反应板中，170℃热封；
PCR扩增程序：设定PCR仪爬坡速度设置为2℃/s，循环参数为：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。
(2)微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，计算出试样中牛源性成分种属特异性基因百分含量。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，公式中A为牛源性成分种属特异性基因百分含量，B为Cattle-3牛源种属特异性基因的拷贝数浓度，C为Ref-1内参基因的拷贝数浓度，D为牛源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为牛基因组大小/掺入动物基因组大小。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113088531A (zh) * | 2021-03-25 | 2021-07-09 | 四川省食品药品检验检测院(四川省药品质量研究所、四川省医疗器械检测中心) | 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 |
-
2018
- 2018-04-03 CN CN201810285792.XA patent/CN108504747A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN113088531A (zh) * | 2021-03-25 | 2021-07-09 | 四川省食品药品检验检测院(四川省药品质量研究所、四川省医疗器械检测中心) | 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 |
| CN113088531B (zh) * | 2021-03-25 | 2023-10-17 | 四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心) | 牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180907 |