CN113073140B

CN113073140B - 一种用于同时鉴别7种肉源食品的pcr检测用引物组和方法

Info

Publication number: CN113073140B
Application number: CN202110433969.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡振东; 潘道东; 马慧; 周松; 曹锦轩; 袁馨怡; 曾小群; 吴振
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN113073140A

Abstract

本发明公开了一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法，特点是包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，其用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）样品DNA提取；（2）根据火鸡16S rRNA、鹅16S rRNA、猪细胞色素c氧化酶亚基I、绵羊细胞色素c氧化酶亚基I、黄牛16S rRNA、鸡细胞色素c氧化酶亚基I和鸭12S rRNA基因序列分别设计物种特异性引物；（3）多重PCR反应条件的建立；（4）进行琼脂糖凝胶电泳检测判断是否掺杂以及掺杂的肉类，优点是操作简单、灵敏度高和特异性好。

Description

一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法

技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，尤其是涉及一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法。

背景技术

随着社会经济发展，人们的生活消费水平不断提高，肉类及其制品成为人们日常食物的重要来源和组成部分。然而，多源化的肉制品促使人们餐桌文化日趋丰富的同时，也给肉类掺假者带来了可乘之机。部分不法企业及商贩，为了追求自身利益以次充好，在高成本的羊肉、牛肉等高价商业肉中掺入其他的低廉肉或异种肉进行售卖。这可能对患有传染病、代谢紊乱或过敏的人带来潜在的健康风险。同时也可能侵犯部分消费者的宗教信仰，例如包含猪肉成分的食品不被一些宗教信仰者所接受。因此，肉制品掺假不仅仅涉及消费者的经济、营养价值和食品安全等问题，而且扰乱了肉类流通市场秩序。

近年来，鉴别肉类品种的技术不断发展。感官分析、解剖和组织学差异、免疫血清扩散、色谱和DNA杂交等技术已经发展起来。其中，基于蛋白质水平的分析方法被广泛用于复合混合肉类品种的鉴定。然而，在加工过程中，蛋白质可能会变性、被降解或损坏，影响热处理食品中肉类种类鉴定的准确性。相比之下，基于DNA的分析方法结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)在肉类品种的鉴别和错标记检测中，是一种可靠的替代方法，因为DNA分子具有高稳定性，且广泛存在于各种类型的细胞中。线粒体DNA具有较高的拷贝数和较强的稳定性，确保了其在生肉和熟肉产品中的检测下限和可用性，作为靶标并被广泛应用于PCR检测分析。例如，细胞色素b基因、D-loop基因、12S和16S rRNA基因、ATPase亚基8和6基因、NADH脱氢酶基因等是识别肉类物种的有效靶标。已有研究发现为线粒体DNA序列在物种鉴定中的作用提供了可靠的证据。因此，基于线粒体DNA序列，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高和特异性好的用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组，包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，

所述的火鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，

反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；

鹅特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，

反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；

猪特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，

反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；

羊特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，

反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；

牛特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，

反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；

鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，

反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；

鸭特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，

反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’。

2、一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）样品DNA提取

根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取；

（2）多重PCR引物设计

根据火鸡16S rRNA、鹅16S rRNA、猪细胞色素c氧化酶亚基I、绵羊细胞色素c氧化酶亚基I、黄牛16S rRNA、鸡细胞色素c氧化酶亚基I和鸭12S rRNA基因序列分别设计物种特异性引物；

（3）多重PCR反应条件

25 µL多重PCR反应体系：10×EasyTaq®反应缓冲液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2µL，Taq酶0.6 µL，混合物种上下游引物均0.5 μL，基因组DNA 0.01-10 ng，用无菌水补足体系；PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 45 s共计34个循环；最后72℃延伸5 min；

（4）结果分析

PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10×上样缓冲液混合，用4wt%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。

所述的混合物种上下游引物包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，

所述的火鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，

反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；

鹅特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，

反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；

猪特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，

反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；

羊特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，

反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；

牛特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，

反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；

鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，

反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；

鸭特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，

反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’。

与现有技术相比，本发明的优点在于

1、本发明利用多重多聚酶链反应依据片段大小可以在一次PCR中检测出七种肉类。

2、本发明中设计的引物对每一个特定物种都具有很高的特异性，至少与15种动物没有交叉反应。

3、本发明中检测方法灵敏度高，可以对每一种反应检测到低至0.01 ng的DNA模板，这使得它具备在真实商业食品中鉴别肉类的资格。

4、本发明建立的单管多重PCR方法通过简单的琼脂糖凝胶分析，无需昂贵的设备和较高的技术水平，操作简便，可以更广泛地在肉类及产制品鉴定和溯源中应用，同时也适用于实验室条件，降低了检测成本。

综上所述，本发明一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法，利用火鸡、鹅、猪、羊、牛、鸡和鸭的线粒体DNA序列，针对靶物种设计多套不同扩增大小的引物对，通过PCR方法对引物对进行筛选及不断优化PCR反应体系，建立了一种能同时鉴定商业食品中七种肉类成分的多重PCR检测方法。该方法具有较高的灵敏度和准确度，且操作简单易行，有望成为常规检测的有效方法。

附图说明

图1（A）为分别以火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡、鸭的物种特异性引物，以相应基因组DNA为模板，进行PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；（B）为使用真核生物18S rRNA基因的通用引物扩增的所有肉类品种PCR产物的琼脂糖凝胶图像；（C）以混合基因组DNA作为扩增模板，使用火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡、鸭的特异性引物对，分别进行单一PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；CM为完全混合的火鸡，鹅，猪，牛，羊，鸡和鸭；1-7为不含靶物种DNA的全部基因组DNA混合物。M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)；

图2（A）为使用火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡、鸭7种肉类的特异性引物混合物，对所有物种预混合的DNA模板(10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 ng)进行多重PCR扩增得到产物的琼脂糖凝胶图像；（B）为（A）多重PCR产物条带对应的峰形图；

图3为对从生肉、蒸煮、高压蒸汽和微波加热处理的肉类样品中分离火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡和鸭DNA进行单一PCR扩增得到的产物凝胶图像；

图4为用预混合引物对从商用肉制品中分离的DNA进行多重PCR扩增后产生的片段的凝胶图像，扩增对象包括火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡和鸭7种肉类。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

1、标准品采集及DNA提取

从本地市场购买的新鲜火鸡、鹅、猪、羊、牛肉、鸡和鸭肉样本经冷藏后送往实验室即时处理。所有样品用无菌手术刀处理后保存在无菌塑料袋中，置于-20℃以防止DNA降解。使用Easyure®基因组DNA提取试剂盒，从生肉或商业加工肉类样品中提取总基因组DNA。用NanoDrop 2000分光光度计(NanoDrop 2000, UV-Vis分光光度计，美国)测定DNA浓度。

2、多重PCR引物设计

由于线粒体DNA序列具有种间高度差异和种内保守特性，线粒体DNA序列常用于物种鉴定。根据Genbank公布各物种线粒体基因登录号，火鸡16S rRNA (No.EF153719.1)、鹅16S rRNA (No.KJ124555.1)、猪细胞色素c氧化酶亚基I (No.KJ746666.1)、绵羊细胞色素c氧化酶亚基I (No.KP702285.1)、黄牛16S rRNA (No.MN714195.1)、鸡细胞色素c氧化酶亚基I (No.MK163565.1)和鸭12S rRNA (No.MK770342.1)基因序列分别从NCBI获取并运用MEGA6比对分析序列的超变区域和保守区域。综合熔解温度、自身互补性、二级结构和交叉反应性等物理参数，利用Oligo 7.0和BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)设计物种特异性引物。

其中火鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，

反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；

鹅特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，

反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；

猪特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，

反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；

羊特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，

反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；

牛特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，

反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；

鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，

反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；

鸭特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，

反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’。

3、单一和多重PCR反应条件及优化

25 µL单一PCR反应体系：使用北京全式金生物技术有限公司EasyTaq® DNA 聚合酶试剂盒进行PCR反应。10×EasyTaq^®反应缓冲液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2µL，Taq酶0.5µL，10 mM上下游引物各0.5 μL，基因组DNA 0.01-10 ng，用无菌水补足体系。PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 45 s共计34个循环；最后72℃延伸5 min。

25 µL多重PCR反应体系：10×EasyTaq®反应缓冲液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2µL，Taq酶0.6 µL，各混合物种上下游引物均0.5 μL，基因组DNA 0.01-10 ng，用无菌水补足体系。用4%琼脂糖凝胶电泳(90 V，80 min)检测，根据琼脂糖凝胶成像系统得到相应的电泳条带判断结果。

4、结果分析

PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10×Loading Buffer混合，用4%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。其产物大小分别为110 bp（火鸡），194 bp（鹅），254 bp（猪），329 bp（羊），473 bp（牛），612 bp（鸡）和718 bp（鸭）。如果某种肉制品没有掺入其它肉类，那么凝胶成像结果中只会出现一条与该物种大小匹配的条带，而如果其中掺杂了异种肉，则胶图中除了显示出原有物种的条带还会出现其它物种的条带。

具体实施例二

引物特异性验证

按照具体实施例一设计的物种特异性成对引物进行PCR扩增和凝胶电泳，如图1A所示，PCR片段大小分别为110 bp、194 bp、254 bp、329 bp、473 bp、612 bp和718 bp，预测条带分别为火鸡、鹅、猪、羊、牛、鸡和鸭。如图1B所示，为了确保用于PCR反应的各物种基因组DNA质量和数量，使用真核生物的通用引物，在所有肉类物种中均扩增出一个大小为99bp且条带亮度相当的保守片段作为阳性对照，其中真核生物18S rRNA基因的通用引物的正向引物为AGGATCCATTGGAGGGCAAGTTCCAACTAC，反向引物为GAGCTTTTTAACTGCA。如图1C所示，为了排除引物与物种间可能的交叉反应，将全部物种基因组DNA进行混合作为PCR扩增模板（CM），分别使用火鸡、鹅、猪、牛、羊、鸡、鸭的特异性引物进行单一PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳胶图中CM列仅有单一条带表明设计的特异性引物能够准确与混合模板中相应物种匹配；当使用无靶物种DNA的全部基因组DNA混合物做模板（1-7），无PCR条带产生，进一步肯定引物扩增的物种专一性。此外，我们检测物种特异性的引物对对于马、骆驼、鸵鸟、狗、兔、猫、小黄鱼、金枪鱼、青鱼物种基因组DNA扩增特异性，经琼脂糖凝胶电泳均条带产生，表明无交叉反应（数据未展示）。

具体实施例三

引物灵敏度实验

利用7对物种特异性引物构建了7重PCR体系。为验证多重PCR检测的敏感性，提取各靶物种DNA，由高到低制备7个浓度梯度（10、5、1、0.5、0.1、0.05和0.01 ng）的目标模板，按照具体实施例一多重PCR方法确定可检测的最低浓度。PCR产物在4%琼脂糖凝胶以条带形式呈现，以判断检测下限。从图2A可以看出，在所有检测浓度10-0.01 ng条件下，通过多重PCR均得到7种肉类的清晰电泳条带。图2B为检测7个DNA浓度范围电泳图对应的泳道峰形图，显示7个不同波峰，条带和峰的强度均随着浓度降低显著减弱，呈现浓度依赖性降低。当各物种基因组DNA浓度为0.01 ng，通过图2A和图2B中也基本可以检测到7种肉类。因此，该方法的检出下限约为0.01 ng DNA。

具体实施例四

引物重复性实验

为了评估设计引物对热加工肉类检测的有效性，采用蒸煮（97-99℃，30 min）、微波（750W，10 min）和高压蒸汽（121℃，150 kPa，15 min）热处理后提取模板DNA，按照具体实施例一方法将获得的单一PCR产物进行电泳分析。如图3A-3D所示，从所有加工肉类样品中提取的模板DNA用于单一PCR检测，PCR均能扩增出火鸡、鹅、猪、羊、牛、鸡和鸭PCR产物，扩增效率达到了100%，表明我们设计的引物可以被成功用于检测动物加工肉制品。

具体实施例五

商业肉品检测

使用具体实施例一的多重PCR方法对市场购买的60份新鲜商业肉样进行鉴定，包括牛肉、羊肉、猪肉和火鸡，各15份。从图4中可以看出，牛肉样品检测出5个样品存在掺假其他肉类，羊肉样品检测出6个样品存在掺假其他肉类，猪肉样品检测出4个样品存在掺假其他肉类，火鸡样品检测出1个样本存在掺假其他肉类。详细样本分类与检测结果如表1所示，15份样品中有5份（33.3%）牛肉、6份（40.0%）羊肉、4份（26.7%）猪肉和1份（6.7%）火鸡含有未标注的肉类品种。结果表明，廉价的鸡肉、鸭肉和猪肉经常被掺假到肉制品中。同时进一步证实了建立的七重PCR检测方法在常见食用肉类鉴定中的有效性。

表 1 商业肉制品PCR检测结果

。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组和方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 火鸡正向引物（5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’）

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>火鸡反向引物（5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’）

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 鹅正向引物（5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’）

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 鹅反向引物（5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’）

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪正向引物（5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’）

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪反向引物（5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’）

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 羊正向引物（5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’）

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 羊反向引物（5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’）

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213>牛正向引物（5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’）

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 牛反向引物（5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’）

<400> 10

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 鸡正向引物（5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’）

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 鸡反向引物（5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’）

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸭正向引物（5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’）

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 鸭反向引物（5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’）

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 真核生物18S rRNA基因的正向引物（5’-AGGATCCATTGGAGGGCAAGTTCCAACTAC - 3’）

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 真核生物18S rRNA基因的反向引物（5’- GAGCTTTTTAACTGCA- 3’）

<400> 16

Claims

1.一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测用引物组，其特征在于包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，

所述的火鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，

反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；

鹅特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，

反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；

猪特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，

反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；

羊特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，

反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；

牛特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，

反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；

鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，

反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；

鸭特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，

反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’。

2.一种用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品DNA提取

根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取；

（2）多重PCR引物设计

（3）多重PCR反应条件

25 µL多重PCR反应体系：10×EasyTaq®反应缓冲液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 2µL，Taq酶0.6 µL，混合物种上下游引物均0.5 μL，基因组DNA 0.01-10 ng，用无菌水补足体系；PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 45 s共计34个循环；最后72℃延伸5min，所述的混合物种上下游引物包括火鸡特异性引物对、鹅特异性引物对、猪特异性引物对、羊特异性引物对、牛特异性引物对、鸡特异性引物对和鸭特异性引物对，

所述的火鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’-CTCTAGCCCAACCACCCAT- 3’，

反向引物：5’-GCGCCTAAGGTCTTTTCTATCAC- 3’；

鹅特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTAGACGCGATAGAGACCCCA - 3’，

反向引物：5’- GTTCGCTCTCTTTAACTGCTTG - 3’；

猪特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- CAGCCCGGAACCCTACTTG - 3’，

反向引物：5’- GTTCATCCAGTACCCGCTCC - 3’；

羊特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- AGATATCGGCACCCTTTACCTTC - 3’，

反向引物：5’- CTGCTCCGGCCTCAACCAT - 3’；

牛特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- GTGCCTGATAATACTCTGACCAC - 3’，

反向引物：5’- CACCCCAACCGAAACTACCAA - 3’；

鸡特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TTTCGGCTCCCTATTAGCAGTC - 3’，

反向引物：5’- AGTATGAGAGTTAAGCCCAGA - 3’；

鸭特异性引物对的序列为：

正向引物：5’- TGCCCTCAATAGCCTTCACC - 3’，

反向引物：5’- CATACTTCTTTCCGTGTTGCC - 3’；

（4）结果分析

PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10×上样缓冲液混合，用4%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。