CN105177150A - 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法 - Google Patents

一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，包括如下步骤：以待检样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物对II和引物对III组成的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种或多种。本发明所述多重PCR检测方法能快速、高特异性检测猪羊牛肉制品的真伪及是否有掺假，大大提高检测效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪羊牛制品的快速防伪鉴定。此外，本发明所设计的多重PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。

Description

一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法。
背景技术
民以食为天，食以安为先，吃放心健康绿色的肉类制品是食品质量安全的一个重要方面。但是，在动物源性原料和加工产品中，经常出现动物成分的掺假造假掺杂和无意污染现象。国内市场近期曝光的多起肉类掺假事件引发了公众对食品安全的担忧。即使是“拥有世界上最严格食品安全制度”的欧洲，亦难免出现“挂牛头卖马肉”的造假现象，值得人们深思。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分鉴别技术的研究逐步成为食品安全领域的研究热点。
许多领域急需标准化的准确快速检测方法，比如超市里面的羊、牛肉卷是否掺杂了猪肉，在真皮制品选购方面皮革制品是否为真皮。特别是一些涉及宗教饮食禁忌方面的食物，极其容易引发民族矛盾，影响安定团结。着眼点放在食品中动物源性肉及肉制品成分种类识别技术上，研究动物源性肉及肉制品安全检测技术，建立快速、准确的高通量的检测方法，对食品进行动物源性肉及肉制品成分鉴定，对加工肉制品的质量进行把关，有利于维护消费者利益，保障人民生命安全，避免假冒伪劣食品的出现，为打击此类违法行为提供技术支撑，也有利于肉类产业的健康发展。
目前，为了确定肉及肉制品的真实性，已经研发出了包括基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时定量PCR和分子指纹技术，基于蛋白质分子结构的免疫分析技术，红外光谱技术以及质谱技术等动物源性成分鉴别方法。基于动物种属间遗传信息的差异，从核酸分子水平上对动物进行肉种鉴定以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分研究的最有效手段，作为鉴别的检测靶点而被广泛使用。
以检测DNA为基础的方法主要有：核酸探针杂交、PCR-RFLP分析、DNA指纹分析、PCR特异扩增。其中，PCR特异扩增法最为简便、准确、灵敏，在实际检测中应用最为广泛，其它分析法由于操作难度大，在实际检测中较少应用。
针对动物源性食品中存在的问题，我国近些年也加强了肉类安全性的认识，制定了《传染病防治法》、《动物防疫法》、《食品卫生法》、《进出口商品检验法》等相关的法律法规。2007年以来，国家标准化管理委员会颁布了关于动物源饲料中动物成分(牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、骆驼)定性检测国家标准。这些检测标准目前主要集中在利用传统的常规PCR技术，只能对动物源性肉及肉制品进行单一种的定性检测。在肉类食品样本实际检测过程中，对于成分不明确或混合的加工制品，需要通过多次检测试验才能确定，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源性肉及肉制品的检测中，这类检测技术已经越来越不能胜任一次处理几种，甚至十几种动物源制品的特殊需要，尤其是大数量的加工产品进入商品化生产时，需要更有效的、快速的检测方法。
虽然多重常规PCR能同时检测几种动物成分，但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差，短的片段会被有限扩增，在同源区的重组也会产生人工片段。因此，多重PCR方法存在两个主要缺陷：一是大量的引物同时存在于一个体系，容易引起非特异性的扩增；二是由于扩增效率的差异还会导致其中部分目标分子优先扩增。随着添加的引物对数的增加，以及循环数的增加，这些缺陷所带来的限制会表现的更加明显。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，快速且高特异性检测猪、羊、牛肉制品的真伪及鉴定是否有掺假，大大提高检测效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪、羊、牛制品的快速防伪鉴定。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系，包括如下引物对I、引物对II和引物对III中：
(1)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对I：
正向引物：5’-CTACATAAGATATCCACCACA-3’；
反向引物：5’-ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3’；
(2)对羊细胞色素c氧化酶亚基III(cytochromecoxidasesubunitIII)基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对II：
正向引物：5’-TACACTGTACAGGCATCAG-3’；
反向引物：5’-CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3’；
(3)对牛TNFRSF10A基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对III：
正向引物：5’-CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3’；
反向引物：5’-CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3’。
本发明所述的一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其包括如下步骤：
1)以待检样品总DNA为模板，利用所述的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种或一种以上；
2)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分阳性；待检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分阳性；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检样品为牛源性成分阳性。
进一步，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行90-100℃下预变性5-20min，90-100℃变性20-60s，50-60℃退火30-60s，70-74℃延伸60-150s，进行30-60次循环，70-74℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后结束。
优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
优选的，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。
更优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
本发明通过分析猪、羊和牛3种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因(包括12SrRNA，cytochromecoxidasesubunitIII和TNFRSF10A)，进行序列测定及比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，本发明各物种的特异性引物对即引物对I、引物对II、引物对III的熔解温度相近，退火温度的梯度设置在引物理论熔解温度值上下5℃的范围内，猪、羊和牛3种动物特异性引物的选择是多重PCR在同一PCR体系与同一反应程序中高效扩增的关键技术，且扩增特异性片段大小不一且能够通过电泳分开，非常适合猪、羊、牛的多重PCR检测。
在多重PCR反应条件和体系中，退火温度过高会导致引物与模板不能稳定的结合，影响扩增效果。退火温度过低则导致引物与模板发生非特异性结合。退火温度的梯度设置在引物理论Tm值上下5℃的范围内。当引物浓度较小时扩增产物的量随着引物浓度的增加而增加，当引物浓度到达一个饱和值时，扩增产物的量不再随着引物浓度的增加而增加，而是基本保持不变。当引物过多时，会导致引物与模板发生非特异性结合，以及引物之间形成二聚体，影响扩增效果。引物浓度的饱和值和模板的量有关(模板的量越大，引物的饱和值越高)，也和引物与模板的结合能力、引物之间形成二聚体的能力有关，引物与模板的结合能力越强、形成二聚体越少，饱和值就越低，反之越高。
本发明所述多重PCR检测方法用于单物种总DNA模板进行猪、羊、牛的物种检测，且所述多重PCR检测方法用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的的物种检测。所述多重PCR检测方法尤其适用于检测猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。
本发明还提供一种含有本发明所述多重PCR引物体系的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测试剂盒。
本发明所述多重PCR检测试剂盒可以将本发明所述PCR引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中，所述相关试剂可以为本发明中所述PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明所述多重PCR检测试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。
本发明所述多重PCR试剂盒用于单物种总DNA模板进行猪、羊、牛的物种检测，且所述多重PCR试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的物种检测。所述试剂盒尤其适用于检测猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。
本发明的有益效果是：
1.本发明的多重PCR引物体系中的引物对均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此，使用本发明的多重PCR引物体系可以一次性检测猪、羊、牛3个动物物种，从而有效的缩短检测时间。
2.本发明所述多重PCR检测方法经一次PCR即可鉴别3种动物源性成分，不需要对每种动物源性成分分别进行确证检测，大大缩短了实验时间，加快了检出速度。本发明优化了特定PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的检测方式，尤其适用于猪、羊、牛制品的快速防伪鉴定。
3.本发明的多重PCR引物体系及PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较普通PCR更为快速、简便，可实现同时对3种动物源性成分的快速、准确、特异的检测和分析，从而有效的鉴定猪羊牛肉制品的真伪及掺假情况，为猪、羊、牛肉制品的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段。
4.本发明所述多重PCR引物体系配合相关试剂制成多重PCR试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。
附图说明
图1是本发明实施例中各种动物肉产品提取出的总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1：猪，2：羊，3：牛，4：鸡，5：鸭，6：狗，7：马，8：兔，M代表标准核酸分子量标签(15000为DNA标准分子量，自上向下依次为15kb，10kb，7500bp，5000bp，2500bp、1000bp和250bp)。
图2是本发明实施例1进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1：猪，2：羊，3：牛，4：鸡，5：鸭，6：狗，7：马，8：兔，N：空白对照，M代表标准核酸分子量标签(2000为DNA标准分子量，自上向下依次为15kb，10kb，7500bp，5000bp，2500bp、1000bp和250bp)。
图3是本发明实施例2进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1：羊，2：猪，3：牛，4：鸡，5：鸭，6：狗，7：马，8：兔，N：空白对照，M代表标准核酸分子量标签(2000为DNA标准分子量，自上向下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp和100bp)。
图4是本发明实施例3进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1：牛，2：猪，3：羊，4：鸡，5：鸭，6：狗，7：马，8：兔，N：空白对照，M代表标准核酸分子量标签(2000为DNA标准分子量，自上向下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp和100bp)。
图5是本发明实施例4以各物种总DNA样品按同体积混合后的混合总DNA样品为模板，使用各物种特异性引物分别与此混合总DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1和2：猪，3和4：牛，5和6：羊，7和8：猪+牛+羊，9和10：猪+牛，11和12：猪+羊，13和14：羊+牛，N：空白对照，M代表标准核酸分子量标签(2000为DNA标准分子量，自上向下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp和100bp)。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1以猪12SrRNA基因的引物对I作为引物进行PCR扩增
以各物种总DNA样品为总DNA模板，总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。由图1可知，各种动物样品提取的基因组DNA片段均一，条带清晰，为基于核酸水平的PCR反应的提供个良好的模板。
1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/μl，作为总DNA模板，并将引物稀释至10μmol/L。
2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水36μl，l0*PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I的正向引物1μl和10μM引物对I的反向引物1μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。
3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。
4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图2所示。
用猪的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1μlH2O代替DNA模板。由图2可知，猪肉样品DNA得到290bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无扩增产物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
实施例2以羊cytochromecoxidasesubunitIII基因的引物对II作为引物进行PCR扩增
1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/μl，作为总DNA模板，并将引物稀释至10μmol/L。
2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水36μl，l0*PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对III的正向引物1μl和10μM引物对III的反向引物1μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。
3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。
4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图3所示。
用羊的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1μlH2O代替DNA模板。由图3可知，羊肉样品DNA得到370bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无扩增产物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
实施例3以牛TNFRSF10A基因的引物对III作为引物进行PCR扩增
1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/μl，作为总DNA模板，并将引物稀释至10μmol/L。
2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水36μl，l0*PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对III的正向引物1μl和10μM引物对III的反向引物1μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。
3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。
4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图4所示。
用牛的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1μlH2O代替DNA模板。由图4可知，牛肉样品DNA得到190bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无扩增产物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
由实施例1-3可知，引物对I仅对猪物种具有特异性，引物对II仅对羊物种具有特异性，引物对III仅对牛物种具有特异性。
实施例4
以猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪羊牛每种动物的最终DNA浓度为50ng/μl，作为样品模板。
1)混合总DNA样品的处理：将猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪、羊、牛每种动物的最终DNA浓度为50ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L。
总DNA样品的不同组合为：猪，羊，牛，猪+羊，猪+牛，羊+牛，猪+牛+羊。
2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水32μl，l0*PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III的正向引物各1μl和10μM引物对I、引物对II、引物对III的反向引物各1μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。
3)PCR反应程序的制定：同实施例1。
4)2wt.％琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图5所示。
用猪、羊、牛的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增7种不同组合的基因组，空白对照用1μlH2O代替DNA模板，每个反应重复2次。由图5可知，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，很好的验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。
实施例5猪羊牛动物源性成分检测的多重PCR检测试剂盒
根据上述实施例1-3和实施例4中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，用于对猪羊牛物种检测及相关肉产品的真伪及掺假鉴定。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (10)

1.一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系，其包括如下引物对I、引物对II和引物对III：
1)针对猪12SrRNA基因设计引物对I：
正向引物：5’-CTACATAAGATATCCACCACA-3’；
反向引物：5’-ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3’；
2)对羊细胞色素c氧化酶亚基III基因设计引物对II：
正向引物：5’-TACACTGTACAGGCATCAG-3’；
反向引物：5’-CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3’；
3)对牛TNFRSF10A基因设计引物对III：
正向引物：5’-CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3’；
反向引物：5’-CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3’。
2.一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其包括如下步骤：
1)以待检样品总DNA为模板，利用如权利要求1所述的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所待检述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种或一种以上；
2)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分；待检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检样品为牛源性成分。
3.根据权利要求2所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
4.根据权利要求2或3所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
5.根据权利要求2所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行90-100℃下预变性5-20min，90-100℃变性20-60s，50-60℃退火30-60s，70-74℃延伸60-150s，进行30-60次循环，70-74℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后结束。
6.根据权利要求2或5所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。
7.如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在用于单物种总DNA模板进行猪、羊或牛的物种检测中的应用。
8.如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的多重物种检测中的应用。
9.如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定中的应用。
10.一种含有如权利要求1所述多重PCR引物体系的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测试剂盒。
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