CN109504787A - 一种检测动物源性的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测动物源性的试剂盒，所述试剂盒包括9对引物，所述9对引物核苷酸序列包括：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18。本发明提高检测效率、检测通量及检测稳定性，为动物源性成分源性鉴定探索了新的途径。
Description
技术领域
本发明属于动物种属鉴定检测试剂盒，尤其涉及一种检测动物源性的试剂盒及其应用。
背景技术
食品安全问题一直是人们日常关注的焦点之一，包括因肉类源性成分掺假造成的食品安全事件，如国内的假羊肉事件、欧洲马肉风波、超市撒尿牛丸无牛肉等等。
目前肉类源性成分鉴定的检测方法主要包括蛋白和核酸两个层面。蛋白检测方法包括：等电聚焦电泳技术(IEF)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)等，其具有一定的局限性：(1)由于用于检测的免疫原性蛋白在加工过程中经高温烹煮，会变性失活，因此该方法难以检测熟的肉类；(2)蛋白的组织特异性较差；(3)亲缘相近物种肉类之间分辨率低下，例如鸡肉和火鸡肉，绵羊肉和山羊肉等。而相对应的，作为核酸检测基础的DNA存在于绝大部分细胞，具有良好的热稳定性，而且其序列具有较高的物种特异性。由于DNA分析的分子生物学检测方法局限性很小，近年来在生肉或熟肉以及混合样本的物种鉴定中起到了至关重要的作用。
线粒体基因(mtDNA)在真核生物具有高度保守性已成为了最常用的物种鉴定分子标记，使用最多的是12SrRNA基因，16SrRNA基因和细胞色素b基因(cytochrome b，cytb)。目前，许多学者对mtDNA cytb基因进行序列分析，确定种属来源。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种动物源性的试剂盒及其应用。具体的，本发明建立一种用于猪、牛、羊、鸡、鸭、猫、狗、鼠和鲤鱼等9种肉类源性鉴定的6-FAM或HEX荧光标记的细胞色素b基因的复合扩增检测体系。首先，通过比对上述9种肉类的细胞色素b基因，发现存在一段种内保守种间特异的序列，针对每种肉源的这段序列设计引物，引物用6-FAM或HEX荧光标记。其次，对于所有细胞色素b基因的扩增产物经ABI3500毛细管电泳，根据特异峰的位置进行种属鉴定。通过优化反应体系，提高检测灵敏度，最后，应用此类方法对肉制品盲样进行检测以验证其重复性和使用价值。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种检测动物源性的试剂盒，所述试剂盒包括9对引物，所述9对引物核苷酸序列包括：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18。
优选地，所述每一对引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
优选地，将所述9对引物分为至少两组，分别使用相同或不同的荧光染料标记。
优选地，所述荧光染料标记物包括6-FAM和/或HEX。
优选地，将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.17使用蓝色荧光染料6-FAM进行标记；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.9、SEQ IDNO.15使用绿色荧光染料HEX进行标记。
优选地，所述试剂盒包括含有所述9对引物的扩增体系，所述扩增体系还包括反应混合物、热启动Taq酶和/或sdH2O组成的。
优选地，所述9对引物的终浓度分别包括：SEQ ID NO.1～2：0.18-0.22μM；SEQ IDNO.3～4：0.08-0.12μM；SEQ ID NO.5～6：0.08-0.12μM；SEQ ID NO.7～8：0.16-0.20μM；SEQID NO.9～10：0.12-0.16μM；SEQ ID NO.11～12：0.12-0.18μM；SEQ ID NO.13～14：0.06-0.10μM；SEQ ID NO.15～16：0.18-0.24μM；SEQ ID NO.17～18：0.12-0.18μM。
优选地，所述扩增体系的体积包括反应混合物10.0μL、9对引物5μL、热启动Taq酶(5U/μL)0.2-0.5μL。
一种根据上述任一项的试剂盒在检测动物源性中的应用。
优选地，所述动物源性包括猪、牛、羊、鸡、鸭、猫、狗、鼠，和/或鲤鱼。
优选地，所述动物源性的种属包括猪Susscrofa domestica、牛Bos taurus、羊Ovis aries、鸡Gallusgallus、鸭Anasplatyrhynchos、猫Felis catus、狗Canislupusfamiliaris、鼠Rattus norvegicus、或鲤鱼Cyprinus carpio。
优选地，所述试剂盒的扩增程序包括：变性：95℃2min；循环：94℃30s、60℃30s、65℃45s，30个循环；终止延伸：65℃10min，4℃保温维持。
与现有技术相比，本发明提供的一种检测动物源性的试剂盒及其应用，达到的技术效果是：本发明以检测动物的cytb基因为目的基因，使用荧光标记引物进行复合扩增。PCR扩增产物经ABI3500全自动基因分析仪检测，根据不同种属目标扩增序列的长度差异及荧光标记颜色进行种属鉴定。本发明适用于多种常见肉源，可同时鉴定多种肉源种属，检测方便快捷，并且弥补了目前市场上的动物源检测试剂盒不能检测未知样本的缺陷，极大降低了漏检率或假阴性率。
1.检测特异性强：本发明利用保守性较好的线粒体细胞色素b基因设计引物，引物特异性较好，通过数据库比对及实际样本的测试，大大缩减了结果假阳性或假阴性出现的可能。而且所用仪器规格都一致，保证结果的稳定性和可靠度。
2.目标肉类检测灵敏度高：本发明对于目标样品模板DNA的检测灵敏度达到1pg/反应。较传统的实时荧光PCR法的试剂盒提高了1-2个数量级。本方法还可用于易于降解的肉源DNA的检测。
3.掺假肉类检测灵敏度高：本发明可检测出掺假比例0.5％的肉类，较普遍只能检测的掺假比例10％的荧光定量PCR方法大大提高，而更低的掺假比例不符合掺假商贩的目的，因此足以适用于市场中掺假肉类的检测。
4.分辨率高：本发明采用毛细管电泳检测方法，检测分辨率可达到2bp，对于目的片段长度差距在2bp以上的产物均能进行分别。
5.检测效率高：本发明同时对9种不同种属肉源进行检测，满足不同样品的检测需要，可同时检测多种肉类样品，大大提高了检测效率。整个检测过程仅需约7个小时，效率较高。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1为实施例2所示的猪提取DNA扩增结果，只有PIG对应基因有扩增，其余无扩增；
图2为实施例2所示的牛提取DNA扩增结果，只有CATTLE对应基因有扩增，其余无扩增；
图3为实施例2所示的羊提取DNA扩增结果，只有SHEEP对应基因有扩增，其余无扩增；
图4为实施例2所示的鸡提取DNA扩增结果，只有CHICKEN对应基因有扩增，其余无扩增；
图5为实施例2所示的鸭提取DNA扩增结果，只有DUCK对应基因有扩增，其余无扩增；
图6为实施例2所示的猫提取DNA扩增结果，只有CAT对应基因有扩增，其余无扩增；
图7为实施例2所示的狗提取DNA扩增结果，只有DOG对应基因有扩增，其余无扩增；
图8为实施例2所示的鼠提取DNA扩增结果，只有RAT对应基因有扩增，其余无扩增；
图9为实施例2所示的鲤鱼提取DNA扩增结果，只有CARP对应基因有扩增，其余无扩增；
其中，图1～9中第三行峰为分子量markerAGCU SIZ-500的峰，由无锡中德美联生物技术有限公司生产及销售，以siz荧光标记，从75bp到500bp，分别是75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，共14个片段。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照常规产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
实施例1试剂盒的组成
本实施例提供一种检测动物源性的试剂盒，包括PCR扩增体系，PCR扩增体系可以包括反应混合物、DNA模板、引物混合物、热启动Taq酶、sdH2O，如表1。
表1PCR扩增体系
| 组分 | 体积 |
| 反应混合物 | 10.0μL |
| DNA模板 | 0.1～10ul含量为0.5ng～1ng |
| 引物混合物 | 5μL |
| 热启动Taq酶(5U/μL) | 0.2～0.5μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25.0μL |
PCR扩增体系可以通过常规方法进行优化获得，以提高检测灵敏度。
反应混合物可以包括MgCl26.0-7.5mM，Tris-HCl buffer 100-150mM，KCl90-130mM，dNTPs 6.0-8.0mM和BSA 1.5-2.0mg/ml。优选地，反应混合物可以包括MgCl27.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM和BSA 2mg/ml。
DNA模板可以为从待检样本中提取的DNA，其A260/A280在1.8-2.0，待检样本可以包括但不限于肉、肉制品、血、皮革、或含有肉源成分的饲料等中的一种或其任意组合。
引物混合物可以通过对多个动物源性的引物的筛选与测试获得。引物混合物可以包括9对引物。9对引物可以基于9种肉类的细胞色素b基因来设计，每对引物可以包括1条用6-FAM或HEX荧光标记的引物与1条非荧光标记引物。9对引物可以包括如表2所示的引物。其中狗的目的片段221bp，牛的目的片段217bp，羊的目的片段327bp，猪的目的片段346bp，鸭的目的片段226bp，鸡的目的片段320bp，猫的目的片段214bp，鼠的目的片段477bp，鲤鱼的目的片段264bp。
示例性说明引物的筛选与测试：
从NCBI genebank中下载引物设计模板序列，模板序列号分别为：猪KX982660.1、牛KX550272.1、羊KY366508.1、鸡KX534431.1、鸭KX534428.1、猫KT626623.1、狗KX379529.1、鼠KP233827.1、鲤鱼KX710076.1。
针对上述各序列的细胞色素b基因，使用clustalx软件进行比对，找到各种属种内保守性高且种间特异性强的序列，针对各种属的特异性序列，使用Oligo软件设计引物，并要确保所设计的引物具有适中的长度，Tm值相近且合适，GC含量适中，引物自身几乎无明显二聚体及回文结构产生，引物之间无二聚体产生。并将设计的引物使用BLAST在NCBI数据库中比对，以确保引物不会产生明显的非特异扩增。所设计的具体引物见表2。
表29对引物核苷酸序列表
引物委托上海生工合成，共分为两组；第一组猪(Susscrofa domestica)、鸡(Gallusgallus)、猫(Felis catus)、狗(Canis lupusfamiliaris)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)；第二组牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)、鸭(Anasplatyrhynchos)、鼠(Rattusnorvegicus)；第一组引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.17的采用蓝色荧光染料6-FAM进行标记，引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18不使用荧光标记；第二组引物SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15采用绿色荧光染料HEX进行标记，引物SEQ ID NO.4、SEQID NO 6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.16不使用荧光标记；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
单对引物做退火温度梯度扩增，扩增体系如表1。
使用表3中的扩增程序在热循环仪上扩增，退火温度分别为56℃，58℃，60℃，62℃，64℃。其余步骤温度相同，做梯度测试。
选择从56℃-64℃扩增特异性、扩增效率都好的9对引物用于复合扩增测试。
表3热循环仪的扩增程序
扩增产物可以经ABI3500全自动基因分析仪毛细管电泳，根据标记的荧光颜色及特异峰的位置即片段大小确定肉类源性；考察该方法所用引物在复配体系中的相互影响。
复合扩增各引物之间存在相互干扰，比如不同目的序列的引物形成二级结构、产生非特异扩增。复合扩增引物测试的扩增体系如表1，经过引物筛选之后最终确定了采用表1中的PCR扩增体系、表2中的引物，使用表3中的扩增程序进行扩增，所得产物中无非特异扩增的产生。引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。
PCR扩增产物采用毛细管电泳的方法进行检测，即取1μl PCR的扩增产物与0.5μl的内标SIZ加入到12μl的甲酰胺中，95℃变性3min后，冰浴3min，然后使用ABI 3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测，检测结果使用分析软件GeneMapper进行分析。认为，在目标种属对应的扩增片段长度±1bp范围内，峰高大于100RFU可认为初始模板中含有该种属的肉类源性成分。
上述示例性说明的目的仅便于理解和说明，其保护范围不受限制。
实施例2试剂盒的应用
1)取待检测样品-市场上购买的9种纯肉类(如肉、肉制品、血、皮革、含有肉源成分的饲料等)，采用常规方法(例如，英莱盾法医物证核酸提取试剂盒)进行DNA的提取，提取的DNA作为DNA模板，获得的9个DNA模板使用Nanodrop 2000分光光度计测试其A260/A280须在1.8-2.0，浓度应在0.05-10ng/μL，若高于该浓度，可使用超纯水将DNA稀释至该浓度范围(如，0.5ng/μL)再作为模板使用；
2)按表2中的引物及浓度配置引物混合物，按照如表1的PCR扩增体系进行加样；
3)将PCR扩增管置于热循环仪上，选择表3所示的扩增程序进行PCR扩增；扩增后的样品应避光保存；
表3热循环仪的扩增程序
4)扩增产物毛细管电泳检测
取1μl PCR的扩增产物与0.5μl的内标SIZ加入到12μl的甲酰胺中，95℃变性3min后，冰浴3min，然后使用ABI 3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测，检测结果使用分析软件GeneMapper进行分析。在目标种属对应的扩增片段长度±1bp的范围内，峰高大于100RFU可认为初始模板中含有该种属的肉类源性成分。
进一步地，经电泳检测及数据分析的操作对扩增产物进行毛细管电泳及结果分析，每个模板的测试经过3个重复，所得电泳结果见附图1-9，其是经美国AB公司GeneMapperIDX软件分析之后的9种动物源性成分扩增图谱。
根据附图得知，附图1-9依次为猪(Sus scrofa domestica)、牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)、鸡(Gallusgallus)、鸭(Anasplatyrhynchos)、猫(Felis catus)、狗(Canislupusfamiliaris)、鼠(Rattus norvegicus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)，各物种提取DNA模板均能扩增出单一目的峰。
综上所述，本发明的试剂盒可以根据标记的荧光颜色及特异峰的位置即片段大小确定肉类源性；可以考察该方法所用引物在复配体系中的相互影响；可以考察该方法中所用引物的特异性及检测灵敏度；可以对大量肉类盲样进行检测。
除此之外，本发明检测灵敏度较高，可达到皮克级。与现已有报道的检测方法相比具有很大优势：首先，检测准确性高，采用种内保守性较好的线粒体基因与检测灵敏度较高的毛细管电泳检测平台，大大提高了结果的准确性；其次，检测效率高，可在同一体系中同时检测9种动物源性的种属，极大提高了检测通量。总之，与其他发明相比本发明提高了检测效率、检测通量及检测稳定性，为动物源性成分源性鉴定探索了新的途径。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种检测动物源性的试剂盒及其应用
<141> 2019-01-16
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctagaaac atgaaacatt ggagta 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taggagatgt acggctgcga 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tattcctagc aatacactac acat 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
<211> 24
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<400> 9
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<211> 21
<212> DNA
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ggctcattct accagggtct g 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 24
<212> DNA
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<400> 13
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<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgatataag ggatggcaga gagaa 25
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcagtagac aaagcaaccc taa 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgttgggaa tggagcgtag 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtgtaatcc ttctactact agtca 25
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgtggaggaa cagcaggtgg 20
Claims (12)
1.一种检测动物源性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括9对引物，所述9对引物核苷酸序列包括：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述每一对引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，将所述9对引物分为至少两组，分别使用相同或不同的荧光染料标记。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料标记物包括6-FAM和/或HEX。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17使用蓝色荧光染料6-FAM进行标记；SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15使用绿色荧光染料HEX进行标记。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有所述9对引物的扩增体系，所述扩增体系还包括反应混合物、热启动Taq酶和/或sdH2O组成的。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述9对引物的终浓度分别包括：SEQ IDNO.1～2：0.18-0.22μM；SEQ ID NO.3～4：0.08-0.12μM；SEQ ID NO.5～6：0.08-0.12μM；SEQID NO.7～8：0.16-0.20μM；SEQ ID NO.9～10：0.12-0.16μM；SEQ ID NO.11～12：0.12-0.18μM；SEQ ID NO.13～14：0.06-0.10μM；SEQ ID NO.15～16：0.18-0.24μM；SEQ ID NO.17～18：0.12-0.18μM。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增体系的体积包括：反应混合物10.0μL、9对引物5μL、热启动Taq酶(5U/μL)0.2-0.5μL。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒在检测动物源性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述动物源性包括猪、牛、羊、鸡、鸭、猫、狗、鼠，和/或鲤鱼。
11.根据权利要求10所述的应用，所述动物源性的种属包括猪Sus scrofa domestica、牛Bos taurus、羊Ovis aries、鸡Gallusgallus、鸭Anas platyrhynchos、猫Felis catus、狗Canis lupusfamiliaris、鼠Rattus norvegicus、或鲤鱼Cyprinus carpio。
12.根据权利要求10所述的应用，所述试剂盒的扩增程序包括：变性：95℃2min；循环：94℃30s、60℃30s、65℃45s，30个循环；终止延伸：65℃10min，4℃保温维持。
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