CN111440878B

CN111440878B - Cdh17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记与应用

Info

Publication number: CN111440878B
Application number: CN202010154603.2A
Authority: CN
Inventors: 吴艳; 皮劲松; 肖红卫; 张昊; 沈涛涛; 潘爱銮; 黄涛; 程诗彬; 申杰; 孙静; 梁振华; 杜金平; 蒲跃进
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-08
Filing date: 2020-03-08
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-03-08
Also published as: CN111440878A

Abstract

本发明提供了CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记及其应用，所述的单倍型标记位于鸡CDH17基因的部分DNA序列中，所述单倍型标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述单倍型标记包括：在SEQ ID NO.1所示序列中第198bp处存在T/C多态性位点；第218bp处存在G/A多态性位点；第239bp处存在A/G多态性位点；第261bp处存在C/A多态性位点；本发明还提供了SNP检测试剂盒，包括：如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。本发明首次发掘了鸡CDH17基因中与蛋壳品质性状相关的单倍型标记，为蛋壳品质性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。

Description

CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记与应用

技术领域

本发明涉及单倍型标记筛选技术领域，尤其涉及CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记与应用。

背景技术

鸡蛋富含蛋白质、脂肪、卵磷脂等人体所需的多种营养物质，是我国居民饮食结构中的重要组成部分。但是鸡蛋在收购、储运和加工过程中约有6％-10％因为破损而直接损失掉，造成了严重的经济损失。研究表明，鸡蛋损失的主要原因是蛋壳薄，蛋壳破损或裂纹所引起的。蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳百分比以及蛋比重是蛋壳质量的重要检测指标，也是影响鸡蛋储运的重要因素。蛋壳厚度、蛋壳百分比、蛋比重与蛋壳强度的相关性系数分别为0.79、0.76、0.62，这表明，蛋壳厚度、蛋壳百分比、蛋比重比的值越大，蛋壳强度就越大。随着我国居民生活水平的持续提高，对鸡蛋的需求量也上升，预计到2035年，我国人均消费鸡蛋的数量将达到363个/年，基本是每人每天消费一枚鸡蛋。因此，如何提高蛋壳质量，提高蛋壳厚度和强度，减少在储运过程中的损失显得尤为重要。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsim，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，包括单碱基的插入、缺失、转化和颠换等。全基因组关联分析(Gemome-Wide Association Study，GWAS)是应用基因组中数以百万计的SNP为分子遗传标记，进行全基因组水平的对照分析和相关分析。大量SNP标记的出现，使得以单个标记为中心的关联分析方法逐渐转变为以单倍型(haplotype)为主的关联分析方法。单倍型是指在同一染色体上或一定区域内若干个决定同一性状的且紧密相连锁的SNPs，具有统计学关联性。SNP标记及其组成的单倍型由于分布的广泛性和稳定性，在动物分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)育种上发挥着重要作用，成为加快蛋鸡蛋壳品质性状尤其是那些限性性状遗传改良的可行性技术。基于此，进一步鉴定与蛋鸡经济性状相关的SNP标记及其单倍型组合，进而借助SNP标记及其单倍型组合序列作为筛选标记用于优良蛋鸡经济性状的辅助选择上，将大大提高选种的准确性，对于培育具有优良经济性状的蛋鸡品种具有一定的意义。

钙粘连蛋白17(cadherin 17，CDH17)是钙粘连蛋白家族中的一员，是肠上皮基底膜粘附系统钙离子调节的开关，通过介导钙依赖性细胞间连接而发挥生物学作用。已有研究表明CDH17在胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌等的发生、发展机制中发挥重要作用。然而，CDH17基因在蛋鸡上的研究却未见报道，迄今为止，尚无有关蛋鸡CDH17基因作为鸡蛋蛋壳品质性状的分子标记的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记及其应用，本发明发掘了CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记，为蛋壳品质性状的单倍型标记辅助育种提供了一种新的单倍型标记。

本发明的目的之一在于提供一种CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记，所述的单倍型标记位于位于蛋鸡CDH17基因部分编码区序列中，所述的单倍型标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列长度为1254bp，所述单倍型标记包括：

SNP1位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第198bp处存在T/C多态性位；

SNP2位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第218bp处存在G/A多态性位点；

SNP3位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第239bp处存在A/G多态性位点；

SNP4位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第261bp处存在C/A多态性位点。

具体地，所述序列中的第198bp、218bp、239bp和261bp处的优势等位基因分别是T、G、A、C；优势基因型分别为TT、GG、AA和CC。

本发明的目的之二在于提供一种用于扩增所述单倍型标记的引物对，包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之三在于与鸡蛋蛋壳品质性状相关的CDH17基因SNP的检测试剂盒，包括所述引物对。

作为以上实施方式之一，所述检测试剂盒还包括10×buffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶。或者所述检测试剂盒还包括PCRmix。

本发明的目的之四在于提供鸡CDH17基因蛋壳品质性状相关SNP的检测方法，采用所述的检测试剂盒进行检测。

具体地，包括以下步骤：

步骤1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过所述SEQ ID NO.2～3所示PCR引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；

步骤2、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的扩增产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。

本发明的目的之五在于提供一种单倍型组合的构建方法，首先采用所述的方法检测出所述4个SNP位点；然后构建出七种单倍型，H1：TGAC，H2：TGAA，H3：TGGC，H4：TAAC，H5：TAGC，H6：CAGC，H7：CAGA；再根据所述单倍型构建的单倍型组合并与鸡蛋蛋壳品质表型相关联，单倍型组合H1H1，H2H2蛋壳强度和蛋壳厚度最高。

本发明的目的之六在于提供单倍型组合，所述单倍型组合为包含所述4个SNP位点的组合，具体为TGAC/TGAC或者TGAA/TGAA，所述两种单倍型组合具有最高的蛋壳强度和蛋壳厚度。

本发明的目的之七在于提供所述的单倍型标记、所述的检测试剂盒、所述单倍型组合在鸡蛋蛋壳品质性状标记辅助选择中的应用。

本发明的目的之八在于提供一种筛选鸡蛋蛋壳品质的方法，测定所述的4个SNP位点，根据单倍型组合预测蛋壳强度和蛋壳厚度的高低，单倍型组合为TGAC/TGAC或者TGAA/TGAA，其具有最高的蛋壳强度和蛋壳厚度。

具体地，所述蛋壳品质性状包括蛋壳强度、蛋壳厚度中的一种或多种。

优选地，申请人得到一种CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点的单倍型组合，该组合的序列为TGAC/TGAC，经过验证，证明上述单倍型组合在鸡蛋蛋壳强度、蛋壳厚度方面显著优于其他组合。

本发明的有益效果：

本发明首次发掘了鸡CDH17基因中与蛋壳品质性状相关的单倍型标记，所述的单倍型分子标记位于蛋鸡CDH17基因部分编码区序列(SEQ ID NO：1所示)，该序列长度为1253bp，该序列的第198bp、218bp、239bp和261bp处分别存在T/C、A/G、A/G和A/C等四个等位基因突变，由其组成的单倍型组合可以作为蛋鸡蛋壳品质性状相关的单倍型分子标记，为蛋鸡蛋壳品质性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。

附图说明

图1为本发明的技术路线示意图；

图2为蛋鸡CDH17基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测结果，其中M为Marker，1-6为CDH17基因片段扩增结果；

图3为蛋鸭CDH17基因4个SNP多态性位点不同基因型个体测序结果比较图；(A)第198bp存在T/C突变位点；(B)第218bp存在A/G突变位点；(C)第239bp存在A/G突变位点；(D)第261bp处存在A/C突变位点；

图4为CDH17基因的单倍型block分析结果。

具体实施方式

实施例1鸡CDH17基因SNP检测片段的获得及SNP检测方法的建立

1、蛋鸡基因组DNA的提取

本发明的试验蛋鸡品种为江汉鸡，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场。蛋鸡基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

(1)采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取约1ml血液，注入经高压灭菌并装有200μL无菌ACD抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。吸取10μL抗凝血，加入500μL BB2和10μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，室温孵育10min。

(2)短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12000g离心1min，弃流出液。

(3)加入500μL溶液CB3，12000g离心30s，弃流出液。

(4)加入500μL溶液WB3，12000g离心30s，弃流出液。

(5)重复步骤4一次。

(6)12000g离心2min，彻底去除残留的WB3。

(7)将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入50-200μL预热的EB或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃下保存备用。

2、蛋鸡CDH17基因的部分核苷酸片段的获得

(1)PCR扩增

根据NCBI数据库公布的蛋鸡CDH17基因序列(登录号Gene ID：NC_006089.5)设计引物对，该引物对的序列如下：

上游引物：5’-TTTGAACAAGGTAAGGGA-3’(SEQ ID NO：2所示)，

下游引物：5’-CCAAGTGAAGGAAGGAGA-3’(SEQ ID NO：3所示)。

利用上述引物在江汉鸡基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件见表2所示。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

将所得的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用DNAStar软件进行Blast比对分析，结果如图3所示，发现在该序列中的第198bp、218bp、239bp和261bp处分别存在T/C、A/G、A/G和A/C等四个等位基因突变，上述突变引起CDH17基因的多态性，共形成7种单倍型，分别为TGAC、TGAA、CAGC、TAGC、CAGA、TAAC和TGGC。上述4个SNP标记的核苷酸序列参考序列表SEQID NO：1。

实施例2本发明制备的分子标记在江汉鸡中的多态性分布检测

对蛋鸡CDH17基因部分编码区区域的4个位点的多态性进行检测，在每个位点均检测到三种基因型，基因型频率、等位基因频率鸡和分布情况如表3所示。

表3-蛋鸡CDH17基因基因型频率和等位基因频率

备注：基因型频率一列括号内数字为该基因型的个体数。

由表3可知，所述序列的4个突变位点均检测到3种基因型，在CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点上，优势等位基因分别为T、G、A、C，优势基因型分别为TT、GG、AA和CC。

实施例3本发明的分子标记与蛋鸡蛋品质性状的关联分析与应用

为了确定检测出的蛋鸡CDH17_SNP1至CDH17_SNP4标记与蛋鸡蛋品质性状的差异是否相关，选择江汉鸡(样本数314个)为试验材料，样本采集及鸡蛋样品收集于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场，测定每个蛋的蛋重、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋黄重等性状，利用直接测序法进行多态性检测，并分析蛋鸡CDH17基因部分编码区不同基因型与鸡蛋壳品质性状的相关关系。采用SPSS18.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，所用模型如下：

Yij＝u+Gi+Pj+eij

其中，Yij为性状观察值；u为性状总平均值；Gi为基因型效应；Pj为固定效应；eij为随机误差。

在江汉鸡中进行4个突变位点不同基因型与鸡蛋品质性状间的关联分析，统计分析结果总结于表4。

表4蛋鸡CDH17基因4个突变位点的多态性与鸡蛋品质性状的关联分析

注：上表中相同上表字母表示差异不显著，字母a、b、c表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。

由表4可以看出，CDH17基因CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点多态性与蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄重等具有显著相关性(P<0.05)。其中CDH17_SNP1位点的CC基因型、CDH17_SNP2位点的AA基因型、CDH17_SNP3位点的GG基因型及CDH17_SNP4位点的AA基因型具有更高的蛋壳强度和蛋壳厚度。

实施例4具有优良蛋壳品质性状的CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点的单倍型组合的鉴定

1、单倍型与单倍型组合的构建

利用Haploview软件进行CDH17_SNP1至CDH17_SNP4的单倍型分析，将得到的所有个体的CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点的基因型数据输入PHASE程序，计算得到每个个体的基因型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度。单倍型block分析结果如图4所示。

由图4可知，根据CDH17_SNP1至CDH17_SNP4位点连锁不平衡分析，共找到1个单倍型block，对该单倍型block进行单倍型分析，在本发明研究的江汉鸡群体中发现7种单倍型，如下表5所示。

表5-CDH17基因SNP位点单倍型统计结果

单倍型	序列	数量(只)
			H1	TGAC	188
H2	TGAA	60
			H6	CAGC	42
H5	TAGC	18
			H7	CAGA	3
H4	TAAC	2
			H3	TGGC	1

对上述单倍型组成的每个个体的单倍型组合进行分析，共发现14种单倍型组合，见表6。

表6 CDH17基因单倍型组合

剔除样品群体中数量较少的部分单倍型组合，选择数量最多的5种单倍型进行关联分析。

2、单倍型组合与蛋壳品质性状的关联分析

利用SPSS18.0软件进行单倍型组合与蛋壳品质性状的关联分析，结果见表7。

表7优势单倍型与蛋壳品质性状的关联分析结果

单倍型	所占比例	蛋重(g)	蛋壳强度(kg/cm<sup>2</sup>)	蛋壳厚度(mm)	蛋黄重(g)
						H1H1	0.39	48.93±2.78	22.74±1.90<sup>a</sup>	0.29±0.01<sup>a</sup>	18.03±1.01<sup>a</sup>
H1H2	0.26	49.36±3.32	18.43±1.72<sup>ab</sup>	0.27±0.02<sup>ab</sup>	18.25±1.25<sup>a</sup>
						H1H5	0.06	37.60±2.81	14.76±1.21<sup>b</sup>	0.24±0.01<sup>b</sup>	13.84±1.09<sup>b</sup>
H1H6	0.24	44.61±3.26	18.09±1.44<sup>ab</sup>	0.26±0.01<sup>ab</sup>	16.50±1.35<sup>ab</sup>
						H2H2	0.05	48.32±3.00	22.40±1.17<sup>a</sup>	0.28±0.02a<sup>b</sup>	17.96±1.46<sup>a</sup>

由表7可知，H1/H1和H2H2(其序列分别为：TGAC/TGAC和TGAA/TGAA)单倍型组合个体的蛋壳强度、蛋壳厚度均显著高于其他单倍型组合个体(P<0.05)，且H1H1单倍型组合的个体蛋壳强度和蛋壳厚度最佳、个数最多。因此，在本实施例的试验群体中H1H1(其序列为：TGAC/TGAC)单倍型组合具有最佳的蛋壳品质性状。

本实施例鉴定了一个具有优良蛋壳品质性状的单倍型组合(其序列为：TGAC/TGAC)，因此，在江汉鸡群体中，通过对该单倍型组合个体的选留，将有助于提高蛋鸡的蛋壳品质性状。综合以上结果，本发明的突变位点组成的单倍型组合可作为提高蛋鸡蛋壳品质性状的潜在遗传标记用于江汉鸡的辅助选择中。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (198)..(198)

<223> y=t或c

<220>

<221> allele

<222> (218)..(218)

<223> r=g或a

<220>

<221> allele

<222> (239)..(239)

<223> r=a或g

<220>

<221> allele

<222> (261)..(261)

<223> m=c或a

<400> 1

tttgaacaag gtaagggagc tggagttgta ctgcactcct gacaccagag gttcggggtt 60

tgtggcattg atcaccaggt tgtgcacttc agctgtttca aaatcaagag cctggataaa 120

tcagaaaagt gtattttaag caatggtccc actgcccgct tcagcaagca ccagatagat 180

gtgagaatgt tctcgttytt catctgtagc ccacctgrct gagcttgacc catgaggart 240

cagcaaccca caggctgagg mcctgagtgc tgctgccaga gggcagaggg gagctcctct 300

gcctttctca ccatgagaaa cagcaaaatc ctcttcttcc caaggaagat atagaggaaa 360

taaaggagag ctgtcaagag taaaataaca ctgggaacag tcaatttaaa tgaaaccata 420

tgcccatttg aaggcttcct cagcaaccac atttcctaat aatgttgcca cctgcctgcc 480

taagtttaat agctatatcc tgtttacagc aatagtattt atagttccat actagaaggc 540

cttggatgac ctctggctta caaaagtctc gtgaggattg ttacaccatg gagtttctca 600

caattgcctc ctcaggaaaa ataatgatgc tgaggtcaag ccggaataac tgcccttggc 660

ctggctagtg aacttgatgc taacaaggtg tcacaacttg gaaagtgagc aatcattttt 720

tcagacacat agttcatgtc cttccaaaaa ggctaatttc aaagggagaa atattttgtt 780

attgaaatgc ctggattcag tggaaaacct tcctcgtgtt tctgattccg acactcggca 840

cgtgggattt atcagccacc tcagcacaca ctgacctcgt ctttgccaca ggcagtgttt 900

gcctctgcag gaacaatctg tcctgtgctg agacaagcca gtttcacctg tgcttggtgg 960

caaaagccac caacatccta gatcaccagt agggtggaag atctgtttca tggcagccta 1020

ctaccatggc tgcagcctgt cactccaaca gtgccatttt tcacatgtgg tacataaaga 1080

tctcctgctc agttagagaa aggggcaaca gcagagccag cagccatgtg tagacatata 1140

taggagaaga ataaatccat ctattcacct tgttaatctt aaggaatcct cgatttgtct 1200

caggatctgt ctctatgatg aacgtgttgt ctggatctcc ttccttcact tgg 1253

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttgaacaag gtaaggga 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaagtgaag gaaggaga 18

Claims

1.一种CDH17基因中与鸡蛋蛋壳品质性状相关的单倍型标记，其特征在于，所述的单倍型标记位于位于蛋鸡CDH17基因部分编码区序列中，所述的单倍型标记的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，该序列长度为1254bp，所述单倍型标记包括4个SNP位点：

SNP1位点：在SEQ ID NO.1所示序列中第198bp处存在T/C多态性位；

2.如权利要求1所述的单倍型标记，其特征在于，所述序列中的第198bp、218bp、239bp和261bp处的优势等位基因分别是T、G、A、C；优势基因型分别为TT、GG、AA和CC。

3.一种用于扩增权利要求1-2任一所述单倍型标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种与鸡蛋蛋壳品质性状相关的CDH17基因SNP的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物对。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括10×buffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶；或者所述检测试剂盒还包括PCRmix。

6.一种鸡CDH17基因蛋壳品质性状相关SNP的检测方法，其特征在于，采用权利要求3所述的引物对、或者权利要求4所述的检测试剂盒进行检测。

7.一种单倍型组合的构建方法，其特征在于，首先采用权利要求6所述的方法检测出所述4个SNP位点；然后构建出七种单倍型，H1：TGAC，H2：TGAA，H3：TGGC，H4：TAAC，H5：TAGC，H6：CAGC，H7：CAGA；再根据所述单倍型构建的单倍型组合并与鸡蛋蛋壳品质表型相关联，单倍型组合H1H1、H2H2蛋壳强度和蛋壳厚度最高。

8.一种包含权利要求1所述的单倍型标记的单倍型组合，其特征在于，所述单倍型组合为包含所述4个SNP位点的组合，具体为TGAC/TGAC或者TGAA/TGAA，所述两种单倍型组合具有最高的蛋壳强度和蛋壳厚度。

9.权利要求1-2任一所述的单倍型标记、权利要求4所述的检测试剂盒、权利要求8所述的单倍型组合在鸡蛋蛋壳品质性状标记辅助选择中的应用。

10.一种筛选鸡蛋蛋壳品质的方法，其特征在于，测定权利要求1所述的4个SNP位点，根据单倍型组合预测蛋壳强度和蛋壳厚度的高低，单倍型组合为TGAC/TGAC具有最高的蛋壳强度和蛋壳厚度。