CN102605090A

CN102605090A - 一种同时鉴别食品中四种肉类成分的多重pcr方法

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Publication number: CN102605090A
Application number: CN2012100996511A
Authority: CN
Inventors: 张驰; 杨军; 周骏贵; 何玮玲
Original assignee: Nanjing Product Quality Supervision and Inspection Institute
Current assignee: Nanjing Product Quality Supervision and Inspection Institute
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明属于食品质量安全检测技术领域。具体涉及通过动物基因组DNA提取、引物设计和通用引物多重PCR方法（Universalprimers-multiplexPCR，UP-M-PCR）对食品中猪、牛、羊、鸡4种肉类成分进行同时快速检测。根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，利用正向引物共用、反向引物特异的策略，应用包含5条引物的通用引物多重PCR体系实现4种肉类成分的同时快速鉴别，结果表明，以上方法具有良好的针对该四种目标肉类成分的特异性，检出限可达到皮克级，且反应体系各组分未见交叉干扰。对市场上肉制品随机抽取80份食品样检测验证鉴别方法的准确性。总之，本发明建立了特异、灵敏、实用的食品中4种常见肉类成分快速筛选的多重PCR方法。

Description

一种同时鉴别食品中四种肉类成分的多重PCR方法

一.技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及应用通用引物多重PCR法对食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的同时快速检测方法及其应用。

二.背景技术

肉和肉制品掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。不法企业在利益的驱使下使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要，因此，对于我国肉制品市场占有率较高的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉，建立科学、准确快速高通量筛选方法已十分必要。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品中肉类种属鉴定的核心方法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面，动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性，且由于拷贝数多而在食品加工过程不完全降解，因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，所建立的PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，且进入了国内权威的检测技术标准。

在实际检测中，尤其需要对大量的食品样本进行肉类掺假的筛选时，提高检测效率与通量对于及时监管十分重要。以多重PCR为基础，建立多种肉类成分同时鉴别的快速检测技术是提高效率的有效途径之一。然而目前，针对我国肉类掺假现状，应用多重PCR的肉类快速同时鉴别与筛选技术尚未见报道。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是：根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，利用正向引物共用、反向引物特异的策略，建立用于猪、牛、羊、鸡4种肉类DNA快速检测的通用引物多重PCR体系，通过电泳检测扩增产物分子量大小对物种加以鉴别，可在同一反应体系中实现4种肉类成分的同时检测。首先，通过对多种常用动物基因组DNA提取方法的比较选择高效稳定的肉制品中总DNA提取方法；然后，基于动物线粒体细胞色素b基因的特异性位点，设计多重PCR引物；接着，进行多重PCR检测方法优化及特异性、灵敏度考察；最后，应用此方法对80份食品盲样进行检测以验证其实用价值。

本发明中，基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，设计5条长度不同的通用引物多重PCR引物，其中鸡、牛、羊、猪的产物片段分别为216bp、263bp、320bp和387bp，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别。

本发明的技术方案包括：1.分别使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的总DNA，产物测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度，比较提取效率和纯度，确定提取肉类中总DNA的方法。2.设计并合成多重PCR的引物。3.多重PCR检测反应条件及优化。4.针对提取的动物基因组总DNA进行多重PCR检测，考察方法的特异性与灵敏度。5.对大量食品样品进行盲样检测。

1.分别使用DNeasy试剂盒、经典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取猪、牛、羊、鸡4种肉类的总DNA。表1列出了应用3种方法对生鲜肉提取的结果。SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒法所提取的DNA浓度处于同一个数量级，SDS-蛋白酶K法在浓度与纯度方面均略优。CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差，因此DNA提取效率显著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法，DNeasy试剂盒大大节省了提取时间，且无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂，综合考虑提取速度与效率，后续实验中均采用DNeasy试剂盒提取食品中的总DNA。

表1 3种DNA提取方法的比较

Table 1 Comparison of three DNA extraction methods

数据(平均数±SE)代表6次重复。Data(average±SE)represents six repeats

2.根据GenBank中已发表的猪(登录号GU135833.1)、牛(登录号HQ184045.1)、山羊(登录号AB044308.1)、绵羊(登录号HM236185.1)、鸡(登录号GU261717.1)线粒体细胞色素b基因序列，采用正向引物共用、反向引物特异的策略，设计5条多重PCR引物，引物在线粒体基因组中的结合位置见图1，引物序列、Tm值与扩增片段大小见表2。

表2引物DNA序列

Table 1 DNA sequences of the primers used in this study

3.在50μL的多重PCR反应体系中进行猪、牛、羊、鸡4种肉类的鉴别，反应体系包含：反应缓冲液(10×)5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，MgCl₂(2.5mmol/L)3μL，Taq酶0.5μL，正向引物与4条反向引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL。使用梯度PCR对退火温度进行优化，反应条件为：94℃3min，30个循环的94℃30s、50℃～55℃30s、72℃45s，72℃7min。取15μL反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。综合反应特异性与产物量，确定引物的最佳退火温度均为52℃。

4.分别使用4种目标肉类DNA及其两两混合物、鱼肉、马肉、驴肉、大豆来源的DNA为模板，对引物进行特异性验证及比较。琼脂糖凝胶电泳图谱见图2。由图可见，对4种目标肉类DNA和目标肉类两两混合的DNA进行检测，均在设计位置观察到特异性条带，未见明显非特异性扩增，且与鱼肉、马肉、驴肉、大豆DNA均无交叉反应。将4种目标肉类的特异性条带回收纯化，纯化产物连接入T载体并委托测序，将测序结果与GenBank中的已知序列进行比对。比对结果显示：鸡的测序结果与已发表序列(登录号为GU261717.1、GU261715.1、GU261714.1)、牛的测序结果与已发表序列(登录号为HQ184045.1、HQ184038.1、HQ184037.1)、山羊的测序结果与已发表序列(登录号为AB044308.1、AB004073.1、AB004069.1)、绵羊的测序结果与已发表序列(登录号为HM236185.1、HM236184.1、HM236177.1)、猪的测序结果与已发表序列(登录号为GU135833.1、GU135832.1、GU135798.1)同源性均在99％以上，与预期基本一致，确定分别为猪、牛、羊、鸡源性成分。对本实验室制取的四种肉类的熟制品检测，特异性试验结果相同。同时，检测人为制成的生鲜肉两两混合物提取的DNA，与DNA两两混合物PCR结果相同。

将100ng/μL猪、牛、羊、鸡来源的DNA模板原液进行10倍梯度稀释并对之进行检测以考察方法的灵敏度，结果见图3。由图中可见，目标DNA稀释10³倍后，使用多重PCR法进行检测，均仍可观察到微弱的特异性扩增，因此，检测的灵敏度可达皮克级。对于4种目标肉类DNA两两混合物模板的检测及熟制品检测，灵敏度试验结果相同。

5.使用上述多重PCR方法对市售的80份食品样本进行了4种肉类的鉴定。样本的分类与检测结果见表3。由表中可见，肉类掺假普遍存在于调理生肉制品、酱卤肉、干制品和火腿制品等各类食品中，掺假率达16.3％。

表3市售肉类样品鉴定结果

Table 3 The identification results of meat samples in marketplace

本发明的有益效果是：本发明是目前食品中应用通用引物多重PCR实现猪、牛、羊、鸡四种肉类成分在同一PCR反应体系中实现同时检测的首次探索，最大限度地避免引物数量过多造成的交叉干扰，检测灵敏度达到皮克级。与专利《一种动物源性成分的鉴别方法》(专利申请号：200710144833)相比具有显著优势：首先，本发明首次实现应用5条引物在同一PCR体系里对4种肉类成分的同时快速鉴别，极大提高了检测通量；其次，本发明通过对三种不同DNA提取方法提取效率和纯度的比较，确定高效、安全及稳定的DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒法为本发明的DNA提取方法，总之，与其相比本发明提高了检测效率、检测通量及检测稳定性，弥补了通用引物多重PCR技术用于多种肉类成分同时快速检测的技术空白，为食品中肉类成分鉴定探索了新的途径。

四.附图说明

图1细胞色素b基因中多重PCR引物结合位置。C：鸡；B：牛；P：猪；S：绵羊；G：山羊。灰色阴影部分引物结合位置。黑色部分表示为各物种在引物结合位置上的差异碱基，点表示各物种在引物结合位置上的相同碱基。

图2引物特异性电泳图谱。M：1000bp ladder DNA marker；1.鸡；2.牛；3.羊；4.猪；5.鸡+牛；6.鸡+羊；7.鸡+猪；8.牛+羊；9.牛+猪；10.羊+猪；11.鱼肉；12.马肉；13.驴肉；14.大豆；

图3引物灵敏度电泳图谱。M：1000bp ladder DNAmarker；C：鸡；B：牛；S：羊；P：猪

五.具体实施方式

1.材料与试剂

生熟猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等分别源自市场采样与本实验室冷冻保存的检测样品。

血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒Qiagen公司；Ex Taq DNA聚合酶及反应缓冲液、dNTP、MgCl₂、DNA分子量Marker DL 1000、电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂宝生物工程(大连)有限公司；电泳级琼脂糖南京生兴生物公司；引物合成、DNA测序南京金斯瑞生物科技有限公司。

2.仪器与设备

PCR仪Veritee96-well美国ABI公司；核酸电泳仪SUB-cell GT美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统Universal Hood II美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机3-18K美国Sigma公司。

3.引物设计

根据GenBank中已发表的猪(登录号GU135833.1)、牛(登录号HQ184045.1)、山羊(登录号AB044308.1)、绵羊(登录号HM236185.1)、鸡(登录号GU261717.1)线粒体细胞色素b基因序列，采用正向引物共用、反向引物特异的策略，设计5条多重PCR引物，引物在线粒体基因组中的结合位置见图1，引物序列、Tm值与扩增片段大小见表1。

4.肉制品中总DNA提取

分别使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的总DNA。其中，DNeasy DNA提取试剂盒法按说明书操作；SDS-蛋白酶K法参照《分子克隆》第三版；CTAB-蛋白酶K法则方法参照文献(“Detection of meat species using TaqMan real-timePCR assays”DOOLEY J J、PAINE K E、GARRETT S D，Meat Science，2004，68；431-438.)。SDS-蛋白酶K法与CTAB法均使用氛/氯仿抽提进行核酸纯化。50mg样品的总DNA均溶解于100μL TE缓冲液中，测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度。

5.多重PCR反应条件及优化

在50μL的多重PCR反应体系中进行猪、牛、羊、鸡4种肉类的鉴别，反应体系包含：反应缓冲液(10×)5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，MgCl₂(2.5mmol/L)3μL，Taq酶0.5μL，正向引物与4条反向引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL。使用梯度PCR对退火温度进行优化，反应条件为：94℃3min，30个循环的94℃30s、50℃～55℃30s、72℃45s，72℃7min。取15μL反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

6.引物特异性验证

按照方法5的反应体系及优化的反应条件，分别使用4种目标肉类DNA及其两两等比例混合物、鱼肉、马肉、驴肉、大豆来源的DNA对引物的检测特异性进行验证与比较。

7.引物灵敏度试验

将100ng/μL的4种目标肉类DNA 10倍梯度稀释，使用方法5的反应体系及优化的反应条件，分别针对猪、牛、羊、鸡4种肉类考察多重PCR方法的灵敏度。

8.多重PCR产物测序

使用优化的多重PCR方法对猪、牛、羊、鸡4种目标肉类DNA进行扩增，产物电泳后割胶回收纯化，参照《分子克隆》第三版对纯化产物进行T载体连接、转化、克隆筛选及鉴定，并委托测序。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。

Claims

1.一种同时快速鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重PCR方法，其特征是由以下步骤构成：

（1）使用DNeasy 组织细胞DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；

（2）基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，采用正向引物共用、反向特异性引物的策略设计5条通用引物多重PCR引物，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速同时鉴别，多重PCR的反应体系为：PCR反应50μL体系：反应缓冲液（10×）5μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，MgCl₂（2.5mmol/L）3μL，Taq酶0.5μL，正向引物与4条反向引物（10μmol/L）各1μL，模板2μL，反应条件为94℃3min，30个循环的94℃、30s，52℃、30s，72℃、45s，72℃、7min。

2.根据权利要求1所述同时快速鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重PCR方法，其特征在于正向引物序列为5’-CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3’，反向特异性引物序列分别为：鸡5’-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3’，牛5’-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAA-3’，羊5’-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-3’，猪5’-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3’，鸡、牛、羊、猪的特异性扩增产物片段分别为216bp、263bp、320bp和387bp。

3.权利要求1所述的同时快速检测食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重PCR方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。