CN110551827B

CN110551827B - 一种与鸡蛋形指数相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110551827B
Application number: CN201910884720.1A
Authority: CN
Inventors: 曲亮; 王克华; 沈曼曼; 卢建; 马猛; 胡玉萍; 郭军; 王星果; 李尚民; 窦套存; 李永峰
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110551827A

Abstract

本发明公开了一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记，属于分子标记与遗传育种领域。所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第4号染色体第63202297位，且该处碱基是G或T。本发明还提供了用于检测上述SNP标记的引物组合及其应用。利用该SNP分子标记和引物组合，可建立蛋形指数高效准确的分子标记辅助育种方法，从而有效地对蛋形指数进行选择，促进地方特色蛋鸡产业的发展。

Description

一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

随着我国经济的迅速发展，人们消费水平的提高，对地方特色蛋鸡的需求越来越高，我国地方特色蛋鸡的年饲养量已超过2亿只，占蛋鸡总量的10％。地方特色蛋鸡市场份额提高的同时，人们对蛋品质的要求越来越高。

蛋形指数与蛋内部品质相关性不大，主要影响人们对鸡蛋的外观选择。我国消费群体倾向于选择蛋形指数较大的蛋，我国地方蛋鸡的选育大多迎合了这一需求。然而对于我国地方蛋鸡，即使是同一个品种，蛋形指数也存在较大的变异系数，整体均匀度不高，且生产中对蛋形指数的选择大多采用主观选择，这种选择方法受不同选育人员的主观影响较大，且蛋形指数的遗传力在0.18-0.5之间，属于中低度遗传力性状，因此，常规选育遗传进展缓慢。

随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择方法(marker assistedselection,MAS)被越来越多地应用于育种环节中加快了遗传进展。因此对蛋形指数进行分子标记辅助选择，可以有效改善蛋形指数的选育方法，加快选育工作，促进我国地方蛋鸡的发展。

发明内容

为了解决生产中蛋形指数选育方法的不足，发明人进行了大量研究，意外地发现国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第1号染色体上物理位置第169981107核苷酸处的G>T突变与鸡蛋形指数相关，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第4号染色体第63202297位，且该处碱基是G或T。所述的SNP标记在国际鸡参考基因组上的名称为rs317038353。

本发明第二方面提供一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第216位碱基是G或T。

本发明第三方面提供检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定鸡蛋形指数性状的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第四方面提供一种用于鉴定鸡蛋形指数性状的试剂盒，包括能够检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。

本发明的第五方面提供一种选育具备特定蛋形指数性状的鸡种或品系的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡种或品系个体的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中本发明第一方面或第二方面所述SNP分子标记的基因型，

如果需要具备高蛋形指数性状，则选择GG基因型个体，淘汰GT和TT基因型个体。如果需要具备低蛋形指数性状，则选择GT和TT基因型个体，淘汰GG基因型个体。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明中，GG基因型的蛋形指数高，GT和TT基因型的蛋形指数低。

在本发明的一些实施方案中，所述高蛋形指数或蛋形指数高是指蛋形指数高于蛋形指数参考值，所述低蛋形指数或蛋形指数低是指蛋形指数低于蛋形指数参考值。在本发明的一些优选实施方案中，所述参考值是指特定鸡种或品系大量样本鸡蛋形指数的平均值或中位值，在本发明的一些更优选实施方案中，所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中，所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施方案中，所述大量样本是指1512只。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术具有如下的优势和效果：

(1)利用本发明的与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记进行分子标记辅助选择，能够有效地提高蛋形指数。

(2)本发明同时提供了该SNP分子标记的序列以及鉴定的引物，通过该分子标记和引物，可利用Sanger测序法建立快速高效准确的分子标记辅助育种技术，提高蛋形指数，可在早期进行选育，降低饲养成本，提高生产效益。

(3)本发明提供的SNP分子标记对蛋形指数的表型效应均在1％以上，利用该SNP分子标记可有效提高蛋形指数，达到快速选育目的。

附图说明

图1示出了由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体关于蛋形指数多变量的全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)曼哈顿图；其中横坐标代表鸡的染色体编号；纵坐标代表-logP值，黑色水平线代表以8.43×10^-7为显著性表达水平阈值。

图2示出了4号染色体上显著位点的连锁不平衡分析。

图3示出了不同基因型蛋形指数的表型值；其中横坐标代表不同周龄，纵坐标代表不同周龄下的蛋形指数值。

图4示出了在G1品系中的应用Sanger测序得到的不同基因型。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可购买到的。

下述实施例1中，利用由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡，采用游标卡尺测定鸡蛋的长径和短径，蛋形指数以长径/短径表示。试验在江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地进行，所有母鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。

实施例1全基因组关联分析

(1)采集F2代群体母鸡翅静脉血，利用标准的酚-氯仿法进行基因组DNA提取。通过标准的程序进行DNA质量检测、浓度测定等，最终选择以OD260/280比值在1.8-2.0之间为合格以备后续试验。统一将浓度稀释为50ng/μl用于基因分型。

(2)利用Affymetrix公司的鸡600K高密度基因芯片进行基因分型，参照芯片说明书进行基因分型和质量控制，主要包括：利用APT v1.16.0进行分型前的质量控制；PLINK v1.90进行质量控制，剔除call rate小于0.97，偏离哈代温伯格平衡≤10^-6的SNP标记；BEAGLE v4.0选择R²>0.5的SNPs进行填充。质控剩余了435867个SNPs和1512个样本用于后续分析。

(3)全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)方法：进行GWAS分析之前为了消除假阳性，计算多维度主成分分析，以前5个主成分作为协变量加入到模型中。利用R脚本“simpleM”方法计算各SNPs位点独立检验估计，得到了59308个indepSNPs。利用Bonferroni进行校正，得到基因组显著水平为8.43×10^-7。利用GEMMA v0.94软件中多变量混合线性模型对多个时期蛋形指数进行GWAS分析，模型为：

其中Y^*代表n个样本d个表型值的矩阵；W代表协方差矩阵(在本实施例中代表前5个主成分)；α^*代表对应系数包括截距的向量；X标记的基因型的n个样本的向量；β^*代表标记的替代效应；Z代表的随机效应相关矩阵，

Z_d代表第d个性状的随机效应关联矩阵；μ^*代表随机效应；ε^*代表误差效应；I代表单位矩阵。

GWAS分析的结果如图1所示，最显著的SNP分子标记为位于4号染色体的rs317038353，P＝5.37×10^-8；由于显著关联区域可能是由连锁不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)造成，以4号染色体鉴定到的所有显著的SNP进行LD分析，如图2所示，经LD分析后，显著性位点位于均连锁不平衡状态。

(4)不同基因型的蛋形指数表型值由图3所示：GG基因型的鸡蛋蛋形指数高，而GT和TT基因型的鸡蛋蛋形指数相对较低。在继代选育过程中选留GG基因型的个体，淘汰GT和TT基因型的个体，可以得到高蛋形指数性状的个体。

实施例2蛋形指数的等位基因检测方法的建立

(1)对与蛋形指数显著相关的SNP标记位点的目的片段引物扩增4号染色体上一段246bp核苷酸片段，序列扩增的上下游引物为：

上游引物esi-F：AGGCACGTTTCTGACAAACA(SEQ ID NO.1)

下游引物esi-R：CTGCAAACTGAGTCTTCCCC(SEQ ID NO.2)

(2)PCR扩增：

本实施例中试剂是南京诺维赞公司获得，引物合成及测序由上海生工公司完成。

以获取的G1品系鸡基因组DNA为模板，使用引物esi-F和esi-R进行PCR扩增。

扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

(3)序列测序与鉴定

PCR扩增的产物esi_SEQ在上海生工公司进行Sanger测序，基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组GRCg6a Primary Assembly进行比对，得出对应的SNP标记位点突变，如图4所示，在216位碱基为G或T，G1品系需要选育高蛋形指数，则选留GG基因型个体，淘汰TT和GT基因型个体。

PCR扩增产物esi_SEQ如下所示(SEQ ID NO.3)：

注：序列中标注的K为突变位点，用加粗并标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，序列的首尾加粗显示为引物序列。

实施例3分子标记SNP rs317038353G>T突变的效应分析

本发明提供的一个与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记，对各周龄蛋形指数的SNP效应均在1％以上。利用所述SNP标记进行分子标记进行辅助选择，能够显著提高鸡蛋蛋形指数，加快地方特色蛋鸡的选育进程。

表1SNP标记对各周龄蛋形指数的效应分析

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种与鸡蛋形指数相关的SNP分子标记及其应用

<130> XY-2019-1-W-073

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggcacgttt ctgacaaaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcaaactg agtcttcccc 20

<210> 4

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggcacgttt ctgacaaaca actgtcagaa gcagaataac tacaggttct gcctcaccca 60

aagcacagag tggacaactg ctcaaagccc cttatagctc tactaacggg agttagggat 120

gcactaaagg aggaaaacat gagaaaagtt attttctttg catacacaga atttactgga 180

tccaaaatgc attttctgag tgtggacata cgaatkaaga ggatgggggg aagactcagt 240

ttgcag 246

Claims

1.检测一种SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡蛋形指数高低的试剂盒中的应用，其中，

所述待测鸡选自由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体；

所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第216位碱基是G或T。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.一种选育具备特定蛋形指数性状的鸡品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待测个体的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中一种SNP分子标记的基因型，

如果需要具备高蛋形指数性状，则选择GG基因型个体，淘汰GT和TT基因型个体；如果需要具备低蛋形指数性状，则选择GT和TT基因型个体，淘汰GG基因型个体，其中，

所述待测个体选自由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体，

所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第216位碱基是G或T，

所述高蛋形指数是指高于蛋形指数参考值，所述低蛋形指数是指低于蛋形指数参考值，其中，所述参考值是指由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体大量样本鸡蛋形指数的平均值或中位值。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。