CN107130023A - 与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用 - Google Patents

与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用 Download PDF

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罗勇
张璐
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Abstract

本发明提供与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记，其位于鸡OCX‑36基因上，具体核苷酸序列包括序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.3；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，第144bp处的碱基A和G与蛋鸡蛋品质相关；在序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列中，第169bp处的碱基A和G、第221bp处的碱基G和A与蛋鸡蛋品质相关。本发明采用聚合酶链式反应(PCR) 和测序技术筛选到与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记，并通过SSCP方法来检测待测鸡的基因型，根据基因型进行鸡的选育，从而加快鸡的育种进程。

Description

与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及一种与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用。
背景技术
聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）是先用PCR扩增出目的基因DNA，目的基因的DNA序列经变性作用，但两条互补单链DNA依然由碱基之间的作用力维持其二级结构，所以当单个碱基发生突变时，即使DNA长度相同也能其导致空间构象改变，因而在中性聚丙烯酰胺电泳中因分子量、电荷、分子形状等不同而引起电泳迁移率的改变，从而实现多态性的判断。这种技术适用于直接进行点突变的检测；具有灵敏度高、分析简单等优点，根据带型即可进行判型，适合大样本的筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用。
本发明提供与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记，其位于鸡OCX-36基因上，具体核苷酸序列包括序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.3；
在序列表SEQ ID No.1（即引物扩增的第五外显子部分序列）的核苷酸序列中，第144bp处的碱基为A时，与蛋鸡高品质蛋相关，如果该碱基为G，则与蛋鸡低品质蛋相关；
和/或
在序列表SEQ ID No.3（即引物扩增的第七外显子部分序列）的核苷酸序列中，第169bp处的碱基为A，且第221bp处的碱基为G时，与蛋鸡高品质蛋相关；如果第169bp处的碱基为G，且第221bp处的碱基为A时，则与蛋鸡低品质蛋相关。
作为优选，所述序列表SEQ ID No.1中，第144bp处的碱基为A时，蛋鸡蛋重、蛋白重、蛋黄重和蛋壳重较第144bp处的碱基为G时重。
作为优选，所述序列表SEQ ID No.3中，第169bp处的碱基为A，且第221bp处的碱基为G时，鸡蛋哈氏单位含量高且蛋白高度高。
本发明还提供用于检测上述的与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记的引物对，包括用于扩增序列表中SEQ ID No.1的引物对P5和用于扩增序列表中SEQ ID No.3的引物对P7；
所述P5为：F:GTGTGGACAGTGGGGGT；
R:GGGCAGATTTCAGGCTT；
所述P7为：F:GAGATGTGGGTGCTCGGTG；
R:GTGATGGGGTTGGAGGTTG。
本发明还提供上述的与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记在鉴定蛋鸡蛋品质中的应用，包括以下步骤：
（1）提取待测鸡的基因组DNA；
（2）以待测鸡的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对P5和P7，分别进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增产物，如果利用引物对P5扩增的序列中，第144bp处的碱基为A；和/或利用引物对P7扩增的序列中，第169bp处的碱基为A，第221bp处的碱基为G，则待测鸡为蛋鸡蛋品质性状优的鸡品种；如果利用引物对P5扩增的序列中，第144bp处的碱基为G；且利用引物对P7扩增的序列中，第169bp处的碱基为G，第221bp处的碱基为A，则待测鸡为蛋鸡蛋品质性状差的鸡品种。
作为优选，步骤（2）中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：10 × PCR Buffer(Mg2+ + Plus) 3μl，10 mmol /L dNTP Mix 1.5 μl，5 U/μl Taq DNA polymerase 0.25μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，ddH2O 12.25 μl。
作为优选，步骤（2）中，PCR反应使用的条件为：95℃预变性 5min，95℃ 30s，退火30s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 10min，4℃ 保存。
作为优选，步骤（3）中，所述检测PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到sscp电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的蛋鸡蛋品质性状进行判断。
步骤（3）中，也可以用其他方法来检测PCR扩增产物，比如直接进行测序，并不限于本发明中所述方法。
本发明还提供含有上述引物对的用于检测蛋鸡蛋品质的试剂盒。
本发明还提供与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。
本发明利用PCR-SSCP方法对海兰褐蛋鸡的蛋品质性状相关候选基因OCX36进行多态性检测，探寻候选基因的等位基因及其基因型在蛋鸡中的分布情况，并期望筛选出与蛋品质性状相关的基因型作为遗传标记，为今后的标记辅助选择提供理论和技术上的参考。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记的检测过程示意图；
图2为基因组DNA电泳图；
图3为OCX36第五外显子PCR产物；
图4为OCX36第七外显子PCR产物；
图5为OCX36 第五外显子引物SSCP电泳图；
图6为OCX36 第七外显子引物SSCP电泳图；
图7为OCX36第五外显子引物部分测序结果；
图8为OCX36第七外显子引物部分测序结果；
图9为OCX36第七外显子引物部分测序结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 实验动物
选取产蛋率 90% 左右、32周龄的父母代海兰褐蛋鸡，饲养于石河子大学动物科技学院实验站，取236只作为实验动物。单笼同舍饲养，依笼编号，且按照海兰褐蛋鸡饲养管理手册进行饲养管理。
1.1.2主要试剂
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、10×PCR buffer (不含镁离子)以及 DNA MarkerⅠ、琼脂糖凝胶、DNA 回收试剂盒，pGEM–T Easy 载体，均购自天根生化科技(北京)有限公司，甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris 碱、过硫酸铵（APS）购自上海生工公司。
氯化钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠、氯仿、异戊醇、醋酸铵、嗅化乙锭、无水乙醇、硼酸、二甲苯氰、溴酚蓝等试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3主要仪器设备
主要仪器设备：DNA/RNA 浓度测定仪（美国Thermo Scientific 公司）；高速冷冻离心机（美国 BACKMAN 公司生产，型号 Microfuge 18）；梯度 PCR 仪（Biometra，德国）；凝胶成像分析系统 ΜVP（Biospectrμm ，美国）；HHS 型电热恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、DYY-III24A 型电泳槽、PTC-100TM 型 PCR 仪、DYY-4 型电泳仪、磁力加热搅拌器、制冰机、WD-9406 型胶片观察灯、WD-9405B 型水平摇床、紫外凝胶成像分析仪器、超净工作台。
1.1.4 试剂配置
(1)tris-HCl（1mol/L,1000ml,pH=7.5）：Tris-碱 121.1g，浓 HCl 65ml，加水定容至1000ml，高压灭菌备用。
(2) EDTA(0.5mol/L,100ml,pH=8.0)：Na2EDTA·2H2O 称取 18.61g 加水溶解，用约2g NaOH，调节pH至8.0，定容至100ml。
(3)SDS(10%,50ml)：5gSDS 溶解于40ml水，68 ℃水浴使其完全溶解，用浓HCl调节pH至7.2。
(4)30%丙烯酰胺：1g甲叉酰胺，29g聚丙烯酰胺，溶于100ml去离子水。
(5)5×TBE：Tris-Base 54g，硼酸27.5g，加800ml蒸馏水溶解，加20mlEDTA(pH=8.0)，定容至 1000ml。
(6)10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶解于5ml去离子水，定容至 10ml。
(7)固定液：无水乙醇50ml，冰乙酸2.5ml，定容至500ml。
(8)染色液：硝酸银 1g，无水乙醇 50ml，冰乙酸 2.5ml，1g 硝酸银溶于水，加入50ml无水乙醇，2.5ml 冰乙酸，定容至 500ml。
(9)显影液：37%甲醛溶液 2.5ml， 氢氧化钠 15g，将 15g 氢氧化钠溶于水，溶解后加入2.5ml37%甲醛溶液，定容至 500ml。
(10)变性剂：去离子甲酰胺 9.8ml, EDTA(pH=8.0), 溴酚蓝 10mg，二甲苯菁10mg。
克隆试剂的配制：
①LB液体培养基：称取10g胰蛋白脉，5g酵母浸出物，I0gNaCl，溶于800ml双蒸水中，完全溶解后，用1mol/L NaOH和1mol/L HCL调pH值至7.0-7.2，定容至1000mL，高压灭菌后备用。
②LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每l00ml加入1.5g琼脂粉，高压灭菌后在无菌状态下铺平板，冷却后备用。
③氨苄青霉素(Amp)：用灭菌双蒸水溶解，储存浓度为500mg/ml，-20℃保存。
1.1.5 引物设计
根据GenBank登陆的原鸡OCX-36（登录号：NC_006107.4），利用软件Primer5.0设计引物，用于扩增第五外显子、第七外显子序列，引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。
表1 OCX-36引物序列信息
1.2主要的实验方法与步骤
主要的实验方法为：采集正常蛋鸡血液，对候选基因进行PCR-SSCP多态性分析；取正常蛋鸡连续15天的鸡蛋，进行蛋品质性状的检测；将检测结果与PCR-SSCP结果相对应，寻找调控蛋品质性状的优势基因型，鉴定优势基因型，蛋品质性状的测定，经统计学分析，找到与蛋品质性状显著或极显著的基因型。
1.2.1血样采集
通过EDTA-K2真空采血管翅下静脉采集血液，每只鸡约采集1ml，于-20℃冰箱中保存备用。
1.2.2基因组DNA提取
（1）将冷冻血解冻后取30μl全血于ependorf管中，加入500μl STE,100μl SDS, 5μl 蛋白酶k(l0mg/ml)，混匀置55℃水浴16-18h；
（2）取出，冷却至室温，加入饱和酚500μl抽提，来回缓慢颠倒10min，12000r/min离心15min；
（3）取上清，加入酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)500μl抽提一次；
（4）取上清，加入氯仿：异戊醇(体积比为24：1)500μl再抽提一次；
（5）取上清，加入10mmol/L醋酸铵50μl，混匀；再加无水酒精1000μl，缓慢颠倒混匀，此时可见白色絮状沉淀，4℃放置10min，10000r/min离心15min；
（6）弃上清，加入75%酒精500μl，混匀，10000r/min离心15min；
（7）弃上清，于通风处倒置30-40min风干至管内无酒精味，加100-200μITE溶解，4℃保存。
1.2.3 DNA质量检测
DNA 提取后用 1.2%TBE 琼脂糖凝胶电泳，向琼脂糖胶的点样孔处依次加入 3μl DNA的TE 溶解液与 5μl溴酚蓝的混合样品。点样完成后打开电泳仪调制 130V 电泳 3 分钟后将电泳调制100V持续电泳，以肉眼可见得蓝色条带跑至胶的下半部分时停止电泳。将电泳好的凝胶置于紫外下成像检测是否合格。不合格的样品重新提取，直至合格。将合格的凝胶照相并将图片标号保存，同时检测合格的DNA样品放入-20℃冰箱保存待用。
1.2.4 PCR反应体系
PCR 扩增体系（20 μl）: 10 × PCR Buffer( Mg2+ + Plus) 3μl，10 mmol /L dNTPMix 1.5 μl，5 U/μl Taq DNA polymerase 0.25μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，ddH2O 12.25 μl。
1.2.5 PCR反应程序
95℃预变性 5min，95℃ 30s，退火 30s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 10min，4℃ 保存。退火温度根据具体的引物序列的扩增条件而定。
1.2.6 PCR产物检测
（1）用0.5×TBE电泳缓冲液配置1.2%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)；
（2）取PCR产物5μl，混合2μl溴酚蓝上样，以DNA Marker进行分子量对照；
（3）以0.5×TBE电泳缓冲液，电泳90V(5V/cm)30min；
（4）将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统，拍照保存。
1.2.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶配制
根据PCR产物大小的不同选择不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶。本实验选用胶浓度为：200bp以内的目的条带选用8%的凝胶；小于或等于300bp选用10%的凝胶；小于或等于400bp的目的条带选用12%的凝胶。凝胶制作方法参考分子克隆指南第三版。
表2 非变性聚丙烯酰胺凝胶配制
1.2.8 SSCP 实验方法
（1）PAGE 封底胶的制备，用 0.5×TBE 电泳缓冲液制备浓度为 2%琼脂糖胶封底。
（2）将玻璃板清洗干净，并用蒸馏水冲洗后放入干燥箱中烘干。将烘干的玻璃板取出放入封底胶槽内，用夹子的固定在胶架上，将制好的封底胶倒入封底槽中。待封底胶凝固后，再进行下一步操作。
（3）依据所跑片段的大小选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶。在两玻璃板内注入配好的聚丙烯酰胺凝胶。将配置好的胶缓慢倒入倾斜的玻板之间，以免所制备的胶中有气泡生成，插入所需孔数的梳子等待凝固。
（4）PCR 目的片段的变性，取 PCR 产物 3ul 于一新的 PCR 管中，与 8ul 的变性剂混匀离心，在 PCR 仪器上设置 98℃10min 的条件进行变性，10min 后迅速取出置于提前制好的冰盒上冷却以防复性。
（5）在凝固好的聚丙烯酰胺凝胶胶架上，用手术刀片整齐的割除多余的封底胶，取下梳子，放置于电泳槽上，迅速加入 1×TBE 的电泳液，将梳孔中的残留的气泡赶出后，向点样孔中依次加入 10ul 变性产物。
（6）打开电泳仪，先在 300V 电压条件下电泳 5 分钟将条带跑出胶孔，后改为100V电压过夜进行电泳。
（7）关闭电泳仪，取下夹子并将玻璃板从电泳槽中取出，小心将两玻璃板分开后，用刀片将胶切出并放入漂洗槽中，先用蒸馏水冲洗两次后，倒入可以完全浸没凝胶的固定液于摇床上，固定 10 分钟。
（8）回收固定液，用蒸馏水漂洗胶两次，倒入染色液，置于摇床上染色 20 分钟。
（9）回收染色液，用蒸馏水漂洗胶，加入显影液，置于摇床上进行显影反映，直至显影完成。
（10）回收显影液，用蒸馏水漂洗胶，根据显影情况选择是否需要再次固定。
（11）将胶放置与凝胶成像分析仪上进行观察、照相。
1.2.9 PCR产物的纯化回收
按普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书要求进行操作。首先柱平衡，向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。将切下的单一目的条带放入灭菌EP管中，加入3倍体积溶胶液PN，50 ℃水浴放置10 min，并温和翻转离心管，使胶块充分溶解。将降至室温的混合溶液加入平衡过的CA2中，室温放置2 min，12000 rpm离心50 s，弃废液；向CA2中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心50 s，弃废液。再向CA2中加入500 μl漂洗液PW，12000 rpm离心50 s，弃废液。将CA2放回收集管中，12000 rpm离心2 min，以除尽漂洗液。将CA2于室温放置10 min，彻底晾干。最后将CA2放到新的EP管中，向吸附膜中央位置悬空滴加40μl缓冲液EB，室温放置2 min。12000 rpm离心2 min，回收液即为目的DNA溶液。
在T4DNA连接酶作用下，经16℃连接PMD19-T Vector载体16h，将5μl连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，吸取上清液加入8μl IPTG和40μl X-gal，再吸取转化产物到LB培养基板，涂板后在37℃倒置平板培养过夜，用取菌环在过夜培养的平皿中挑取单克隆，将挑出的单克隆放在LB液体培养基中再培养6-8h，加入40%的灭菌甘油，送华大基因测序。
1.3 数据处理及分析
1.3.1统计基因频率和基因型频率
基因频率可以作为反映遗传结构和群体特征的指标，用来进行同一地区不同品种家畜群体遗传结构的比较。
Pi=[2(ii)+(ij1)+(ij2)+……+(ijn)]/2N
Pi: 第i个等位基因的频率；Ⅰ: 纯合复等位基因；
j1,j2……jn: 与i共显性的第1到第n个等位基因。
基因型频率=基因型个体数/测定群体所有基因型的总数。
1.3.2 群体中基因频率和基因型频率的差异显著性检验(χ2独立性检验)
χ2值的计算是以计算基因型的理论值为前提的，各种基因型频率的理论值要根据所统计的群体的基因频率来计算。
基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用χ2统计量，其计算公式为：
其中：m为某一遗传位点基因型应有个数；fi代表第i个基因型的实际个体数量；i为基因型序号； n为样本数量；pi代表第i个基因型的理论频率。
若自由度为df=2，且某些基因型的理论值小于5时，可采用校正公式：
其中：Ei为理论值，Oi为实际观察值，n为基因型数。
1.3.3 群体遗传杂合度和遗传纯合度
平均杂合度是衡量群体内遗传变异的有效指标。平均杂合度和遗传变异程度呈正相关的关系。一个群体的基因变异，通常可用所含多态性位点的百分比和每个位点的平均杂合度来衡量。
群体内某一基因位点纯合度的公式为：
平均杂合度公式为：
其中：H 为某一位点的杂合度，Pi为某一位点上第 i 个等位基因的基因频率，n 为某一位点的等位基因的数目。
1.3.4多态信息含量
PIC（Polymorphic Information content），多态信息含量，是DNA变异程度的衡量指标。用于对标记基因多态性的估测。一般规定，PIC＞0.5 时，该多态位点为高度多态， 0.25＜PIC＜0.5时，该多态位点为中度多态， PIC＜0.25时，该多态位点为低度多态。
PIC 值是根据各个等位基因的基因频率来计算的。其公式为：
其中：n 为某位点的等位基因数目，Pi和 Pj分别为第 i 和第 j 个等位基因在该群体中的基因频率。
1.3.5有效等位基因数 (Effective number of alleles，Ne)
有效等位基因数等于基因纯合度的倒数，是衡量群体遗传变异的一个指标。等位基因在群体中分布得越均匀，有效等位基因数越接近实际检测到的等位基因的个数。
1.4数据处理与统计分析
试验群体遗传背景一致，饲养管理相同，故构建一般线性模型：
Yij = μ+Gi+Fj+eij，式中，Yij 表示各个体性状测定值；μ为群体均值；Gi为基因型效应；Fj表示家系效应（公鸡效应）；eij 表示随机误差。采用 SAS8.1统计软件分析，结果用“最小二乘均值±标准误”表示。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA 提取及检测
提取样本基因组DNA，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，基因组DNA条带明亮单一，完整性好，无拖尾现象，结果见图2。
2.2 OCX36外显子区PCR产物扩增片段的检测
经检测基因OCX36根据外显子5、7设计的2对PCR引物均符合要求。琼脂糖凝胶电泳检测条带单一清晰，条带位置与MakerⅠ标记位置一致，具有百分之百的扩增效率，可用于后续的SSCP分析，结果见图3、4。
2.3 OCX36基因多态性的检测
2.3.1 OCX36 第五外显子SSCP检测结果
图5为第五外显子引物sscp电泳带型图，分别取AA、AG、GG带型所对应DNA样本测序，测序结果见图7，依次为AA、AG、GG带型的测序结果。与 GenBank 上的OCX36 已知序列进行同源性比较，突变位点位于OCX36序列第2472bp位置（即突变位点位于序列表SEQ ID No.1中第144bp位置），发生了A/G 的突变，即由A突变为G。见图5。AA带型所对应的OCX36序列第2472bp的位置为A，GG带型所对应的OCX36序列第2472bp的位置为G，AG带型所对应的OCX36序列第2472bp的位置由A突变为G。
引物P5扩增的核苷酸序列为：
上述序列中，第144bp处的r为等位基因A/G。
2.3.2 OCX36 第七外显子SSCP检测结果
图6为第七外显子引物sscp电泳带型图，分别取AA、AB、BB、AC、AD带型所对应DNA样本测序，测序结果见图8和图9，图8依次为AA、AB、BB带型的测序结果，图9依次为AC、AD带型的测序结果。与 GenBank 上的OCX36已知序列进行同源性比较，第一突变位点位于OCX36序列第3287bp位置，发生了G/A 的突变如图4，第二突变位点位于OCX36序列第3339bp位置，发生了G/A 的突变（即第一突变位点位于序列表SEQ ID No.3中第169bp位置，第二突变位点位于序列表SEQ ID No.3中第221bp位置，均由G突变为A），见图6。
其中，
AA所对应的OCX36序列第3287bp的位置为A(该位点发生突变，由G突变为A)，OCX36序列第3339bp的位置为G；
AB所对应的OCX36序列第3287bp的位置为G，OCX36序列第3339bp的位置为G；
BB所对应的OCX36序列第3287bp的位置为A，OCX36序列第3339bp的位置为G；
AC所对应的OCX36序列第3287bp的位置为G，OCX36序列第3339bp的位置为A(该位点发生突变，由G突变为A)；
AD所对应的OCX36序列第3287bp的位置为G，OCX36序列第3339bp的位置为G。
引物P7扩增的核苷酸序列为：
上述序列中，第169bp处的r为等位基因G/A，第221bp处的m为等位基因G/A。
2.4 OCX36多态性与蛋品质性状的关联分析
蛋鸡OCX36基因第五显子中的AA基因型在蛋重、蛋白重、蛋黄重和蛋壳重性状较其余基因型分别高出9.56g、9.31g、6.17g、1.66g，且均达到极显著影响（P＜0.01），AA基因型可作为调控蛋重、蛋白重、蛋黄重和蛋壳重的标记基因型，见表1。
表1 OCX36第五显子多态性与蛋品质性状的关联分析（最小二乘均值±标准误）
由表1可知，当OCX36序列第2472bp位置为A时，蛋重、蛋白重、蛋黄重和蛋壳重性状高。
蛋鸡OCX36基因第七显子的AA型在调控哈氏单位、蛋白高度较其他基因型极显著（P＜0.01）高出34.02、2.56mm；AA型可作为调控哈氏单位和蛋白高度的标记基因型，见表2。
表2 OCX36第七显子多态性与蛋品质性状的关联分析（最小二乘均值±标准误）
注：肩标字母相同表示差异不显著( P＞0. 05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著( P＜0. 01)。
由表2可知，当OCX36序列第3287bp位置由G突变为A，且第3339bp位置仍为G时，鸡蛋哈氏单位、蛋白高度高。
实施例2
蛋鸡蛋品质性状检测试剂盒，包括：
1、引物对
P5：
F:GTGTGGACAGTGGGGGT；
R:GGGCAGATTTCAGGCTT；
P7：
F:GAGATGTGGGTGCTCGGTG；
R:GTGATGGGGTTGGAGGTTG。
2、PCR检测试剂
以20μl计为：10 × PCR Buffer( Mg2+ + Plus) 3μl，10 mmol /L dNTP Mix 1.5 μl，5U/μl Taq DNA polymerase 0.25μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，ddH2O 12.25 μl。
3阳性对照
以单链的序列表SEQ ID No.1中的核苷酸序列作为阳性对照一，以单链的序列表SEQID No.2中的核苷酸序列作为阳性对照二，以单链的序列表SEQ ID No.3中的核苷酸序列作为阳性对照三，以单链的序列表SEQ ID No.4中的核苷酸序列作为阳性对照四，以单链的序列表SEQ ID No.5中的核苷酸序列作为阳性对照五。
该试剂盒的使用方法参照实施例1。
将待测样本的sscp电泳带型图与阳性对照进行对比，对待测样本的蛋鸡蛋品质性状进行判断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记及其应用
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 181
<212> DNA
<213> OCX36 第五外显子等位基因
<400> 1
gtgtggacag tgggggtctt ctgctctgct gcagtgcccg ggagctgttg gtttttggcc 60
ctcatacatt cccttttgtt ttcttccctc ctttccagct tactgtccct gtcagtgcat 120
gacatggtgt tcagccacct gacagcaact ctgcctggtt tggtaagcct gaaatctgcc 180
c 181
<210> 2
<211> 181
<212> DNA
<213> OCX36 第五外显子等位基因
<400> 2
gtgtggacag tgggggtctt ctgctctgct gcagtgcccg ggagctgttg gtttttggcc 60
ctcatacatt cccttttgtt ttcttccctc ctttccagct tactgtccct gtcagtgcat 120
gacatggtgt tcagccacct gacggcaact ctgcctggtt tggtaagcct gaaatctgcc 180
c 181
<210> 3
<211> 329
<212> DNA
<213> OCX36 第七外显子等位基因
<400> 3
gagatgtggg tgctcggtgc gtgctgctcc ctctgctgga acctggggca ggaggagctc 60
tgtgttccct gaccatcacc aatggctttc ccatgcagtg gtgatgccag tcggcttgaa 120
ggggatggtt cactaccacc tggtcggccc accattcacc tccggttcat ccctgatgat 180
ggatttagat gtaagtgaac cctggctatc agtaccatgc gcaccccggg cttctttcag 240
cacaaccaaa cagaagggct gtgctgatga gctgttctgg ggctgccagc taaacgtgcc 300
agcccctgtc caacctccaa ccccatcac 329
<210> 4
<211> 329
<212> DNA
<213> OCX36 第七外显子等位基因
<400> 4
gagatgtggg tgctcggtgc gtgctgctcc ctctgctgga acctggggca ggaggagctc 60
tgtgttccct gaccatcacc aatggctttc ccatgcagtg gtgatgccag tcggcttgaa 120
ggggatggtt cactaccacc tggtcggccc accattcacc tccggttcgt ccctgatgat 180
ggatttagat gtaagtgaac cctggctatc agtaccatgc gcaccccggg cttctttcag 240
cacaaccaaa cagaagggct gtgctgatga gctgttctgg ggctgccagc taaacgtgcc 300
agcccctgtc caacctccaa ccccatcac 329
<210> 5
<211> 329
<212> DNA
<213> OCX36 第七外显子等位基因
<400> 5
gagatgtggg tgctcggtgc gtgctgctcc ctctgctgga acctggggca ggaggagctc 60
tgtgttccct gaccatcacc aatggctttc ccatgcagtg gtgatgccag tcggcttgaa 120
ggggatggtt cactaccacc tggtcggccc accattcacc tccggttcgt ccctgatgat 180
ggatttagat gtaagtgaac cctggctatc agtaccatgc acaccccggg cttctttcag 240
cacaaccaaa cagaagggct gtgctgatga gctgttctgg ggctgccagc taaacgtgcc 300
agcccctgtc caacctccaa ccccatcac 329

Claims (10)

1.与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记，其特征在于：其位于鸡OCX-36基因上，具体核苷酸序列包括序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.3；
在序列表SEQ ID No.1（即引物扩增的第五外显子部分序列）的核苷酸序列中，第144bp处的碱基为A时，与蛋鸡高品质蛋相关，如果该碱基为G，则与蛋鸡低品质蛋相关；
和/或
在序列表SEQ ID No.3（即引物扩增的第七外显子部分序列）的核苷酸序列中，第169bp处的碱基为A，且第221bp处的碱基为G时，与蛋鸡高品质蛋相关；如果第169bp处的碱基为G，且第221bp处的碱基为A时，则与蛋鸡低品质蛋相关。
2.根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中，第144bp处的碱基为A时，蛋鸡蛋重、蛋白重、蛋黄重和蛋壳重较第144bp处的碱基为G时重。
3.根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.3中，第169bp处的碱基为A，且第221bp处的碱基为G时，鸡蛋哈氏单位含量高且蛋白高度高。
4.用于检测权利要求1-3任一项所述的与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记的引物对，其特征在于：包括用于扩增序列表中SEQ ID No.1的引物对P5和用于扩增序列表中SEQ IDNo.3的引物对P7；
所述P5为：F:GTGTGGACAGTGGGGGT；
R:GGGCAGATTTCAGGCTT；
所述P7为：F:GAGATGTGGGTGCTCGGTG；
R:GTGATGGGGTTGGAGGTTG。
5.权利要求1-3任一项所述的与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记在鉴定蛋鸡蛋品质中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）提取待测鸡的基因组DNA；
（2）以待测鸡的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对P5和P7，分别进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增产物，如果利用引物对P5扩增的序列中，第144bp处的碱基为A；和/或利用引物对P7扩增的序列中，第169bp处的碱基为A，第221bp处的碱基为G，则待测鸡为蛋鸡蛋品质性状优的鸡品种；如果利用引物对P5扩增的序列中，第144bp处的碱基为G；且利用引物对P7扩增的序列中，第169bp处的碱基为G，第221bp处的碱基为A，则待测鸡为蛋鸡蛋品质性状差的鸡品种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（2）中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：10 × PCR Buffer( Mg2+ + Plus) 3μl，10 mmol /L dNTP Mix 1.5 μl，5 U/μl TaqDNA polymerase 0.25μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，ddH2O 12.25 μl。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，PCR反应使用的条件为：95℃预变性 5min，95℃ 30s，退火 30s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 10min，4℃ 保存。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述检测PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到sscp电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的蛋鸡蛋品质性状进行判断。
9.含有权利要求4所述引物对的用于检测蛋鸡蛋品质的试剂盒。
10.权利要求1-3任一项所述的与蛋鸡蛋品质性状相关的遗传标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。
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