CN101173316A - 鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重pcr快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents
鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重pcr快速检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种简单快速同时检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉的方法并由此发明了一种检测试剂盒。首先采用SDS裂解法提取四种肉的DNA模板，并分别针对鸡肉、牛肉、猪肉和马肉设计了特异性的引物，实际扩增片段分别为鸡肉239bp、牛肉292bp、猪肉412bp、马肉451bp。本发明和DNA杂交、酶联免疫吸附法(ELISA)、色谱法、常规PCR方法、随机扩增多态性PCR方法(RAPD－PCR)、限制性片断长度多态性方法(RFLP－PCR)相比更快速、准确、稳定。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时对以上四种肉进行检测和鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，发明公开了一种同时检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉的多重PCR的方法的和检测试剂盒。
背景技术
鸡肉、牛肉、猪肉和马肉具有很高的营养价值，含有优质蛋白和多种必需氨基酸，是人类饮食中的重要食品。但随之市场经济的开放搞活，人们的膳食结构也在不断改变，肉类需求不断增加，部分经营人员用马肉充当牛肉和猪肉及其加工品的现象经常发生。近几年世界上流行一些关于肉制品的特殊的病，英国的疯牛病，台湾的猪口蹄疫，金门岛的牛口蹄疫，马来西亚流行日本脑炎(已有51人丧生)，马来西亚政府决定宰杀疫区十万头猪。国内部分地区也有发生猪和牛的口蹄疫，而后又有亚洲的禽流感，弄得人心慌慌，不少人害怕吃鸡肉、猪肉和牛肉。我国是一个多民族组成的国家，各种宗教习惯使得人们的饮食有所差异，对肉类的选择具有一定的倾向性。例如，回族不吃猪肉，藏族不吃马肉。同时一些特殊人群如患有高血压、脂肪肝等的患者对肉的选择具有特殊性。另外，消费者对肉掺伪现象的也深恶痛绝，然而由于以往采用的法规检测方法试验手段比较落后，试验周期较长，所以这种掺伪现象屡禁不止。
为了保护消费者的利益和进出口贸易的公平，对鸡肉、牛肉、猪肉和马肉进行检测具有重要的社会和经济意义。传统的肉品检测采用感官检验和免疫学方法仅对其生鲜肉具有一定鉴别作用，但对加工处理的肉制品，由于其感观形状，蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏，难以鉴别，这给鸡肉、牛肉、猪肉和马肉的交易和进出口带来了极大的不便。随着我国加入世界贸易组织进程的推进，国际贸易量与日俱增。因此，急需建立一种快速、准确、简便的肉品检验方法。而同时检测肉品的技术更是具有重要的意义。发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的能够同时检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉四种肉的方法。本发明提供了一种同时检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉四种肉的试剂盒其特征正在于含有以下引物：
对鸡肉、牛肉、猪肉和马肉进行扩增时所需要的通用正向引物：
Common-F：5’-gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-3’
对鸡肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Chicken-R：5’-ccttccttccttcccccccagatgaagaagaatgaggcg-3’
对牛肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Beef-R：5’-ccttccttccttccccccctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-3’
对猪肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Pork-R：5’-ccttccttccttcccccctgatagtagatttgtgatgaccg-3’
对马肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Horse-R：5’-ccttccttccttcccccccagattcactcgacgagggt-3’
进行多重PCR扩增时所需要的反向通用引物：
Common-R：5’-ccttccttccttccccccc-3’
本发明所述试剂盒中各项组分的终浓度分别为：检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉的Common-F引物终浓度为15pmol/μL，Common-R的引物终浓度为15pmol/μL，鸡肉、牛肉、猪肉和马肉特异性反向引物终浓度分别为0.015pmol/μL；Mg2+浓度为1.5mmol/L；dNTP 0.2mmol/L；10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/L KCl；Taq DNA聚合酶2U；用双蒸水补足体积至30μL。
本发明还提供了一种检测方法，它包括如下步骤：
1)将模板DNA加入权利要求的1所述的试剂盒中；
2)多重PCR在ABI2720PCR仪上进行，具体参数设置如下：
95℃预变性5min；
95℃30s，70℃10s，60℃30s，72℃30s，10个循环；
95℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环；
72℃延伸7min。
3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶(2.5％)电泳检测。电泳后扩增的特异性条带分别为：鸡肉239bp、牛肉292bp、猪肉412bp、马肉451bp。
本发明所述试剂盒的优点：
1)多重PCR方法操作简单，与四种肉的单重PCR方法一样具有良好的特异性，它对四种肉的加工制品具有广泛的适应性。
2)多重PCR检测与四种肉的单重PCR方法一样具有具有较高的灵敏度，可以检测出痕量的DNA模板。
3)该方法可以用于开发同时检测其他多种肉品的试剂盒。
附图说明
图1：本发明试剂盒检测结果图
M：100bp DNA Marker；1：空白对照；2，3，4，5：多重PCR单一检测出鸡肉、牛肉、猪肉、马肉；6：多重PCR同时检测出鸡肉和牛肉；7：多重PCR同时检测出鸡肉和猪肉；8：多重PCR同时检测出鸡肉和马肉；9：多重PCR同时检测出牛肉和猪肉；10：多重PCR同时检测出牛肉和马肉；11：多重PCR同时检测出猪肉和马肉；12：多重PCR同时检测出鸡肉、牛肉和猪肉；13：多重PCR同时检测出鸡肉、牛肉和马肉；14：多重PCR同时检测出鸡肉、猪肉和马肉；15：多重PCR同时检测出牛肉、猪肉和马肉；16：多重PCR同时检测出鸡肉、牛肉、猪肉和马肉。
具体实施方案
1、肉模板DNA的制备
鸡肉、牛肉、猪肉和马肉每种各取2.0g，剪碎后加入液氮，研磨成粉末状，移入装有10ml TESR[50mmol/L Tris-HCl pH8.050mL，5mmol/L EDTA(二乙胺四乙酸二钠)pH8.0，1％SDS(十二烷基黄酸钠)，50mmol/LNaCl高温灭菌后置室温下，临用时加入RNA酶(20mg/L)]的50ml离心管中，混匀后置37℃温育2-3h。离心(4℃，12000r/pm，10min)取上清，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，反复抽提两次，再用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次。等体积异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤数次，用TE(Tris-HCl和EDTA，pH8.0)液溶解并于-20℃保存备用。
2、多重PCR反应
以提取的待检样品的基因组为模板按以下比例进行多重PCR反应：检测鸡肉、牛肉、猪肉和马的Common-F引物终浓度为15pmol/μL，Common-R的引物终浓度为15pmol/μL，鸡肉、牛肉、猪肉和马肉特异性反向引物终浓度分别为0.015pmol/μL；Mg2+浓度为1.5mmol/L；dNTP 0.2mmol/L；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/LKCl；Taq DNA聚合酶2U；用双蒸水补足体积至30μL。待检样品模板基因组分别为25ng，用无菌水补足体积至30μL样品。
多重PCR反应在ABI 2720中进行，具体的参数条件如下：95℃预变性5min；95℃30s，70℃10s，60℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环；72℃延伸7min。
3、PCR扩增产物的鉴定
用1×TAE缓冲液配置成2.5％的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解后加入Golden view(5mg/mL)至终浓度为0.5μg/mL，倒胶然后取适量待电泳的PCR产物与1/6体积的电泳上样液(0.25％溴酚蓝；0.25％二甲苯青FF；40％蔗糖)混匀，将PCR产物加到上样槽中，在120V/cm电压下进行恒压电泳。当样品电泳至适当的位置后，在紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，Gel Doc2000)观察结果并拍照记录。电泳后扩增的目的片段为鸡肉239bp、牛肉292bp、猪肉412bp和马肉451bp。有以上片段则认为检验出阳性结果，无此片段则认为检测结果为阴性。
4、PCR扩增产物的序列鉴定
利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆和(PGEM-Tvector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。
Claims (6)
1.鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用，其特征在于经过一次简单的多重PCR可以达到同时检测鸡肉、牛肉、猪肉和马肉的目的。
2.根据权利要求1所述鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用其特征在于，在进行多重PCR时对鸡肉、牛肉、猪肉和马肉进行扩增时所需要的通用正向引物：
Common-F：5’-gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-3’
对鸡肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Chicken-R：5’-ccttccttccttcccccccagatgaagaagaatgaggcg-3’
对牛肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Beef-R：5’-ccttccttccttccccccctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-3’
对猪肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Pork-R：5’-ccttccttccttcccccctgatagtagatttgtgatgaccg-3’
对马肉进行扩增时所需要的反向特异性引物：
Horse-R：5’-ccttccttccttcccccccagattcactcgacgagggt-3’
进行多重PCR扩增时所需要的反向通用引物：
Common-R：5’-cct tccttccttccccccc-3’
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：各组分的终浓度分别为：检测鸡肉、牛肉、猪肉和马的Common-F引物终浓度为15pmol/μL，Common-R的引物终浓度为15pmol/μL，鸡肉、牛肉、猪肉和马肉特异性反向引物终浓度分别为0.015pmol/μL；Mg2+浓度为1.5mmol/L；dNTP0.2mmol/L；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/LKCl；Taq DNA聚合酶2U；用双蒸水补足体积至30μL。
4.一种检测方法：
1)将模板DNA加入权利要求1所述的试剂盒中；
2)在PCR仪上进行目的基因的扩增，PCR条件如下：
95℃预变性5min；
95℃30s，70℃10s，60℃30s，72℃30s，10个循环；
95℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环；
72℃延伸7min。
3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶(2.5％)电泳检测。
5.根据权利要求4的检测方法，其中电泳后扩增的特异性条带分别为：
鸡肉239bp、牛肉292bp、猪肉412bp、马肉451bp。
6.权利要求1或2所述试剂盒在鸡肉、牛肉、猪肉和马肉中的应用。
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