CN116875702B - 一种鉴定常见动物种属的引物组及其试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定常见动物种属的引物组及其试剂盒和应用，属于物种鉴定技术领域。本发明提供的鉴定常见动物种属的引物组，包括检测马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:24所示。本发明基于所述引物组可快速、准确、特异性和高灵敏度鉴别动物源性成分，适用于刑事案件现场中不明组织样本的种属鉴定，检测成本低，具有重要价值和市场应用前景，便于向基层推广应用。
Description
技术领域
本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定常见动物种属的引物组及其试剂盒和应用。
背景技术
种属鉴定在食品安全领域和法医物证分析领域均有广泛的应用。在法医鉴定领域中，由于刑事案件现场的复杂性，对于不明组织样本往往需要对其进行种属鉴定以明确其来源，进而为案件破解提供线索；在食品安全领域，种属鉴定可应用于肉类掺假检测和肉源种属确定。
DNA技术可通过检测肉类制品中残留的DNA进行动物源性成分分析，判断食品掺假。近年来国家先后发布《GB/T 35917-2018常见动物源性成分快速测定-膜芯片法》、《GB/T35918-2018动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法》、《GB/T 38164-2019常见畜禽动物源性成分检测方法实施荧光PCR法》，对常见动物源性成分的定性检测提供了方法。这些方法，均是对常见物种进行单一检测。然而，在实践中，实验人员对于待检验的肉类样本究竟是何成分是未知的，该做何种检测是困惑的，因此能够同时进行多种动物源性成分的检测对于实验人员顺利开展动物制品掺假类案件及法医物证样本分析等具有重要意义。目前，国内外对多种动物源性成分同时进行检测的方法报道较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定常见动物种属的引物组，能够对鸭、马、猪、鼠、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽、人等12种动物的高保守特异核酸序列进行扩增，并达到准确、快速的检测目的。
本发明提供了一种鉴定常见动物种属的引物组，所述引物组包括检测马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人的引物对；
检测马的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；
检测鹅的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；
检测兔的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
检测鼠的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物；
检测鸡的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；
检测鹌鹑的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；
检测羊的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物；
检测鸽的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的反向引物；
检测鸭的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的反向引物；
检测猪的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示的反向引物；
检测牛的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示的反向引物；
检测人的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示的反向引物。
优选的，每对引物对的一条引物修饰有荧光基团；
所述荧光基团包括5-TAMRA、5,6-FAM、5-ROX和5'HEX。
优选的，检测马、鹅、兔的引物对的正向引物的5'端修饰5-TAMRA；
检测鼠、鸡、鹌鹑的引物对的正向引物的5'端修饰5,6-FAM；
检测羊、鸽的引物对的正向引物的5'端修饰5-ROX；
检测鸭、猪、牛、人的引物对的正向引物的5'端修饰5'HEX。
本发明提供了一种用于鉴定常见动物源性成分的试剂盒，包括所述引物组和PCR扩增反应液。
优选的，所述PCR扩增反应液包括2×Multiplex PCR Mastermix。
本发明提供了所述引物组或所述试剂盒在鉴定常见动物源性成分中的应用。
本发明提供了一种鉴定常见动物源性成分的方法，包括以下步骤：
提取待测样本的DNA；
以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；
对PCR扩增产物进行分析检测，检测结果中出现与常见动物标准品相同的结果时，则判断待测样本中含有对应动物的源性成分。
优选的，所述鉴定常见动物源性成分的样本包括以下一种或几种：血液、肉、毛发和蛋。
优选的，所述多重PCR扩增的反应体系为PCR扩增反应液5μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL，DNA模板1～2ng，用ddH2O补充至10μL；
检测马、兔、羊、鸽、人的引物对中正反向引物的浓度分别为0.1μM；
检测鹅的引物对中正反向引物的浓度分别为0.05μM；
检测鼠、鸡、鸭的引物对中正反向引物的浓度分别为0.5μM；
检测鹌鹑的引物对中正反向引物的浓度分别为0.2μM；
检测猪的引物对中正反向引物的浓度分别为0.4μM；
检测牛的引物对中正反向引物的浓度分别为0.3μM；
所述多重PCR扩增的反应程序为95℃预变性10分钟；95℃30秒、61℃30秒、72℃30秒，循环30次；72℃再延伸10分钟。
优选的，所述对PCR扩增产物进行分析检测的方法包括电泳检测。
本发明提供的检测方法具有以下优势：
(1)本发明设计的12种常见动物种属鉴定复合扩增体系方法简便易操作，可同时对包括鸭、马、猪、鼠、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽、人12种常见物种进行区分。
(2)本发明设计的12种常见动物种属鉴定复合扩增体系特异性强，检测结果准确。
(3)本发明设计的12种常见动物种属鉴定复合扩增体系灵敏度高，1ng12种混合动物的DNA仍可获得较好的检测结果。
(4)本发明设计的12种常见动物种属鉴定复合扩增体系对混合样本的区分性能强，对混合肉类样本的检测灵敏度达1‰。
(5)本发明设计的12种常见动物种属鉴定复合扩增体系可以作为肉类食品掺假的快速筛查检测方法，也可对刑事案件现场中不明组织样本的进行种属鉴定，成本低，具有重要价值和市场应用前景，便于向基层推广。
附图说明
图1.鸭DNA复合扩增体系检测图谱；
图2.马DNA复合扩增体系检测图谱；
图3.猪DNA复合扩增体系检测图谱；
图4.鼠DNA复合扩增体系检测图谱；
图5.鹅DNA复合扩增体系检测图谱；
图6.鸡DNA复合扩增体系检测图谱；
图7.牛DNA复合扩增体系检测图谱；
图8.羊DNA复合扩增体系检测图谱；
图9.兔DNA复合扩增体系检测图谱；
图10.鹌鹑DNA复合扩增体系检测图谱；
图11.鸽DNA复合扩增体系检测图谱；
图12.人DNA复合扩增体系检测图谱；
图13.1ng/μL混合12种常见动物复合扩增电泳检测图谱；
图14.鼠DNA质量分数为50％时复合扩增电泳检测图谱；
图15.鼠DNA质量分数为10％时复合扩增电泳检测图谱；
图16.鼠DNA质量分数为5％时复合扩增电泳检测图谱；
图17.鼠DNA质量分数为1％时复合扩增电泳检测图谱；
图18.鼠DNA质量分数为1‰时复合扩增电泳检测图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定常见动物种属的引物组，所述引物组包括检测马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人的引物对；检测马的引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；检测鹅的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；检测兔的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示的反向引物；检测鼠的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物；检测鸡的引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；检测鹌鹑的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；检测羊的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物；检测鸽的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的反向引物；检测鸭的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的反向引物；检测猪的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示的反向引物；检测牛的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示的反向引物；检测人的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示的反向引物。每对引物扩增片段的长度优选为90～400bp。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法合成即可。在本发明实施例中，所述引物组委托生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成。
在本发明中，每对引物对的一条引物优选修饰有荧光基团，以便后续检测时用于区分不同来源的动物样本。本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团的种类即可，例如本发明实施例中，所述荧光基团包括5-TAMRA、5,6-FAM、5-ROX和5'HEX。在本发明实施例中，检测马、鹅、兔的引物对的正向引物的5'端优选修饰5-TAMRA。检测鼠、鸡、鹌鹑的引物对的正向引物的5'端优选修饰5,6-FAM。检测羊、鸽的引物对的正向引物的5'端优选修饰5-ROX。检测鸭、猪、牛、人的引物对的正向引物的5'端优选修饰5'HEX。本发明对所述修饰的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的修饰方法即可。
本发明提供了一种用于鉴定常见动物源性成分的试剂盒，包括所述引物组和PCR扩增反应液。
在本发明中，所述PCR扩增反应液优选包括2×Multiplex PCR Mastermix。所述2×Multiplex PCR Mastermix优选购自北京聚合美生物科技有限公司公司。所述引物组优选各对引物的正向引物和反向引物独立分装，在使用前进行溶解。
本发明提供了所述引物组或所述试剂盒在鉴定常见动物源性成分中的应用。
本发明提供了一种鉴定常见动物源性成分的方法，包括以下步骤：
提取待测样本的DNA；
以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；
对PCR扩增产物进行分析检测，检测结果中出现与常见动物标准品相同的结果时，则判断待测样本中含有对应动物的源性成分。
本发明提取待测样本的DNA。
在本发明中，所述鉴定常见动物源性成分的样本优选包括以下一种或几种：血液、肉、毛发和蛋。在本发明中，不同动物源性优选采用不同的材料样本，例如鸭肉、马肉、猪肉、鼠尾、鹅蛋、鸡肉、牛肉、羊肉、兔肉、鹌鹑蛋、鸽蛋和人血液。
在本发明中，提取待测样本DNA的方法优选采用商品化试剂盒完成。在本发明实施例中，采用美国Thermo Fisher Scientific公司生产的DNeasy Blood andTissue Kit提取试剂盒进行提取DNA。
提取完成后，本发明以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述多重PCR扩增的反应体系优选为PCR扩增反应液5μL、所有正向引物总添加体积0.2μL、所有反向引物总添加体积0.2μL，DNA模板1～2ng，用ddH2O补充至10μL。其中，检测马、兔、羊、鸽、人的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.1μM；检测鹅的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.05μM；检测鼠、鸡、鸭的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.5μM；检测鹌鹑的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.2μM；检测猪的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.4μM；检测牛的引物对中正反向引物的浓度分别优选为0.3μM。所述多重PCR扩增的反应程序为95℃预变性10分钟；95℃30秒、61℃30秒、72℃30秒，循环30次；72℃再延伸10分钟。本发明对所述多重PCR的扩增方法和所用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的扩增方法和PCR仪即可。
得到PCR扩增产物后，本发明对PCR扩增产物进行分析检测，检测结果中出现与常见动物标准品相同的结果时，则判断待测样本中含有对应动物的源性成分。
在本发明中，所述对PCR扩增产物进行分析检测的方法优选包括电泳检测。所述电泳检测优选包括琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测。当采用未修饰荧光基团的引物进行多重PCR扩增时，优选进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据特定动物种属标准品的扩增条带的位置来判断待检样本中是否存在对应的动物源性成分。当采用荧光基团修饰的引物进行多重PCR扩增时，优选进行毛细管电泳检测，根据动物标准品形成的电泳图谱的峰位置来判断待检样本中是否含有对应的动物源性成分。
在本发明中，还对所述检测方法进行特异性和灵敏度的检测，结果显示，本发明设计的12对引物仅针对靶基因所在的动物种属实现扩增，而对其他11种动物无法实现扩增，这表明本发明设计的12对引物具有良好的检测特异性，保证检测结果的准确性；同时本发明的检测灵敏度为目标基因占混合样本DNA的0.1％，具有较高的检测灵敏度。
在本发明中，本发明提供的检测方法适用于肉类制品中12种常见动物的源性成分的快速鉴别，也适用于刑事案件现场中不明组织样本的种属鉴定，成本低，具有重要价值和市场应用前景，便于向基层推广。
下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定常见动物种属的引物组及其试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种鉴定常见动物源性成分的方法
(1)引物设计
从NCBI中的GenBank数据库下载鸭、马、猪、鼠、鹅鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽、人12种动物基因序列，设计成套引物。利用Primer-blast功能对引物特异性进行初步验证。选择仅在目标种属中有单一扩增产物的引物进行进一步验证。对初步筛选出的引物进行第二轮筛选。将12种动物DNA利用初筛后的每对引物进行扩增。同时设置空白对照。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物结果检验。选择仅目标种属有单一扩增产物，其他种属无相应产物的引物进行多重复合扩增体系的构建。为了便于扩增片段大小的检测，在引物的5'端添加TAMRA、FAM、ROX、HEX荧光基团进行修饰。调节引物浓度，直至复合扩增体系电泳图谱中呈现出峰高均衡、峰型正常的状态。调节后的引物详细信息见表1。
表1常见动物种属鉴定复合扩增体系中12对扩增引物详细信息
(2)DNA提取
分别取少量鸭肉、马肉、猪肉、鼠尾、鹅蛋、鸡肉、牛肉、羊肉、兔肉、鹌鹑蛋、鸽蛋、人血置于1.5mL EP管。采用美国Thermo Fisher Scientific公司的DNeasy Blood andTissue Kit试剂盒提取DNA。
(3)DNA扩增
采用High-Fidelity DNAPolymerase PCRmix试剂进行多重PCR反应扩增体系。引物浓度详见表1。按照2×Multiplex PCRMastermix 5μL、引物组0.4μL、DNA 1～2ng、添加dH2O至10μL。检测未知样本时需以1～2ng 12种混合DNA模板作为阳性对照，Rnase-free水作为阴性对照。扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃30秒、61℃30秒、72℃30秒循环30次；72℃再延伸10分钟。
(4)DNA电泳
按照Hi-Di formamide 10μL、GSTAR ILS5500.2μL、PCR产物0.5μL配置体系。采用3130XL毛细管电泳仪进行检测。
(5)特异性检测
利用已提取的鸭、马、猪、鼠、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽、人12种动物DNA分别对复合扩增体系进行检测，结果显示仅目标种属可扩增出单一的扩增产物。
结果见图1～图12。由结果可知，本发明设计的引物组仅对目标动物源性成分得到明显的峰，而对其他11种动物DNA无法扩增，说明引物组具有良好的特异性。
(6)灵敏度检测
分别用12种鸭、马、猪、鼠、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽、人混合动物DNA溶液(总浓度0.1ng/μL)对复合扩增体系进行检测。
结果见图13。结果显示浓度0.1ng/μL混合DNA可获得12种常见动物的峰型。
(7)混合肉类样本的检测灵敏度。
以鸽DNA为基底制备鼠DNA质量分数分别为50％、10％、5％、1％、0.1％的混合DNA，利用复合扩增体系进行检测。
结果见图14～图18。结果显示，对混合肉类样本的检测灵敏度可达1‰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种鉴定常见动物种属的引物组，其特征在于，所述引物组由检测马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人的引物对组成；
检测马的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:2所示的反向引物；
检测鹅的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:4所示的反向引物；
检测兔的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:6所示的反向引物；
检测鼠的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:8所示的反向引物；
检测鸡的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:10所示的反向引物；
检测鹌鹑的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；
检测羊的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:14所示的反向引物；
检测鸽的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:16所示的反向引物；
检测鸭的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:18所示的反向引物；
检测猪的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:20所示的反向引物；
检测牛的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:22所示的反向引物；
检测人的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:24所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，每对引物对的一条引物修饰有荧光基团；
所述荧光基团包括5-TAMRA、5,6-FAM、5-ROX和5'HEX。
3.根据权利要求2所述引物组，其特征在于，检测马、鹅、兔的引物对的正向引物的5'端修饰5-TAMRA；
检测鼠、鸡、鹌鹑的引物对的正向引物的5'端修饰5,6-FAM；
检测羊、鸽的引物对的正向引物的5'端修饰5-ROX；
检测鸭、猪、牛、人的引物对的正向引物的5'端修饰5'HEX。
4.一种用于区分常见动物源性成分的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3中任意一项所述引物组和PCR扩增反应液，所述常见动物为马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液包括2×MultiplexPCR Master mix。
6.权利要求1～3中任意一项所述引物组或权利要求4或5所述试剂盒在区分常见动物源性成分中的应用，其特征在于，所述常见动物为马、鹅、兔、鼠、鸡、鹌鹑、羊、鸽、鸭、猪、牛和人。
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