CN101962675A

CN101962675A - 多重pcr检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN101962675A
Application number: CN2010102391800A
Authority: CN
Inventors: 乔建军; 孙艳华; 张智禹; 关丛笑
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: CN101962675B

Abstract

本发明公开了一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒，多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，本发明的引物组可以应用于多重PCR技术检测食品中肉类来源。本发明的试剂盒可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重PCR方法更是缩短了检测的时间，提高了检测的效率，将多重PCR方法应用于食品检测领域。

Description

多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及检测试剂盒。

背景技术

目前的肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉充猪肉，以猪肉充牛肉等，用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，这极大的损坏了消费者的利益和健康。由于国家没有规定统一的肉类检测方法，也没有形成成熟、快速简便的检测肉类来源的行业方法，目前质监部门主要是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别工作，这些传统鉴别方法对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用。但是，对于很多熟肉制品(如香肠)来说，加入的肉经过了粉碎处理，并且添加了香料掩盖了原有的味道，传统的方法难以进行准确的肉类来源鉴定。

目前，市场上经过加工的熟肉制品质量越来越难以鉴定，国家及地方各级质监部门急需要一种分析食品中的肉类来源的方法能够快速，有效的对肉类开源进行检测。分析食品中的肉类来源的方法主要有两种：应用抗体特异性的ELISA法和基于核酸特异性的PCR法。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性，导致ELISA法鉴定肉类来源的稳定性较差，容易出现偏差，且检测步骤复杂，时间长，不利推广。而PCR方法基于核酸的特异性，不受高温的影响。食品的肉类中含有大量的核酸分子，通过合成种属特异的引物并进行PCR，可以灵敏，快速的确定肉质中的肉类来源，如果找到一种能同时检测熟肉制品多种来源肉的种类，将可以大大缩短了检测的时间，提高了检测的效率，更利于应用于实际。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组。

本发明的第二个目的是提供一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒，该试剂盒包括引物组、PCR管和2×Taq PCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明的引物组可以应用于多重PCR技术检测食品中肉类来源。本发明的试剂盒可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重PCR方法更是缩短了检测的时间，提高了检测的效率，将多重PCR方法应用于食品检测领域。

附图说明

图1应用多重PCR进行肉类来源分析的琼脂糖电泳图。

图中第1泳道是marker，第2条泳道是四重PCR结果，第3，4，5，6泳道分别是猪，牛，羊，鸡的单重PCR结果。

图2应用多重PCR进行市场中香肠肉类来源分析的琼脂糖电泳图。

图中第1泳道是DNAmarker(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)，第2，3，4，5泳道分别是猪，牛，羊，鸡的单重PCR结果，第6泳道是牛肉肠A的多重PCR检测结果，第7泳道是牛肉肠B的多重PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

本发明是对于食品中肉类来源的检测，通过PCR反应扩增出来的产物长度分别为猪：136bp，牛：705bp，羊：199bp，鸡：327bp。

一.肉制品中DNA的提取

样品处理：将等质量的猪、牛、羊和鸡肉组织样品研充分磨备用。

总DNA的提取：取30mg样品用200μl TE悬浮，加入400μl裂解液(5mol/L CuSCN；0.05mol/L Tris-HCl，pH6.4；0.02mol/L EDTA，pH8.0；1.3％TritonX-100)，70℃温浴10分钟，加等量氯仿混匀，离心(10000r/min，5min)，取上层水相，加等量冰乙醇-20℃沉淀10分钟，离心(10000r/min，5min)，弃上清，用70％乙醇洗涤一次，晾干，用50μlTE溶解沉淀；-20℃下保存待用。

二.引物的筛选和验证

首先，从GENEBANK查找获得相应的基因序列，针对要进行多重PCR反应的模板序列进行基因比对，找到特异性序列；然后，将特异性序列进行比对搜索，以确定该序列在所有物种中的特异性，避免序列出现重复现象，对选定序列两端进行微调，以确定最佳序列；其次，设计不同物种的PCR长度，至少相差50bp，从而确定上下游的引物序列，并保证所有引物的Tm值大致相同；最后用Primer软件进行分析，并微调引物序列，以确定引物之间没有过多的配对，没有二聚体。

1.引物筛选结果

猪5-ACTACTCATACCCAGCAAGC-3(序列表中SEQ ID NO.1所示)

5-TAAGGTGACAATAGGTAGTCCT-3(序列表中SEQ ID NO.2所示)

鸡5-TCCTCACTACTGTCATCTT-3(序列表中SEQ ID NO.3所示)

5-CTGGAAGAAGGAGTGATGGG-3(序列表中SEQ ID NO.4所示)

牛5-AAGCAATCGCTTTGTAACCC-3(序列表中SEQ ID NO.5所示)

5-CCAATTATTAGCAGGGTCATTG-3(序列表中SEQ ID NO.6所示)

绵羊5-CTGACCCCCTATATAAACCT-3(序列表中SEQ ID NO.7所示)

5-GTAAGGTTGTACTAATGAGGATC-3(序列表中SEQ ID NO.8所示)

2.引物特异性验证

分别提取猪、牛、羊、鸡肉制品的总DNA，将猪肉制品的总DNA、牛肉制品的总DNA、羊肉制品的总DNA和鸡肉制品的总DNA各1μl分别加入到50μl的PCR管中，再在每个PCR管中加入浓度为10μmol/L的步骤1获得的四种上下游引物各1μl，然后加入12.5μl的2×TaqPCR反应混合试剂后加3.5μl无离子H₂O至25μl体系。将此PCR体系在5000转/分条件下离心30s。将反应体系放入PCR仪中，设定变性、退火和延伸时间和温度。

PCR检测方法的循环参数

反应完毕后将PCR产物取出，在4℃下短期保存，备用。

3.多重PCR反应

提取含有猪、牛、羊、鸡四种肉的混合肉制品的总DNA，取4μl加入50μl PCR管中，再各取浓度为10μmol/L的步骤1制备的四种上下游引物各1μl加入同一PCR管，然后加入12.5μl的2×Taq PCR反应混合试剂后加0.5μl无离子H₂O至25μl体系。将此PCR体系在5000转/分条件下离心30s。将反应体系放入PCR仪中，设定变性、退火和延伸时间和温度。

PCR检测方法的循环参数

反应完毕后将PCR产物取出，在4℃下短期保存，备用。此步骤用时约90分钟。

三.PCR产物的电泳分析

PCR产物检测可以用电泳法或者序列分析法。序列分析法可精确得到扩增序列，但此方法要有专门的技术设备，不适合推广；而电泳的方法简单易操作，在不需要准确得到扩增序列的情况下，普遍用于PCR产物的检测。此方法可根据实验情况灵活掌握实验条件，比如以下即为一种检测PCR产物的具体操作。

将已配置的1.5％琼脂糖凝胶加热溶解，使溶液澄清透亮。在50℃左右将溶液倒入插好梳子的凝胶灌制模具中，约0.3～0.4cm厚。静置，待凝胶完全凝固。

电泳槽中加满0.5×TBE电泳缓冲液。凝胶完全凝固后，小心拔出梳子，将模具取出，连同凝胶一起放入电泳槽中间的平板上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽负极。

取PCR的产物10～12μl放入100μl无菌离心管中，另加入2～3μl 6×loading buffer。轻敲管底部，使混合均匀。吸取6μl混合好的样品加入凝胶加样孔中。另吸取DNA marker(标准分子)加入相邻的样品孔中。恒压电泳，使PCR产物在琼脂板上展开。

将已形成谱带的琼脂放入EB(溴化乙啶)染色液中染色20～40分钟，将凝胶取出放入紫外光下观察。见图1，图中Lane 1.DNA marker(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)Lane 2.猪，牛，羊，鸡的四重PCR结果，Lane 3.猪的单重PCR结果Lane 4.牛的单重PCR结果，Lane 5.羊的单重PCR结果，Lane 6.鸡的单重PCR结果。

此步骤用时约70～100分钟。

实施例2

一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒，该试剂盒包括引物组、PCR管和2×TaqPCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

实施例3

一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒的应用：

样品DNA提取、PCR及电泳方法与实施例1相同。

将多重PCR应用于市场熟肉制品的检测，从市场中购买各种熟肉制品，并记录其标签所标识的肉质种类，提取总DNA，进行多重PCR反应，检测其中的真实组分。

用本发明的试剂盒对于市场中获取的30组样品进行了检测，其中28个是合格产品，但有两组的多重PCR检测结果与食品标签有所不同，如图2所示，一个在标签上注明是A品牌牛肉肠，实际的检测结果是牛肉与猪肉的混合产品；另一个注明的是B品牌牛肉肠，多重PCR的结果是猪肉，牛肉，鸡肉的混合。图2中，Lane 1.DNA marker(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)；Lane 2.猪的单重PCR反应；Lane 3.牛的单重PCR反应；Lane4.羊的单重PCR反应；Lane 5.鸡的单重PCR反应；Lane 6.牛肉肠A的多重PCR检测结果；Lane 7.牛肉肠B的多重PCR检测结果。

本发明的方法应用于食品检测将具有广阔的前景。

Claims

1.一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，其特征是由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

2.一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒，其特征是该试剂盒包括引物组、PCR管和2×Taq PCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。