CN110468221B - 一种与鸡腺胃乳头数相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记，属于分子标记与遗传育种领域。所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第3号染色体第19459654位，且该处碱基是C或T。本发明还提供了用于检测上述SNP标记的引物组合及其应用。利用该SNP分子标记和引物组合，可建立腺胃乳头数高效准确的分子标记辅助育种方法，从而有效地开创腺胃乳头数的选育方法，提高饲料转化率，促进我国养鸡产业的发展。

Description

一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

随着人口、收入增长以及城市化的发展，养鸡行业发展良好。目前，家禽养殖面临的最大问题是饲料资源相对匮乏，如何在保证鸡肉蛋品质的前提下，提高饲料转化率，促进家禽养殖业持续健康发展，是目前比较关注的焦点问题。生产中对鸡个体的耗料量的记录和统计较为困难，难以在育种实践中对饲料转化率进行有效地选择，限制了鸡产业的发展。利用间接性状指标或分子标记则是未来饲料转化率选育的有效手段。

禽类的腺胃相当于哺乳动物的胃，在胚胎期已完成结构的发育，主要功能是分泌蛋白酶和盐酸对食物进行软化及化学消化。不同品种鸡的腺胃结构不同使鸡的饲料消化率不同，研究表明矮小蛋鸡的腺胃乳头数较正常脚型鸡多36％，饲料转化率提高20％。因此选育腺胃乳头数多的鸡种或品系将是提高饲料转化率的最有效途径，而目前生产中尚未对腺胃乳头数进行选择，更无相关分子标记的应用。

发明内容

为了解决生产中腺胃乳头数选育方法的空白，发明人进行了大量研究，意外地发现国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第3号染色体上物理位置第19459654核苷酸处的C>T突变与鸡腺胃乳头数相关，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第3号染色体第19459654位，且该处碱基是C或T。

本发明第二方面提供一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第155位碱基是C或T。

本发明第三方面提供检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡腺胃乳头数性状的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第四方面提供一种用于鉴定鸡腺胃乳头数性状的试剂盒，包括能够检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第五方面提供一种选育饲料转化能力强的鸡的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中本发明第一方面或第二方面所述SNP分子标记的基因型，

选择CC和TT基因型鸡，淘汰CT基因型鸡。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明中，所述饲料转化能力强是指腺胃乳头数多。

在本发明中，CC和TT基因型的腺胃乳头数较多，CT基因型的腺胃乳头数较少。

在本发明的一些实施方案中，所述腺胃乳头数较多是腺胃乳头数大于参考值，所述腺胃乳头数较少是指腺胃乳头数小于参考值。在本发明的一些优选实施方案中，所述参考值是指特定鸡种大量样本腺胃乳头数的平均值或中位值，在本发明的一些更优选实施方案中，所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中，所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施例中，所述样本量为1252只。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术具有如下的优势和效果：

(1)利用本发明的与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记进行分子标记辅助选择，能够有效地增加鸡腺胃乳头数；

(2)本发明同时提供了该SNP分子标记的序列以及鉴定的此物，通过该分子标记和引物，可利用Sanger测序法建立快速高效准确的分子标记辅助育种技术，使腺胃乳头数提高，可在早期进行选育，降低饲养成本，提高生产效益。

附图说明

图1示出了由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体关于腺胃乳头数单变量的全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)曼哈顿图；其中横坐标代表鸡的染色体编号；纵坐标代表-logP值，黑色水平线代表以8.43×10^-7为显著性表达水平阈值。

图2示出了不同基因型腺胃乳头数的表型值。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例1中，利用由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡，在72周龄将鸡屠宰后，统计每个个体的腺胃乳头数。试验在江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地进行，所有母鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。

实施例1全基因组关联分析

(1)采集F2代群体母鸡翅静脉血，利用标准的酚-氯仿法进行基因组DNA提取。通过标准的程序进行DNA质量检测、浓度测定等，最终选择以OD260/280比值在1.8-2.0之间为合格以备后续试验。统一将浓度稀释为50ng/μl用于基因分型。

(2)利用Affymetrix公司的鸡600K高密度基因芯片进行基因分型，参照芯片说明书进行基因分型和质量控制，主要包括：利用APT v1.16.0进行分型前的质量控制；PLINK v1.90进行质量控制，剔除call rate小于0.97，偏离哈代温伯格平衡≤10^-6的SNP标记；BEAGLE v4.0选择R²>0.5的SNPs进行填充。质控剩余了435867个SNPs和1252个样本用于后续分析。

(3)全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)方法：进行GWAS分析之前为了消除假阳性，计算多维度主成分分析，以前5个主成分作为协变量加入到模型中。利用R脚本“simpleM”方法计算各SNPs位点独立检验估计，得到了59308个indepSNPs。利用Bonferroni进行校正，得到基因组显著水平为8.43×10^-7。利用GEMMA v0.94软件中混合线性模型对腺胃乳头数进行GWAS分析，模型为：y＝Wα+xβ+u+ε，中y代表所有个体的表型性状的n×1向量值；W指协变量矩阵(指包括一列向量1和5个主成分的固定效应)，α为包括截距在内对应系数的一列向量，Wα代表群体结构效应；x为标记基因型向量，β标记位点效应的大小，xβ代表SNP的效应；u为个体的随机效应向量，u～N(0，KV_g)，K代表由SNP标记计算出的已知的n×n遗传关系矩阵，V_g多基因加性方差；ε代表n×1随机误差向量，符合ε～N(0，IV_e)分布，I代表n×n身份矩阵，V_e代表残差组分。。

GWAS分析的结果如图1所示，最显著的SNP分子标记为位于3号染色体的rs312759222，P＝1.11×10^-9。

实施例2腺胃乳头数的等位基因检测方法的建立

(1)对与腺胃乳头数显著相关的SNP标记位点的目的片段引物扩增3号染色体上一段220bp核苷酸片段，序列扩增的上下游引物为：

上游引物xian-F：ACCTCGTCTGCTGTCCATAG(SEQ ID NO.1)

下游引物xian-R：GCCTGTTTAATGTGCTCCCA(SEQ ID NO.2)

(2)PCR扩增：

本实施例中试剂是南京诺维赞公司获得，引物合成及测序由上海生工公司完成。

以获取的C3品系鸡基因组DNA为模板，使用引物xian-F和xian-R进行PCR扩增。

扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

(3)序列测序与鉴定

PCR扩增的产物xian_SEQ在上海生工公司进行Sanger测序，基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组GRCg6a Primary Assembly进行比对，得出对应的SNP标记位点突变。

PCR扩增产物xian_SEQ如下所示(SEQ ID NO.3)：

ACCTCGTCTGCTGTCCATAGAAAGCACATATATCAATAACCCTTATTACATAATTATTTATTTTTATTACTTATCCAATCCAATCTTTAAGTTTTTACCAAGCTGTCAGCATAAAAAGCATTTGTGCAACTAATATATAAGTAACAATAAATTGY[C/T]AGGTCTATTGACTTCACCTGAGACTCAGACTTACACTACTCGAAGTGGGAGCACATTAAACAGGC

注：序列中标注的Y为突变位点，用加粗并标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，序列的首尾加粗显示为引物序列。

实施例3分子标记SNP rs312759222突变的效应分析

本发明提供的一个提高鸡腺胃乳头数的SNP分子标记，以CC和TT基因型的腺胃乳头数较多，CT基因型的腺胃乳头数较少，如图2所示，因此在继代选育过程中选留CC和TT纯合基因型的个体，淘汰CT杂合基因型的个体。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种与鸡腺胃乳头数相关的SNP分子标记及其应用

<130> XY-2019-1-W-077

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acctcgtctg ctgtccatag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctgtttaa tgtgctccca 20

<210> 3

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acctcgtctg ctgtccatag aaagcacata tatcaataac ccttattaca taattattta 60

tttttattac ttatccaatc caatctttaa gtttttacca agctgtcagc ataaaaagca 120

tttgtgcaac taatatataa gtaacaataa attgyaggtc tattgacttc acctgagact 180

cagacttaca ctactcgaag tgggagcaca ttaaacaggc 220

Claims (6)

1.检测一种SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡腺胃乳头数性状的试剂盒中的应用，其中，

所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第3号染色体第19456954位，且该处碱基是C或T，或者所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，且其第155位碱基是C或T。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.一种选育腺胃乳头数多的鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中一种SNP分子标记的基因型，

选择CC和TT基因型鸡，淘汰CT基因型鸡，其中，

所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第3号染色体第19456954位，且该处碱基是C或T，

或者所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第155位碱基是C或T。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

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