CN111518920B - 南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联snp分子标记的筛选方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的筛选方法：(1)取南丹瑶鸡，采血提基因组DNA，测序，检测在南丹瑶鸡上存在突变SNP位点的基因；(2)取南丹瑶鸡母鸡作为试验鸡，测定鸡蛋的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数形状指标；(3)提取基因组DNA，对步骤(1)检测到的SNP位点进行多重PCR测序，收集试验鸡在SNP位点的基因型信息；(4)整理测序数据和蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数数据，筛选出与蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数极显著(Pr>F<0.01)关联的候选SNP分子标记。本发明简化了操作步骤，适用于高遗传力的数量性状的选育，筛选后提高鸡蛋抵抗破损能力，便于运输。

Description

南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的 筛选方法及用途

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的筛选方法及用途。

背景技术

我国是一个养鸡大国，鸡蛋产量位居世界首位。然而，鸡蛋蛋壳品质问题产生的残次品鸡蛋，对企业造成了巨大的损失。鸡蛋外部蛋品质蛋壳性状有蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数等，蛋壳厚度、蛋壳强度是影响鸡蛋运输、保存孵化和价格等的重要因素。蛋壳强度是蛋壳抵抗破损能力的主要指标，对包装和运输有重要意义，同时也是影响种蛋合格率的重要因素。蛋形指数对蛋的孵化率有较大的影响，因此在实际生产应用较广。

利用传统的选育方法，国内外已经成功地培育了大量的畜禽品种。但是，传统育种主要凭借育种经验依据表型对后代进行选择，无法对目标基因的基因型进行直接选择。因此，选择效率和准确性较低，数量性状由多基因控制，往往在基因中起作用的是某个或几个SNP。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提供一种在基因组水平上直接选育个体，不依赖表型信息，对于低遗传力、难以度量的性状可显著提高选择效率，加快育种进程。具体而言，与南丹瑶鸡鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的SNP分子标记具有克服性状表型鉴定的困难、可在生长发育早期选择、控制同一性状的多个SNP的利用、允许同时选择多个性状、性状评价和选择不具有破坏性。

本发明对与蛋品质相关基因ALAS1,CPOX-P6,TF,TSPO,SLC25A5,SLLCO1A2进行SNP检测及相关性分析。通过测定蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数获取表型数据、设计基因引物、提取南丹瑶鸡血液中的DNA、电泳后将合格的DNA送上海生工生物有限公司进行测序并分析测序结果。

本发明的另一个目的在于提供上述筛选方法筛选得到的SNP分子标记。

本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明所述的南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的筛选方法，包括以下操作步骤：

(1)从已知文献中找出与蛋品质相关的基因，根据基因序列设计引物；取南丹瑶鸡，采血提基因组DNA，混池后送公司测序，检测在南丹瑶鸡上存在突变SNP位点的基因；

(2)取南丹瑶鸡母鸡作为试验鸡，从24周龄开始测定鸡蛋的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数形状指标，每4周测1次，每次连续测3天，沙壳蛋和畸形蛋不测，直到60周龄试验结束；其中，24-60周包括产蛋前期、产蛋中期、产蛋后期，因此能得到整个产蛋周期的表型数据；

(3)采集60周龄试验鸡的血液并提取基因组DNA(参照《分子克隆实验指南IV》，以下DNA提取相同)，对步骤(1)检测到的SNP位点进行多重PCR测序，收集试验鸡在SNP位点的基因型信息；

(4)整理测序数据和蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数数据，采用SAS软件将步骤(2)中检测得到的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数数据与步骤(3)检测得到的SNP位点进行关联分析，筛选出与蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数极显著(Pr>F<0.01)关联的候选SNP分子标记。

其中，步骤(1)所述的与蛋品质相关的候选基因为ALAS1、CPOX-P6、TF、TSPO、SLC25A5和SLLCO1A2基因。

本发明的方法可以迅速从大量数据中找到南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的SNP分子标记，按照本发明的方法筛选得到的分子标记包括11个SNP位点，为chr9_4769768、chr9_4771619、chr9_4771623、chr9_4771738、chr9_4771779、chr9_4772495、chr4_16561900、chr4_16561922、chr12_3351761、chr1_65234336、chr1_65234317与产蛋周期蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联。

所述chr9_4769768位点位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC、CC三种基因型，其中TC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚、蛋壳强度最强，TC型个体的鸡蛋蛋形指数最佳；

所述chr9_4771619位点位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC两种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771623位点位于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CA两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771738位点位于SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA两种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；。

所述chr9_4771779位点位于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4772495位点位于SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561900位点位于SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CG、GG三种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561922位点位于SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA、AA三种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr12_3351761位点位于SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234336位点位于SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234317位点位于SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AG型个体的鸡蛋蛋壳强度最强。

所述的南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的11个SNP分子标记，可用于南丹瑶鸡的育种。

所述的11个SNP位点在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为用于南丹瑶鸡的育种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提出筛选以SNP突变位点为分子标记进行辅助育种的方法，对蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数相关SNP的分子标记筛选，结合表型判断，突破了常规表型选育耗时长、测量较复杂的缺点，提供了一种与南丹瑶鸡鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的SNP分子标记及其应用的方法。本发明可应用于提高南丹瑶鸡鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数的快速简捷培育的方法，简化了全基因组关联分析直接对性状相关基因进行SNP标记的筛选，适用于高遗传力的数量性状的选育；并针对鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数提供了SNP分子标记的方法，以及提高鸡蛋抵抗破损能力，便于运输。

附图说明

图1是利用酚/仿法提取所得基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。

实施例1

南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的筛选方法，具体操作步骤如下：

(1)查阅文献，查询蛋品质相关基因，所述相关基因为ALAS1、CPOX-P6、TF、TSPO、SLC25A5和SLLCO1A2基因，根据基因序列设计引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:12～SEQID NO:23所示；选取100只南丹瑶鸡，采血提基因组DNA，混池后送公司测序，检测在南丹瑶鸡上存在突变SNP位点的基因；

(2)选择广西贵港市港丰农牧有限公司提供的256只南丹瑶鸡母鸡作为试验鸡，按该公司的饲养标准进行单笼饲养；

从24周龄开始测定鸡蛋的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数形状指标，均参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2004)标准进行测量和计算；每4周测1次，每次连续测3天，沙壳蛋和畸形蛋不测，直到60周龄试验结束；其中，24-60周包括产蛋前期、产蛋中期、产蛋后期，因此能得到整个产蛋周期的表型数据；

蛋壳厚度用世达工具有限公司制造的游标卡尺(型号为91512)测量，蛋壳强度用北京天翔有限责任公司制造的蛋壳强度测试仪(型号为KQ1A)测量；蛋形指数＝长径/短径(长径短径由游标卡尺测量(参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》))。

(3)采集60周龄试验鸡的血液，从翅静脉窦采血，用ACD抗凝，然后置于-20℃保存，用于提取基因组DNA(参照《分子克隆实验指南IV》，以下DNA提取相同)，血液基因组DNA采用常规酚/仿提取法，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测合格后(图1)，送于生工生物工程(上海)股份有限公司对步骤(1)检测到的SNP位点进行多重PCR测序(PCR条件与反应程序如表1所示)，收集试验鸡在SNP位点的基因型信息；

(4)整理测序数据和蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数数据，用Excel2019对表型数据进行整理，采用SAS9.4软件MEANS过程对步骤(2)中检测得到的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数数据进行描述性统计、SNK进行不均衡多重比较分析，及将步骤(3)检测得到的SNP位点和蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数性状单因素方差分析进行关联分析，筛选出11个与蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数极显著(Pr>F<0.01)关联的候选SNP分子标记(表2和表3)，这11个SNP位点是调控浓鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数性状的主效SNP位点，用作SNP分子标记。

从表2中可以看出，各周龄蛋壳厚度无明显的变化趋势，其中32，56，60周显著高于其它周(P＜0.01)；蛋壳强度呈先降后升的趋势。蛋形指数有随周龄增加缓慢上升的趋势。

对南丹瑶鸡蛋壳性状与SNP位点进行相关性分析，与蛋壳性状显著相关的SNP位点见表3～表5，蛋壳厚度分别在40、60周龄分别关联到显著位点分别有6个、2个；蛋壳强度分别在36、48、56周龄关联到的显著位点分别有2个、1个、1个；蛋形指数分别在24、32、40周龄关联到1个、1个、1个。

表1.本发明中所用的分子标记检测引物信息、PCR反应程序

表2南丹瑶鸡鸡蛋外部蛋品质测定结果

注：同列数据肩标不含相同字母表示差异显著(P＜0.01)，含相同字母表示差异不显著，仅以P＜0.01表示差异显著。

表3南丹瑶鸡蛋壳厚度显著关联SNP

注：每个SNP位点基因型按照参考型、杂合型、突变型依次排列，表型值以“最小二乘均值±标准误”表示，不同字母表示差异显著(P<0.01)，“Pr>F”表示单因素方差显著值。

表4.南丹瑶鸡蛋壳强度显著关联SNP

注：每个SNP位点基因型按照参考型、杂合型、突变型依次排列，表型值以“最小二乘均值±标准误”表示，不同字母表示差异显著(P<0.01)，“Pr>F”表示单因素方差显著值。

表5.南丹瑶鸡蛋形指数显著关联SNP

注：每个SNP位点基因型按照参考型、杂合型、突变型依次排列，表型值以“最小二乘均值±标准误”表示，不同字母表示差异显著(P<0.01)，“Pr>F”表示单因素方差显著值。

本发明的方法可以迅速从大量数据中找到与南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的SNP分子标记，按照本发明的方法筛选得到的分子标记包括11个SNP位点，为chr9_4769768、chr9_4771619、chr9_4771623、chr9_4771738、chr9_4771779、chr9_4772495、chr4_16561900、chr4_16561922、chr12_3351761、chr1_65234336、chr1_65234317与产蛋周期蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联。

所述chr9_4769768位点位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC、CC三种基因型，其中TC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚、蛋壳强度最强，TC型个体的鸡蛋蛋形指数最佳；

所述chr9_4771619位点位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC两种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771623位点位于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CA两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771738位点位于SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA两种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771779位点位于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4772495位点位于SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561900位点位于SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CG、GG三种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561922位点位于SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA、AA三种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr12_3351761位点位于SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234336位点位于SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234317位点位于SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AG型个体的鸡蛋蛋壳强度最强。

应用

与南丹瑶鸡南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的11个SNP分子标记，可用于南丹瑶鸡的育种：南丹瑶鸡于3-4周龄进行SNP分子标记进行鉴定，保留携带候选SNP位点的个体。

所述的11个SNP位点在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为用于南丹瑶鸡的育种。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 南丹瑶鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联SNP分子标记的筛选方法及

用途

<130> JC

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

<400> 1

agatggagga gaattaaggc ctgaccccag cgtcccactg ctctccctta gcagagcgtc 60

agcagagggc atctacgtgc agcatagcag aaatattttg tgcttattaa ggactagcca 120

tgcagcaaca agagaatggt ttgcagatgt gatgcatcta ctcccacagc actcctgggt 180

aattattatc gctgtcactt c 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

<400> 2

gtcacacttg ctcttctcat ccttgcctac tgcacaccat tggatcctgt tttctctggg 60

gctgggagtc agctgatctg taaggccagc caggaagaaa tagtcagtcc agagctctgg 120

ggaaccacag atcaggtggg catgggggtg agaggggctc tgccctgaaa ccttttgtgc 180

acatgaacaa gagcatctga c 201

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

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ccacagatca ggtgggcatg ggggtgagag gggctctgcc ctgaaacctt ttgtgcacat 180

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<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

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<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

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<211> 201

<212> DNA

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<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

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<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

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<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

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tgttgaggcc ttacacccag c 201

<210> 11

<211> 201

<212> DNA

<213> Gallus gallus domesticus(瑶鸡)

<400> 11

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<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

<400> 12

catagctctg cattcgg 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

<400> 13

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<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

<400> 14

gggttttttg tgtgtgta 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

<400> 15

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<210> 16

<211> 18

<212> DNA

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gcccaacttg aagacgat 18

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<211> 18

<212> DNA

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gtaggggagt gagattca 18

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

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agtgaagccc atacaagatc cat 23

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<212> DNA

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tcatctgctt tcctcattc 19

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

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<400> 20

ctacctcgct ctgcttcgtg ta 22

<210> 21

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial sequence（人造序列）

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ctggacttga tgtgtaact 19

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<213> Artificial sequence（人造序列）

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tatgcacagc ctggcagc 18

Claims (1)

1.一种11个SNP位点在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于：所述试剂盒或检测方法的用途为用于南丹瑶鸡鸡蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联的性状辅助育种；其中，所述11个SNP分子标记为chr9_4769768、chr9_4771619、chr9_4771623、chr9_4771738、chr9_4771779、chr9_4772495、chr4_16561900、chr4_16561922、chr12_3351761、chr1_65234336、chr1_65234317与产蛋周期蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数关联；

所述chr9_4769768位点位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC、CC三种基因型，其中TC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚、蛋壳强度最强，TC型个体的鸡蛋蛋形指数最佳；

所述chr9_4771619位点位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有TT、TC两种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771623位点位于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CA两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771738位点位于SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA两种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4771779位点位于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr9_4772495位点位于SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT两种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561900位点位于SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CG、GG三种基因型，其中GG型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr4_16561922位点位于SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有GG、GA、AA三种基因型，其中AA型个体的鸡蛋蛋壳厚度最厚；

所述chr12_3351761位点位于SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中TT型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234336位点位于SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有CC、CT、TT三种基因型，其中CC型个体的鸡蛋蛋壳强度最强；

所述chr1_65234317位点位于SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的第101位，该位置处有AA、AG两种基因型，其中AG型个体的鸡蛋蛋壳强度最强。

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