CN114561476B - 用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法 - Google Patents

用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法，特点是包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，包括以下步骤1）样品DNA提取；2）根据马、鸽子、兔子、骆驼、鸵鸟、牛、猫、火鸡、狗、鸡、鸭和鹅基因序列分别设计物种特异性引物；3）多重PCR反应条件的建立；4）进行琼脂糖凝胶电泳检测判断是否掺杂以及掺杂的肉类，优点是操作简单、灵敏度高和特异性好。

Description

用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，尤其是涉及一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法。
背景技术
肉制品为人类提供了必须的营养物质，尤其作为最丰富的蛋白质来源出现在日常饮食中。但是，随着对动物蛋白食品需求的不断增长以及肉价的上涨，肉类掺假的事件也在不断出现且已成为严重的全球性问题。为降低成本，市场上“次肉充好肉”事件频发，更是在2013年欧洲“马肉风波”这一全球性丑闻爆发后连同整个食品市场推上了风口浪尖，极大地动摇了消费者对食品行业的信任。肉类掺假不仅违反了市场规则，还有可能危害公众健康及引发宗教问题。例如某些品种肉类可能引起特定人群的过敏反应；穆斯林国家对于猪肉的忌食等。为此，肉制品的肉源鉴别在食品安全及文化法律等诸多方面都具有重要意义。
近年来，肉品鉴别技术更新迭代不断发展，包括感官分析、解剖和组织学差异、免疫血清扩散、色谱和DNA杂交等。这其中，尤以基于DNA的分析方法结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为一种方便可靠、高灵敏度低成本的检测方法，现已发展成为肉类掺假检测的首选方法。目前，常见的PCR技术有如：多重PCR和实时荧光定量PCR(RT-PCR)。RT-PCR多用于定量分析，多样化肉种类的掺杂十分影响RT-PCR分析的准确性，且该方法对于技术手段及操作费用要求较高。相较而言，多重PCR只需借助简单的琼脂糖凝胶电泳实验即可直观分析肉类掺杂情况，是更理想的检测方法。同时，由于肉类物种的高度同源性，在构建多重PCR系统时常选择具有高拷贝数和高稳定性的线粒体DNA序列作为靶基因。由此，基于线粒体DNA序列，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场肉制品安全所急需的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高和特异性好的用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组，包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，
所述的马特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCCGCTTCCTCCCTCTGA - 3’，
反向引物：5’- TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG - 3’；
鸽子特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- GGCCCAGAAAGCATCACCTC - 3’，
反向引物：5’- ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG - 3’；
骆驼特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CTAGCCCAGAAAATACCACAT - 3’，
反向引物：5’- CATAGACGAGTTCGCTCCGTA - 3’；
兔特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AATCCGCTTCTACCCCTTG - 3’，
反向引物：5’- TATACCTGTGAGGGCCAGACT - 3’；
鸵鸟特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGCGCCCTCTAGCTCATCC - 3’，
反向引物：5’- GCTGCTTTAGGGCCAACGTG - 3’；
牛特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- ATGAGCCCACCATATATTCACT - 3’，
反向引物：5’- TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA - 3’；
火鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC - 3’，
反向引物：5’- TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT - 3’；
狗特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCTTGCTCGTAATGTCCCT - 3’，
反向引物：5’- CGAGATGTCCCATTTGCGAGA - 3’；
鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CAGGTATCAGGCACACTCAGC - 3’，
反向引物：5’- CACTCTTTACGCCGGGTAGC - 3’；
鸭特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCACGCGAATAAAGCATAGCC - 3’，
反向引物：5’- TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG - 3’；
猫特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCTTAGCAGCGGGAATCACT - 3’，
反向引物：5’- AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA - 3’；
鹅特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC - 3’，
反向引物：5’- TGTCGCAGTCTGATACGATT - 3’。
2、一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）样品DNA提取
根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取，并利用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度；
（2）多重PCR引物设计
利用Oligo 7.0软件结合生物信息学的比对分析，根据马NADH脱氢酶亚基5、鸽子NADH脱氢酶亚基5、兔子NADH脱氢酶亚基5、骆驼16S rRNA、鸵鸟16S rRNA、牛细胞色素c氧化酶亚基I、火鸡细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ、狗D-loop、鸡12S rRNA、鸭NADH脱氢酶亚基6、猫细胞色素c氧化酶亚基I和鹅细胞色素b基因序列分别设计物种特异性引物；其中所述的马特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCCGCTTCCTCCCTCTGA - 3’，
反向引物：5’- TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG - 3’；
鸽子特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- GGCCCAGAAAGCATCACCTC - 3’，
反向引物：5’- ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG - 3’；
骆驼特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CTAGCCCAGAAAATACCACAT - 3’，
反向引物：5’- CATAGACGAGTTCGCTCCGTA - 3’；
兔特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AATCCGCTTCTACCCCTTG - 3’，
反向引物：5’- TATACCTGTGAGGGCCAGACT - 3’；
鸵鸟特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGCGCCCTCTAGCTCATCC - 3’，
反向引物：5’- GCTGCTTTAGGGCCAACGTG - 3’；
牛特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- ATGAGCCCACCATATATTCACT - 3’，
反向引物：5’- TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA - 3’；
火鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC - 3’，
反向引物：5’- TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT - 3’；
狗特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCTTGCTCGTAATGTCCCT - 3’，
反向引物：5’- CGAGATGTCCCATTTGCGAGA - 3’；
鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CAGGTATCAGGCACACTCAGC - 3’，
反向引物：5’- CACTCTTTACGCCGGGTAGC - 3’；
鸭特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCACGCGAATAAAGCATAGCC - 3’，
反向引物：5’- TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG - 3’；
猫特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCTTAGCAGCGGGAATCACT - 3’，
反向引物：5’- AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA - 3’；
鹅特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC - 3’，
反向引物：5’- TGTCGCAGTCTGATACGATT - 3’；
（3）多重PCR反应条件
25 µL 多重PCR反应体系：2.5 μL EasyTaq®反应缓冲液（10×），2 µL dNTPs （2.5mM），0.5 μL EasyTaq DNA聚合酶（5 U μL-1），0.5 μL 各混合物种上下游引物，1 μL 基因组DNA（0.01-10 ng μL-1），用无菌水补足体系至25 μL。利用T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Germany)，PCR反应程序为94℃变性5 min；94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 45 s下进行34个循环；最后72℃延伸5 min；
（4）结果分析
PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10× 上样缓冲液混合，用4%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Gel DocTM XR+ System凝胶成像系统拍照，根据胶图靶条带的有无即可判断是否掺杂以及掺杂的肉类。若肉样品为纯种肉，则凝胶成像中有且仅有一条与该物种相匹配的条带出现；若该肉样品非纯肉即掺杂其他肉种，则成像中除靶物种对应条带，还有其他物种的条带。
与现有技术相比，本发明的优点在于
1、本发明利用多重多聚酶链反应依据片段大小可以在一次PCR中检测出十二种肉类。
2、本发明中设计的引物对每一个特定物种都具有很高的特异性，且至少与14种陆地动物及3种鱼类没有交叉反应。
3、本发明中检测方法灵敏度高，对每一种肉种DNA检测限低至0.05-0.1 ng，证明其可用于真实商业食品中的肉类鉴别。
4、本发明建立的多重PCR方法通过简单的琼脂糖凝胶分析，无需昂贵的设备和较高的技术水平，操作简便，可以更广泛地在肉类及其制品鉴定和溯源中应用，同时也适用于实验室条件，降低了检测成本。
综上所述，本发明一种用于同时鉴别12种肉源食品的PCR检测用引物组和方法，利用马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛、火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅的线粒体DNA序列，针对靶物种设计多套不同扩增大小的引物对，通过PCR方法对引物对进行筛选及不断优化PCR反应体系，建立了一种能同时鉴定商业食品中十二种肉类成分的多重PCR检测方法。该方法具有较高的灵敏度和准确度，且操作简单易行，有望成为常规检测的有效方法。
附图说明
图1（A）为分别以马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛的物种特异性引物，以相应基因组DNA为模板，进行PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；（B）为使用真核生物18S rRNA基因的通用引物扩增的该六种肉类品种PCR产物的琼脂糖凝胶图像；（C）为以单个肉类物种的基因组DNA作为扩增模板，使用马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛的混合特异性引物对，进行单一PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；MIX为一个管反应中完全混合的马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛的引物；1-6为不含靶物种的全部引物的混合物。M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)；（D）为以混合基因组DNA作为扩增模板，使用马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛的特异性引物对，分别进行单一PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；CM为马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛六个物种基因组DNA的混合物；1-6为不含靶物种DNA的六种肉类的基因组DNA混合物。M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)。
图2（A）为分别以火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅的物种特异性引物，以相应基因组DNA为模板，进行PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；（B）为使用真核生物18S rRNA基因的通用引物扩增的该六种肉类品种PCR产物的琼脂糖凝胶图像；（C）以单个肉类物种的基因组DNA作为扩增模板，使用火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅的混合特异性引物对，进行单一PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；MIX为一个管反应中完全混合的火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅的引物；1-6为不含靶物种的全部引物的混合物。M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)；（D）以混合基因组DNA作为扩增模板，使用火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅的特异性引物对，分别进行单一PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶图像；CM为火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅六个物种基因组DNA的混合物；1-6为不含靶物种DNA的六种肉类的基因组DNA混合物。M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)。
图3（A）为以马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛六个物种基因组DNA的混合物作为扩增模板，分别以马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛的单一引物对PCR扩增产物克隆至pEASY ®-T5 Zero载体，抽提质粒DNA作模板并利用载体通用引物M13F和M13R进行PCR扩增，DNA自动测序仪测序PCR产物的部分结果；（B）为以火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅六个物种基因组DNA的混合物作为扩增模板，分别以火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅的单一引物对PCR扩增产物克隆至pEASY ®-T5 Zero载体，抽提质粒DNA作模板并利用载体通用引物M13F和M13R进行PCR扩增，DNA自动测序仪测序PCR产物的部分结果。
图4（A）为使用马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛6种肉类的特异性引物对混合物，以六物种分别在10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 ng浓度下的DNA混合物作模板，进行多重PCR扩增得到产物的琼脂糖凝胶图像；（B）利用伯乐公司Image LabTM软件，绘制电泳图相对应的凝胶图像；泳道1-10同(A)中横坐标标签（10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01）；M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)。
图5（A）为使用火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅6种肉类的特异性引物对混合物，对以六物种分别在10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 ng浓度下的DNA混合物作模板，进行多重PCR扩增得到产物的琼脂糖凝胶图像；（B）利用伯乐公司Image LabTM软件，绘制电泳图相对应的凝胶图像；泳道1-10同(A)中横坐标标签（10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01）；M为DNA分子量标准Marker(100-1031 bp)。
图6（A）为从对生肉进行蒸煮处理的肉类样品中分离马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛DNA进行单一PCR扩增得到的产物凝胶图像；（B）为从对生肉进行微波加热处理的肉类样品中分离马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛DNA进行单一PCR扩增得到的产物凝胶图像；M为DNA分子量标准Marker (100-1031 bp)。
图7（A）为从对生肉进行蒸煮处理的肉类样品中分离火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅DNA进行单一PCR扩增得到的产物凝胶图像；（B）为从对生肉进行微波加热处理的肉类样品中分离火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅DNA进行单一PCR扩增得到的产物凝胶图像；M为DNA分子量标准Marker (100-1031 bp)。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
1、样本采集及DNA提取
样品购自本地超市及线上平台，在冷冻状态下运输，并在-80℃保存以抑制DNA降解。使用EasyPure®基因组DNA提取试剂盒，从肉类样品中提取总基因组DNA，并用NanoDrop2000分光光度计测定DNA浓度。
2、物种特异性引物的设计
由于线粒体DNA序列具有种间高度差异和种内保守特性，常用于物种鉴定。根据GenBank公布的各物种线粒体基因登录号，从国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中分别检索马NADH脱氢酶亚基5 (No.MN187574.1)、鸽子NADH脱氢酶 (No.168712.1)、兔子NADH脱氢酶 (No.MH985853.1)、骆驼16S rRNA (No.MH109991.1)、鸵鸟16S rRNA (No.Y12025.1)、牛细胞色素c氧化酶亚基I (No.MN714195.1)和猫细胞色素c氧化酶亚基I(No.MT499915.1)、火鸡细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ (No.EF153719.1)、狗D-loop(No.MN181404.1)、鸡12S rRNA (No.MK163565.1)、鸭NADH脱氢酶亚基6 (No.MK770342.1)和鹅细胞色素b (No.KJ124555.1)基因序列。采用MEGA6软件比对分析物种间的保守区域和可变区域，结合Oligo 7.0和BLAST 程序，根据熔解温度、交叉反应性、自互补性和二级结构等物理参数，设计具有物种特异性的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。为了检测所设计的物种特异性引物在非目标物种中是否存在错配现象，使用ClustalW软件对14种陆地动物：骆驼、鸽子、鸡、鸭、马、水牛、猪、火鸡、鹅、羊、兔、鸵鸟、狗、猫以及3种水生类鱼：小黄鱼、金枪鱼和黑鱼进行序列筛查。使用上述17物种作为模板，引物对的特异性分别采用单一PCR法进一步检测。其中各引物序列如下表1所示：
表 1 各引物基因组测序结果
。
3、单一和多重PCR检测
25 µL单一PCR反应体系：使用北京全式金生物技术有限公司EasyTaq® DNA 聚合酶试剂盒进行PCR反应。2.5 μL EasyTaq®反应缓冲液（10×），2 µL dNTPs（2.5 mM），0.5 μLEasyTaq DNA聚合酶（5 U μL-1），上下游引物（10 mM）各0.5 μL，1 μL 基因组DNA（0.01-10ng μL-1），用无菌水补足体系至25 μL。PCR反应程序为94℃变性5 min；94℃ 30 s、63℃ 30s、72℃ 45 s下进行34个循环；最后72℃延伸5 min。
25 µL多重PCR反应体系：在单一PCR试验后，采用6种特异性引物和相应的基因组DNA作为模板，建立了双管六聚体PCR反应体系。所有PCR片段均使用T100™热循环仪扩增，用4%琼脂糖凝胶分析，并利用Gel DocTM XR+ System凝胶成像系统拍照。
4、PCR产物测序
以马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛、火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅十二个物种基因组DNA的混合物作为扩增模板，以马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛、火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅的单一引物对分别PCR扩增，PCR扩增产物用DiaSpin DNA凝胶纯化试剂盒进行PCR片段胶回收，并连接pEASY ®-T5 Zero载体。使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA提取并利用载体通用引物M13F和M13R进行单一PCR扩增，最后使用DNA自动测序仪进行PCR产物测序。该测序的DNA碱基组成是通过对NCBI核苷酸数据库的BLAST搜索来确定的。
5、结果分析
PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10× Loading Buffer混合，用4%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。其产物大小分别为马（148 bp）、鸽子（218 bp）、骆驼（283 bp）、兔（370 bp）、鸵鸟（536 bp）、牛（610 bp）、火鸡（124 bp）、狗（149 bp）、鸡（196 bp）、鸭（277 bp）、猫（380 bp）和鹅（468 bp）。如果某种肉制品没有掺入其它肉类，那么凝胶成像结果中只会出现一条与该物种大小匹配的条带，如果其中掺杂了异种肉，则胶图中除了显示出原有物种的条带还会出现其它物种的条带。
具体实施例二
引物特异性验证
为验证引物的特异性，首先利用单一物种DNA及其引物对，进行单一PCR扩增。如图1A所示，PCR扩增结果显示，PCR片段大小分别是148 bp、218 bp、283 bp、370 bp、536 bp和610 bp，预测条带分别为马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛。如图1B所示，为了确保六个物种基因组DNA质量和数量，同时选择三对来源于18S rRNA，16S rRNA、12S rRNA靶基因的通用真核引物分别作为阳性对照，本发明中，所有的肉类样本均产生条带亮弱强度相似，与预期大小一致的99 bp，240 bp和456 bp的目标PCR片段，表明提取肉类资源基因组DNA质量相当，确保PCR等同的扩增效率。此外，如图1C所示，为分别以单物种肉的基因组DNA为模板，使用6物种的引物混合物能够获得单一PCR产物，而使用不包括目标对应物的5对非靶标引物混合物无PCR条带产生，表明只有目标引物对能够有效扩增目标物种DNA。如图1D所示，为了排除引物与物种间可能的交叉反应，以6个物种DNA的混合物作模板，所有单一引物对均能有效扩增PCR条带，然而，以5个非目标物种DNA混合物作模板，目标引物对不能有效扩增PCR条带，进一步表明目标引物对能够特异性地扩增目标物种。与此同时，使用胶回收试剂盒纯化图1D中148 bp、218 bp、283 bp、370 bp、536 bp和610 bp的扩增子，克隆至商业化载体pEASY ®-T5 Zero，使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA提取并利用载体通用引物M13F和M13R进行单一PCR扩增，最后使用DNA自动测序仪进行PCR产物测序。将测序结果与NCBI核苷酸数据库比对分析，更加确定目标引物对能够从六物种DNA混合物特异扩增目标物种。图3A为上述马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛各物种的部分测序结果。
同样地，对火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅的引物特异性进行了PCR扩增和凝胶电泳。如图2A所示，PCR扩增结果显示，PCR片段大小分别是124 bp、149 bp、196 bp、277 bp、380 bp和468 bp，预测条带分别是火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅。如图2B所示，为了确保六个物种基因组DNA质量和数量，同时选择三对来源于18S rRNA，16S rRNA、12S rRNA靶基因的通用真核引物分别作为阳性对照，本发明，所有的肉类样本均产生条带亮弱强度相似，与预期大小一致的99 bp，240 bp和456 bp的目标PCR片段，表明提取肉类资源基因组DNA质量相当，确保PCR等同的扩增效率。此外，如图2C所示，为分别以单物种肉的基因组DNA为模板，使用6物种的引物混合物能够获得单一PCR产物，而使用不包括目标对应物的5对非靶标引物混合物无PCR条带产生，表明只有目标引物对能够有效扩增目标物种DNA。如图2D所示，为了排除引物与物种间可能的交叉反应，以6个物种DNA的混合物作模板，所有单一引物对均能有效扩增PCR条带，然而，以5个非目标物种DNA混合物作模板，目标引物对不能有效扩增PCR条带，进一步表明目标引物对能够特异性地扩增目标物种。与此同时，使用胶回收试剂盒纯化图2D中124 bp、149 bp、196 bp、277 bp、380 bp和468 bp的扩增子，克隆至商业化载体pEASY ®-T5 Zero，使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA提取并利用载体通用引物M13F和M13R进行单一PCR扩增，最后使用DNA自动测序仪进行PCR产物测序。将测序结果与NCBI核苷酸数据库比对分析，更加确定目标引物对能够从六物种DNA混合物特异扩增目标物种。图3B为上述火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅各物种的部分测序结果。为了排除引物与物种间可能的交叉反应，此外，通过各目标引物对单一PCR扩增实验，证实目标引物除与靶物种结合能够有效扩增PCR条带，与14种陆地动物（马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟、牛、火鸡、狗、鸡、鸭、猫、鹅、猪、羊）以及3种水生类鱼（小黄鱼、金枪鱼和黑鱼）非靶物种结合均不能PCR扩增出条带（数据太多，未显示），表明新设计的特异性引物对与16种非靶物种均不存在交叉反应，极大降低错判可能性。因此，本发明设计的引物具有高度的特异性，足以用于现实食品中肉类物种的鉴定。
具体实施例三
引物灵敏度实验
利用每管中使用6对物种特异性引物构建了多重PCR体系。为了验证多重PCR检测的敏感性，提取各靶物种DNA，由高到低制备10个浓度梯度（10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 ng）的目标模板，按照具体实施例一多重PCR方法确定可检测的最低浓度。PCR产物在4%琼脂糖凝胶以条带形式呈现，以判断检测下限。如图4A所示，在10 ng-0.01ng的指定浓度下，通过多重PCR均得到6种肉类的清晰电泳条带。图4B为检测6个DNA浓度范围电泳图对应的泳道峰形图，显示6个不同波峰，条带和峰的强度均随着浓度降低显著减弱，呈现浓度依赖性降低。当各物种基因组DNA浓度为0.1 ng，通过图4A和B中也基本可以检测到6种肉类。因此，马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛采用该方法的检出下限约为0.1 ng DNA。相比之下，如图5A和B所示，在10 ng-0.01 ng的指定浓度下，通过多重PCR均得到火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅的6种肉类的清晰电泳条带，并且火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅采用该方法的检出下限约为0.05 ng DNA。
具体实施例四
热加工肉类中引物重复性实验
为了评估设计引物对热加工肉类检测的有效性，对生肉样品采用蒸煮（97-99℃，30 min）和微波（750 W，10 min）处理后提取模板DNA，按照具体实施例一方法将获得的单一PCR产物进行电泳分析。如图6A和B所示，PCR均能扩增得到马、鸽子、骆驼、兔、鸵鸟和牛PCR产物，扩增效率达到了100%，且如图7A和B所示，火鸡、狗、鸡、鸭、猫和鹅的PCR扩增结果相似。综上，设计的引物适用于检测动物加工肉制品中的肉类成分。
具体实施例五
商业肉品检测
使用具体实施例一的多重PCR方法对市场随机购买的55份商业肉样进行鉴定，包括牛肉15份和马肉、骆驼肉、鸵鸟肉、火鸡肉各10份。牛肉样品检测出6个样品存在掺假其他肉类，马肉样品检测出3个样品存在掺假其他肉类，骆驼肉样品检测出2个样品存在掺假其他肉类，鸵鸟肉样品检测出3个样品存在掺假其他肉类，火鸡肉样品检测出3个样品存在掺假其他肉类。详细样本分类与检测结果如表2所示，15份样品中有6份（40.0%）牛肉、10份样品中有3份（30.0%）马肉、2份（20.0%）骆驼肉、3份（30.0%）鸵鸟肉和3份（30.0%）火鸡肉含有未标注的肉类品种。结果表明，廉价的鸡鸭肉经常被掺假到肉制品中，同时进一步证实了建立的多重PCR检测方法在常见食用肉类鉴定中的有效性。
表 2 商业肉制品PCR检测结果
。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 马上游引物（5’- CCCCGCTTCCTCCCTCTGA - 3’）
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 马下游引物（5’- TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG - 3’）
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸽子上游引物（5’- GGCCCAGAAAGCATCACCTC - 3’）
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 鸽子下游引物（5’- ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG - 3’）
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 骆驼上游引物（5’- CTAGCCCAGAAAATACCACAT - 3’）
<400> 5
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 骆驼下游引物（5’-CTTGAATAGCACTCCGCACCC- 3’）
<400> 6
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 兔上游引物（5’- AATCCGCTTCTACCCCTTG - 3’）
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 兔下游引物（5’- TATACCTGTGAGGGCCAGACT - 3’）
<400> 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213>鸵鸟上游引物（5’- AGCGCCCTCTAGCTCATCC - 3’）
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸵鸟下游引物（5’- GCTGCTTTAGGGCCAACGTG - 3’）
<400> 10
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 牛上游引物（5’- ATGAGCCCACCATATATTCACT - 3’）
<400> 11
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 牛下游引物（5’- TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA - 3’）
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 火鸡上游引物（5’- AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC - 3’）
<400> 13
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 火鸡下游引物（5’- TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT - 3’）
<400> 14
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 狗上游引物（5’- CCCTTGCTCGTAATGTCCCT - 3’）
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 狗下游引物（5’- CGAGATGTCCCATTTGCGAGA - 3’）
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸡上游引物（5’- CAGGTATCAGGCACACTCAGC - 3’）
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡下游引物（5’- CACTCTTTACGCCGGGTAGC - 3’）
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸭上游引物（5’- CCACGCGAATAAAGCATAGCC - 3’）
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸭下游引物（5’- TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG - 3’）
<400> 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 猫上游引物（5’- TCTTAGCAGCGGGAATCACT - 3’）
<400> 21
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 猫下游引物（5’- AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA - 3’）
<400> 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 鹅上游引物（5’- TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC - 3’）
<400> 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 鹅下游引物（5’- TGTCGCAGTCTGATACGATT - 3’）
<400> 24
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 真核细胞12S rRNA上游引物（5’- CAACTGGGATTAGATACCCCACTAT - 3’）
<400> 25
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 真核细胞12S rRNA下游引物（5’- GAGGGTGACGGGCGGTGTGT - 3’）
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 真核细胞16S rRNA上游引物（5’- AAGACGAGAAGACCCTATGGA - 3’）
<400> 27
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 真核细胞16S rRNA下游引物（5’- GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA - 3’）
<400> 28
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 真核细胞18S rRNA上游引物（5’- AGGATCCATTGGAGGGCAAGT - 3’）
<400> 29
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 真核细胞18S rRNA下游引物（5’- TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA - 3’）
<400> 30

Claims (2)

1.一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组，其特征在于包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，
所述的马特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCCGCTTCCTCCCTCTGA - 3’，
反向引物：5’- TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG - 3’；
鸽子特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- GGCCCAGAAAGCATCACCTC - 3’，
反向引物：5’- ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG - 3’；
骆驼特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CTAGCCCAGAAAATACCACAT - 3’，
反向引物：5’- CATAGACGAGTTCGCTCCGTA - 3’；
兔特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AATCCGCTTCTACCCCTTG - 3’，
反向引物：5’- TATACCTGTGAGGGCCAGACT - 3’；
鸵鸟特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGCGCCCTCTAGCTCATCC - 3’，
反向引物：5’- GCTGCTTTAGGGCCAACGTG - 3’；
牛特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- ATGAGCCCACCATATATTCACT - 3’，
反向引物：5’- TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA - 3’；
火鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC - 3’，
反向引物：5’- TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT - 3’；
狗特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCTTGCTCGTAATGTCCCT - 3’，
反向引物：5’- CGAGATGTCCCATTTGCGAGA - 3’；
鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CAGGTATCAGGCACACTCAGC - 3’，
反向引物：5’- CACTCTTTACGCCGGGTAGC - 3’；
鸭特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCACGCGAATAAAGCATAGCC - 3’，
反向引物：5’- TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG - 3’；
猫特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCTTAGCAGCGGGAATCACT - 3’，
反向引物：5’- AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA - 3’；
鹅特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC - 3’，
反向引物：5’- TGTCGCAGTCTGATACGATT - 3’。
2.一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）样品DNA提取
根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取，并测DNA浓度；
（2）多重PCR引物设计
根据马NADH脱氢酶亚基5、鸽子NADH脱氢酶亚基5、兔子NADH脱氢酶亚基5、骆驼16SrRNA、鸵鸟16S rRNA、牛细胞色素c氧化酶亚基I、火鸡细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ、狗D-loop、鸡12S rRNA、鸭NADH脱氢酶亚基6、猫细胞色素c氧化酶亚基I和鹅细胞色素b基因序列分别设计物种特异性引物；其中
所述的马特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCCGCTTCCTCCCTCTGA - 3’，
反向引物：5’- TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG - 3’；
鸽子特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- GGCCCAGAAAGCATCACCTC - 3’，
反向引物：5’- ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG - 3’；
骆驼特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CTAGCCCAGAAAATACCACAT - 3’，
反向引物：5’- CATAGACGAGTTCGCTCCGTA - 3’；
兔特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AATCCGCTTCTACCCCTTG - 3’，
反向引物：5’- TATACCTGTGAGGGCCAGACT - 3’；
鸵鸟特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGCGCCCTCTAGCTCATCC - 3’，
反向引物：5’- GCTGCTTTAGGGCCAACGTG - 3’；
牛特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- ATGAGCCCACCATATATTCACT - 3’，
反向引物：5’- TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA - 3’；
火鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC - 3’，
反向引物：5’- TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT - 3’；
狗特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCCTTGCTCGTAATGTCCCT - 3’，
反向引物：5’- CGAGATGTCCCATTTGCGAGA - 3’；
鸡特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CAGGTATCAGGCACACTCAGC - 3’，
反向引物：5’- CACTCTTTACGCCGGGTAGC - 3’；
鸭特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- CCACGCGAATAAAGCATAGCC - 3’，
反向引物：5’- TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG - 3’；
猫特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCTTAGCAGCGGGAATCACT - 3’，
反向引物：5’- AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA - 3’；
鹅特异性引物对的序列为：
正向引物：5’- TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC - 3’，
反向引物：5’- TGTCGCAGTCTGATACGATT - 3’；
（3）多重PCR反应条件
25 µL多重PCR反应体系：2.5 μL10× EasyTaq®反应缓冲液，2 µL的2.5 mM dNTPs，0.5μL的5 U μL-1EasyTaq DNA聚合酶，各混合物种上下游引物均0.5 μL，基因组DNA 0.01-10ng μL-1，用无菌水补足体系至25 μL；PCR反应程序为94℃变性5 min；94℃ 30 s、63℃ 30s、72℃ 45 s下进行34个循环；最后72℃延伸5 min；
（4）结果分析
PCR扩增反应结束后，将10 μL扩增产物与1 μL 10×上样缓冲液混合，用4%琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断是否掺杂以及掺杂的肉类。
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