CN111830218A - 一种畜禽肉动物源性鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种畜禽肉动物源性鉴别方法，属于食品质量安全检测领域，所述方法包括对不同动物肌肉样品进行氨基酸含量测定和组成成分分析，建立鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊等6种动物肌肉新鲜肉样和绝干物质基础样品氨基酸模式，并通过判别分析对不同物种进行归类；本发明中不同动物肌肉的氨基酸模式差异显著，可以用于区分不同物种肉类来源，鉴别肉类制品是否掺假；该方法快速、简便，为食品掺假鉴别提供了新的途径，具有一定的可行性和可操作性，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种畜禽肉动物源性鉴别方法。
背景技术
随着食品安全事件的屡次发生，畜禽肉与肉制品的安全与否直接关系到人民的健康，引起了各国政府和消费者对肉食品安全性的高度关注。肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益，以鸡肉冒充猪肉、以猪肉冒充牛羊肉、“挂鹅头卖鸭肉”以及用低价劣质的肉冒充高价优质的肉等等，极大地损坏了消费者的利益和健康。传统的方法是通过肉制品色泽、味道以及肉类纹理等进行肉类来源鉴别，虽然对于市场上假冒生肉的鉴别起到了一定的作用，但仍然存在某些缺陷，其检测对象较为单一，主观性太强，无法通用于辨别肉与肉制品掺假，特别是对熟肉制品种类来源的鉴别方面还不够成熟。因此建立快速、准确的检测方法，对肉与肉制品进行动物源性成分鉴定，不仅能够维护消费者利益，而且可以避免假冒伪劣食品的出现，有利于维护肉类产业健康发展。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，蛋白质中各种必需氨基酸的相互比例，即氨基酸构成比或相互比值叫做氨基酸模式。氨基酸模式是将该蛋白质中某种特定氨基酸(比如色氨酸)含量假定为1，再分别计算其它必需氨基酸与色氨酸的相应比值而得到。利用氨基酸模式进行食品掺假分析是进行食品安全评价的一种崭新尝试，该方法准确、快捷，目前在畜禽肉掺假鉴别中还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种畜禽肉动物源性鉴别方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低，以克服现有技术中的不足之处。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种畜禽肉动物源性鉴别方法，所述鉴别方法利用氨基酸分析仪测定不同种类动物肌肉氨基酸含量，建立不同种类动物肌肉样品的氨基酸模式，通过判别分析对不同动物进行归类。
具体地，所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)检测分析不同种类动物肌肉样品的氨基酸含量，建立不同种类动物肌肉样品的氨基酸模式；
(2)计算判别函数，进行判别函数检验，绘制判别分析图；
(3)检测分析待测样品的氨基酸含量，建立其氨基酸模式；
(4)代入步骤(2)所得的判别函数，计算结果并表示在判别分析图中，判断其肉源性。
本发明还提供了前述鉴别方法在鉴别肉制品掺假中的应用。
本发明还提供一种动物肌肉样品氨基酸模式的建立方法，所述方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：将样品制成肉糜或粉状；
(2)试样水解：6mol/L盐酸条件下对样品进行水解，水解温度110℃水解时间为22h，调pH为2.2；
(3)检测样品的氨基酸含量：混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度；
(4)主成分分析：采用Factor进行主成分分析，以累计贡献率≥85％作为入选的主成分；
(5)结合主成分分析以及变异系数情况选择氨基酸指标，并计算氨基酸指标的相互比值，得到氨基酸模式。
作为本发明的进一步改进，所述的动物肌肉样品为新鲜样品和绝干物质基础样品。
作为本发明的进一步改进，所述的动物肌肉样品为鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊的新鲜样品或绝干物质样品。
作为本发明的进一步改进，所述样品前处理的方法为：
1.新鲜样品：
以市售合格的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等为材料，充分搅匀至肉糜状。
2.绝干物质基础样品：
(1)以市售新鲜的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等为材料，充分搅匀至肉糜状；
(2)于45℃烘箱中烘干5～6小时，制成风干样品，研磨成粉状，待水解，测定氨基酸含量；
(3)同时取适量粉状风干样品置于105℃±1℃烘箱中再次烘干4小时，计算干物质率；
(4)将风干样品氨基酸含量换算成绝干物质基础样品氨基酸含量。
作为本发明的进一步改进，所述的试样水解的步骤为：
(1)称取样品，新鲜样品称取50mg，风干样品称取15mg，置于水解管内，加8～10mL6mol/L盐酸溶液；
(2)将水解管接到真空泵的抽气管上抽真空封口；
(3)将已封口的水解管置于盛有海沙的容器中，110℃±1℃的电热鼓风恒温箱内水解22h，取出冷却至室温。
(4)打开水解管，将水解液转移至50mL试剂瓶内，用超纯水冲洗水解管，水洗液移入同一50mL试剂瓶内；
(5)用6mol/L盐酸和500g/L氢氧化钠溶液调节PH至2.2，再用pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至50ml，振荡混匀；
(6)吸取1ml溶液通过0.22μm滤膜过滤后，转移至进样瓶，待测定。
作为本发明的进一步改进，所述测定含量的氨基酸为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、蛋氨酸。
作为本发明的进一步改进，所选择氨基酸指标为蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸以及脯氨酸。
作为本发明的进一步改进，在计算氨基酸指标相互比值时以蛋氨酸含量为1计算出其他氨基酸的相应比值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出肉类样品中牛、羊、猪、鸡、鸭或鹅的肉源成分，为市场上掺假肉类提供便捷的鉴定方法。
(2)本发明的方法不局限于样品的状态，无论是生鲜样品还是粗加工制品均可操作，这样便于对市场上产品进行便捷、有效的监管，具有更高的实用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同物种新鲜肉样氨基酸模式图，图中1代表鸡肉、2代表鸭肉、3代表鹅肉、4代表猪肉、5代表牛肉、6代表羊肉。横轴代表典型判别函数1，纵轴代表典型判别函数2。
图2为不同物种绝干物质基础样品氨基酸模式图，图中1代表鸡肉、2代表鸭肉、3代表鹅肉、4代表猪肉、5代表牛肉、6代表羊肉。横轴代表典型判别函数1，纵轴代表典型判别函数2。
图3为市场购买新鲜鸡肉样品氨基酸模式图，图中1代表鸡肉、2代表鸭肉、3代表鹅肉、4代表猪肉、5代表牛肉、6代表羊肉、7代表市场购买的鸡肉样。横轴代表典型判别函数1，纵轴代表典型判别函数2。
图4为市场购买鸡肉绝干物质样品氨基酸模式图，图中1代表鸡肉、2代表鸭肉、3代表鹅肉、4代表猪肉、5代表牛肉、6代表羊肉、7代表市场购买的鸡肉。横轴代表典型判别函数1，纵轴代表典型判别函数2。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，本发明中的数值均为6个重复样品的平均值。对于本发明中的数值范围，应理解为公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
本发明建立了不同种类动物肌肉样品的氨基酸模式，通过判别分析来判断不同种类畜禽肉的肉源性。
实施例1
试样前处理方法
1、新鲜样品
以市售合格的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等为材料，充分搅匀至肉糜状。
2、绝干物质基础样品
(1)以市售新鲜的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等为材料，充分搅匀至于肉糜状；
(2)于45℃烘箱中烘干5～6小时，制成风干样品，研磨成粉状，待水解、测定氨基酸含量；
(3)同时取适量粉状风干样品置于105℃±1℃烘箱中再次烘干4小时，计算干物质率；
(4)将风干样品氨基酸含量换算成绝干物质基础样品氨基酸含量。
3、试样水解
(1)称取样品，新鲜样品称取50mg，风干样品称取15mg,置于水解管内，加8～10mL6mol/L盐酸溶液；
(2)将水解管接到真空泵的抽气管上抽真空(接近0Pa)封口；
(3)将已封口的水解管置于盛有海沙的容器中，110℃±1℃的电热鼓风恒温箱内水解22h，取出冷却至室温。
(4)打开水解管，将水解液转移至50mL试剂瓶内，用超纯水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL试剂瓶内；
(5)用6mol/L盐酸和500g/L氢氧化钠溶液调节PH至2.2，再用pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至50ml，振荡混匀；
(6)吸取1ml溶液通过0.22μm滤膜过滤后，转移至进样瓶，待测定。
4、测定
利用L-8900全自动氨基酸分析仪测定16种氨基酸含量。混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。16种氨基酸分别为天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)。
5、数据处理
氨基酸测定数据采用Excel软件建库、处理，采用SPSS16.0软件进行数据统计分析。采用one-way ANOVA进行显著性检验；采用Factor进行主成分分析，以累计贡献率≥85％作为入选的主成分；采用Hierarchical cluster analysis进行聚类分析；采用Discriminant进行样本判别分析。
实施例2
6种动物新鲜肌肉样品氨基酸模式的建立
1、6种动物16种氨基酸含量测定
不同动物之间16种氨基酸含量具有较大差异，16种氨基酸组成相对含量以及变异系数情况见表1。
表1 6种动物肌肉16种氨基酸含量以及变异系数
单位：mg/100g
续表1
2、主成分分析
相关性分析显示，各种氨基酸之间绝大多数多呈中等以上相关，说明所选初始变量存在信息上的重叠，可进行主成分分析。对16种氨基酸进行主成分分析，计算出各主成分的特征率和贡献率，具体见表2和表3。
表2相关系数矩阵特征值和累积贡献率
由表2可见，前4个主成分可以解释全部变异的88.65％，其中第1、2、3、4主成分分别解释总变异的56.35％、71.16％、81.75％和88.65％。根据累积贡献率达85％以上，即信息损失量在15％以下的原则，在选取4个特征值后，累积贡献率就达到88.65％，故将前4个特征值分别定义为第1、第2、第3主成分和第4主成分。
表3 4个主成分的特征向量
由表3可见，第l主成分包括天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)；第2主成分包括谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)；第3主成分包括缬氨酸(Val)；第4主成分包括组氨酸(His)。
3、不同样本氨基酸模式比较
结合主成分分析以及变异系数情况选择蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)以及脯氨酸(Pro)6个指标进行氨基酸模式分析，以含量相对较少的蛋氨酸(Met)为1计算出其他氨基酸的相应比值，各种类样品均具有独特的氨基酸模式，具体见表4。
表4 6种样本简洁氨基酸模式
4、判别分析
利用典型判别函数(Canonical Discriminate Function)对鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等6种样本进行判别分析。因为分组变量是6类，所以可以得到5个判别函数，其中第一判别函数解释了数据的81.4％，第二判别函数解释了10.8％，前两个判别函数解释了92.2％，可以用于判别分析；而且判别函数检验(Wilks Lambda)显示两个判别函数P值均小于0.05，说明两个判别函数都是显著成立的，具有显著的差异和判别力。
结果显示，鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉等6个物种分别集中在不同的区域，彼此之间差异明显，很容易辨别。具体见表5和表6和图1。
表5典型判别函数特征值
表6判别函数检验
注：Wilks'lambda是组内平方和与总平方和之比。当所有观测的组均值相等时，Wilks'lambda值为1；当组内变异与总变异相比小时，Wilks'lambda值接近于0。Wilks'lambda小表示组间有差异，在判别分析中，只有组均值不等时，判别分析才有意义。
实施例3
建立6种动物肌肉绝干物质基础样品氨基酸模式
1、6种动物肌肉绝干物质基础样品16种氨基酸含量测定
6种动物肌肉绝干物质基础样品16种氨基酸含量测定结果显示，不同动物16种氨基酸含量之间差异较大。具体见表7。
表7 6种动物肌肉绝干物质基础样品16种氨基酸含量和变异系数
单位：mg/100g
续表7
2、主成分分析
相关分析显示16种氨基酸相互之间绝大多数多呈中等以上相关，说明所选初始变量存在信息上的重叠，可以进行主成分分析。对16种氨基酸进行主成分分析，计算出各主成分的特征率、贡献率以及主成分的特征向量，具体见表8和表9。
表8相关系数矩阵特征值和累积贡献率
由表8可见，前3个主成分可以解释全部变异的90.575％，其中第1、2、3主成分分别解释总变异的64.240％、18.768％和7.567％。根据累积贡献率达85％以上，即信息损失量在15％以下的原则，在选取3个特征值后，累积贡献率就达到90.575％，故将前3个特征值分别定义为第1、第2和第3主成分。
表9 3个主成分特征向量值
由表9可见，二次因子分析显示，第l主成分包括天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；第2主成分包括丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)；第3主成分包括脯氨酸(Pro)。
3、6种动物肌肉绝干物质基础样品氨基酸模式比较
结合主成分分析以及变异系数情况选择天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)以及脯氨酸(Pro)等6个指标进行氨基酸模式分析，以含量相对较少的蛋氨酸(Met)为1计算出其他氨基酸的相应比值，各种类样品均具有独特的氨基酸模式，具体见表10。
表10 6种动物绝干物质基础样品简洁氨基酸模式
4、判别分析
因为分组变量是6类，所以可以得到5个判别函数，其中第一判别函数解释了数据的79.5％，第二判别函数解释了9.7％，前两个判别函数解释了89.2％，可以用于判别分析；而且判别函数检验(Wilks Lambda)显示两个判别函数P值均小于0.05，说明两个判别函数都是显著成立的，具有显著的差异和判别力。结果显示，鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉、羊肉等6个物种分别集中在不同的区域，彼此之间差异明显，很容易辨别，具体见表11、表12和图2。
表12典型判别函数特征值
表13判别函数检验
注：Wilks'lambda是组内平方和与总平方和之比。当所有观测的组均值相等时，Wilks'lambda值为1；当组内变异与总变异相比小时，Wilks'lambda值接近于0。Wilks'lambda小表示组间有差异，在判别分析中，只有组均值不等时，判别分析才有意义。
实施例4
购买超市里的新鲜鸡胸肉样12块，随机选取6块制成新鲜样本1，剩余6块制成绝干物质基础样本2，按上述样品前处理的方法制样处理后，分别上机检测其氨基酸含量，检测结果如表13和表14所示。将检测结果1和2分别代入实施例2和实施例3中的主成分分析公式中，生成氨基酸模式图，如图3和图4所示。检测结果表明待测肉样很好的划分到鸡肉样品范围内，达到了鉴别的目的。
表13市场购买鸡肉新鲜样品氨基酸含量
单位：mg/100g
续表13
表14市场购买鸡肉样品绝干物质氨基酸含量
单位：mg/100g
续表14
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种畜禽肉动物源性鉴别方法，其特征在于，利用氨基酸分析仪测定不同种类动物肌肉氨基酸含量，建立不同种类动物肌肉样品的氨基酸模式，通过判别分析对不同动物进行归类；
所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)检测分析不同种类动物肌肉样品的氨基酸含量，建立不同种类动物肌肉样品的氨基酸模式；
(2)计算判别函数，进行判别函数检验，绘制判别分析图；
(3)检测分析待测样品的氨基酸含量，建立其氨基酸模式；
(4)代入步骤(2)所得的判别函数，计算结果并表示在判别分析图中，判断其肉源性。
2.一种如权利要求1所述的动物源性鉴别方法在鉴别肉制品掺假中的应用。
3.一种动物肌肉样品氨基酸模式的建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：将样品制成肉糜或粉状；
(2)样品水解：酸性条件下对样品进行水解；
(3)检测样品的氨基酸含量：混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度；
(4)主成分分析：采用Factor进行主成分分析，以累计贡献率≥85％作为入选的主成分；
(5)结合主成分分析以及变异系数情况选择氨基酸指标，并计算氨基酸指标的相互比值，得到氨基酸模式。
4.如权利要求3所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，所述的动物肌肉样品包括新鲜样品和绝干物质基础样品。
5.如权利要求4所述的动物肌肉样品，其特征在于，所述肌肉样品为鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊中的一种或多种。
6.如权利要求5所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，所述的样品前处理具体步骤为：
新鲜样品：
以市售合格的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉为材料，充分搅匀至肉糜状。
绝干物质基础样品：
(1)以市售新鲜的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊肉为材料，充分搅匀至肉糜状；
(2)于45℃烘箱中烘干5～6小时，制成风干样品，研磨成粉状，待水解，测定氨基酸含量；
(3)同时取适量粉状风干样品置于105℃±1℃烘箱中再次烘干4小时，计算干物质率；
(4)将风干样品氨基酸含量换算成绝干物质基础样品氨基酸含量。
7.如权利要求3所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，所述试样水解具体步骤为：
(1)称取样品，新鲜样品称取50mg，风干样品称取15mg，置于水解管内，加8～10mL6mol/L盐酸溶液；
(2)将水解管接到真空泵的抽气管上抽真空封口；
(3)将已封口的水解管置于盛有海沙的容器中，110℃±1℃的电热鼓风恒温箱内水解22h，取出冷却至室温；
(4)打开水解管，将水解液转移至50mL试剂瓶内，用超纯水冲洗水解管，水洗液移入同一50mL试剂瓶内；
(5)用6mol/L盐酸和500g/L氢氧化钠溶液调节PH至2.2，再用pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至50ml，振荡混匀；
(6)吸取1ml溶液通过0.22μm滤膜过滤后，转移至进样瓶，待测定。
8.如权利要求3所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，测定含量的氨基酸为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。
9.如权利要求3所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，所选择氨基酸指标为蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸以及脯氨酸。
10.如权利要求3所述的氨基酸模式的建立方法，其特征在于，计算氨基酸指标相互比值时以蛋氨酸含量为1计算出其他氨基酸的相应比值。
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