CN109628613B - 一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其应用，所述的分子标记位于蛋鸭LRRTM1基因部分编码区序列，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列长度为1427bp，该序列的第1259bp处存在一个T/C的等位基因突变；其单核苷酸多态性(SNP)可以作为蛋鸭产蛋和蛋品质相关性状的分子标记，本发明还公开了该分子标记的筛选方法及其在蛋鸭产蛋和蛋品质相关性状关联分析中的应用。该分子标记在蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择中的应用，检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响。

Description

一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及蛋鸭分子标记筛选技术领域，尤其涉及与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsim，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，包括单碱基的插入、缺失、转化和颠换等。由于分布的广泛性和稳定性，在动物分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection,MAS)育种上发挥着重要作用，成为加快蛋鸭重要经济性状尤其是那些限性性状遗传改良的可行性技术。基于此，进一步鉴定与蛋鸭经济性状相关的分子标记，进而借助MAS将大大提高选种的准确性。

产蛋性能和蛋品质性状是蛋鸭生产中重要的经济性状，主要包括开产日龄、40周龄产蛋数、72周龄产蛋数、蛋壳强度、蛋白高度、蛋黄重、哈氏单位、蛋黄颜色等，是典型的由微效多基因控制的数量性状，同时受环境、营养以及饲养管理等多个因素的影响。利用分子标记辅助选择技术、通过对产蛋性能和蛋品质性状相关基因或与之连锁的分子标记进行选择，寻找蛋鸭产蛋性状基因座相连锁的分子标记，并将其应用于蛋鸭产蛋性能和蛋品质性状的改良，成为加快高产、优质蛋鸭新品种培育的有效手段之一，对于高产、优质蛋鸭品种的培育具有重要意义。

富亮氨酸重复序列跨膜蛋白1(Leucine rich repeat transmembrane neuronal1，LRRTM1)是一种突触细胞粘附蛋白，主要在人大脑皮质表达，其与神经轴蛋白和神经信号蛋白相互作用，调节谷氨酸能神经元的突触细胞粘附。已有研究表明LRRTM1基因对人的精神分裂症(Takashima et al.,2011)、用手习惯(Beste et al.,2018)、小鼠的视觉行为(Aboozar et al.,2018)等具有重要的调控作用。LRRTM1基因在蛋鸭上的研究却鲜有报道，迄今为止，尚无有关蛋鸭LRRTM1基因作为鸭产蛋和蛋品质性状的分子标记的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其筛选方法与应用，本发明发掘了与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记，为蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择提供参考依据。

本发明的目的之一在于提供一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记所述的分子标记位于蛋鸭LRRTM1基因部分编码区序列，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，该序列长度为1427bp，该序列的第1259bp处存在一个T/C的等位基因突变。

所述序列的第1259bp处的T或C的碱基多态性位点，表现为TT、TC或CC三种基因型，其中TC基因型为蛋鸭产蛋和蛋品质性状的优势基因型。

本发明的目的之二在于提供所述的分子标记的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-TTCCTTCTTATCGGTCTC-3'(SEQ ID NO：2所示)，

下游引物：5'-ATGCATGGTCTGTTTCTG-3'(SEQ ID NO：3所示)。

本发明的目的之三在于提供一种筛选与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤：

从蛋鸭血液中提取基因组DNA，用权利要求3所述的引物对在蛋鸭的基因组DNA进行扩增，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列并测序，根据测序结果筛查DNA序列变异，在1259bp处存在一个T/C的等位基因突变，并在蛋鸭中进行其基因型与产蛋和蛋品质性状性状的关联分析。

本发明的目的之四在于提供所述的分子标记在蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择中的应用。

本发明的目的之五在于提供所述的引物对在蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择中的应用。

所述产蛋性能包括蛋鸭开产日龄、72周产蛋数、蛋壳强度和蛋白高度中的一种或多种。

其中，对于蛋鸭开产日龄、72周产蛋数性状，TC基因型个体显著优于TC、CC两种基因型的个体；对于蛋壳强度和蛋白高度性状，TT基因型表现最佳，其次为TC基因型，最后为CC基因型个体。

本发明的有益效果：

本发明发掘了与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记，所述的分子标记位于蛋鸭LRRTM1基因部分编码区序列(SEQ ID NO：1所示)，该序列长度为1427bp，该序列的第1259bp处存在一个T/C的等位基因突变，该单核苷酸多态性(SNP)可以作为蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记，为蛋鸭产蛋和蛋品质性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。

附图说明

图1：是本发明的技术路线示意图；

图2：蛋鸭LRRTM1基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测结果，其中M为Marker，1-4为LRRTM1基因片段扩增结果；

图3：蛋鸭LRRTM1基因不同基因型个体测序结果比较图；在序列的第1259个碱基处存在的T/C突变位点是导致LRRTM1基因多态性的特异性位点。

具体实施方式

实施例1蛋鸭LRRTM1基因部分编码区片段的获得及SNP检测方法的建立

1、蛋鸭基因组DNA的提取

本发明的试验蛋鸭品种为荆江蛋鸭新品系，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场。蛋鸭基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

(1)采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取约1ml血液，注入经高压灭菌并装有200μL无菌ACD抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。吸取10μL抗凝血，加入500μL BB2和10μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，室温孵育10min。

(2)短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12000g离心1min，弃流出液。

(3)加入500μL溶液CB3，12000g离心30s，弃流出液。

(4)加入500μL溶液WB3，12000g离心30s，弃流出液。

(5)重复步骤4一次。

(6)12000g离心2min，彻底去除残留的WB3。

(7)将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入50-200μL预热的EB或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃下保存备用。

2、蛋鸭LRRTM1基因的部分核苷酸片段的获得

(1)PCR扩增

根据NCBI数据库公布的蛋鸭LRRTM1基因序列(登录号Gene ID：XM_021274471.2)设计引物对，该引物对的序列如下：

上游引物：5'-TTCCTTCTTATCGGTCTC-3'(SEQ ID NO：2所示)，

下游引物：5'-ATGCATGGTCTGTTTCTG-3'(SEQ ID NO：3所示)。

利用上述引物在荆江蛋鸭基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件见表2所示。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

将所得的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用DNAStar软件进行Blast比对分析，结果如图3所示，发现在该序列中的第1259位碱基处存在一个T/C碱基突变，该突变引起LRRTM1基因的多态性。其中只出现C峰表示为CC纯合基因型，只出现T峰表示为TT纯合基因型，同时出现C和T峰表示为TC杂合基因型。

实施例2本发明制备的分子标记在荆江蛋鸭中的多态性分布检测

对蛋鸭LRRTM1基因部分编码区区域T1259C位点的多态性进行检测，在检测群体中检测到三种基因型，基因型频率和分布情况如表3所示。

表3荆江蛋鸭LRRTM1基因基因型频率和等位基因频率

备注：基因型频率一栏括号内为基因型频率，括号外为该基因型的个体数。

由表3可知，所述序列的第1259bp处的T或C的碱基多态性位点表现为TT、TC或CC三种基因型，其中TC基因型为优势基因型。

实施例3本发明的分子标记与蛋鸭产蛋和蛋品质性状的关联分析与应用

为了确定蛋鸭LRRTM1基因部分编码区的SNP与蛋鸭产蛋和蛋品质性状的差异是否相关，选择选育的荆江蛋鸭新品系(样本数656个)为试验材料，样本采集及数据收集与湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场，利用直接测序发进行多态性检测，并分析蛋鸭LRRTM1基因部分编码区不同基因型与蛋鸭产蛋和蛋品质性状的相关关系。采用SPSS18.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，所用模型如下：

Yij＝u+Gi+Pj+eij

其中，Yij为性状观察值；u为性状总平均值；Gi为基因型效应；Pj为固定效应；eij为随机误差。

在荆江蛋鸭中进行不同基因型与蛋鸭产蛋和蛋品质性状间的关联分析，统计分析结果总结于表4。

表4蛋鸭LRRTM1基因T1259C位点的多态性与产蛋、蛋品质性状的关联分析

注：上表中相同上表字母表示差异不显著，字母a、b、c表示差异显著。

由表4可以看出，LRRTM1基因T1259C位点的多态性与开产日龄、72周产蛋数、哈氏单位、蛋白高度和蛋黄颜色具有显著相关性(P<0.05)；对于蛋鸭的产蛋性能，TC基因型个体的72周产蛋数和开产日龄显著优于其他两种基因型(P<0.05)；在蛋品质方面，对于蛋壳强度和蛋白高度性状，三种基因型间存在显著差异(P<0.05)，其中TT基因型表现最佳，其次为TC基因型，最后为CC基因型个体。因此，在荆江蛋鸭群体中，通过对TC基因型个体的选留，将有助于提高蛋鸭的产蛋性能和蛋品质性状。综合以上结果，本发明的突变位点可作为提高蛋鸭产蛋和蛋品质性状的潜在分子标记。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (1259)..(1259)

<223> y=t或c

<400> 1

ttccttctta tcggtctctg tttaaactgg ctgctgagga agcccccggg gttgatattg 60

tgtacgctgg gtatcttttc taaaatgctt ccagccgtga atagtgggtg tccacagcta 120

tgtcggtgtg agggcaggct tttgtactgt gaatcactga atctcacaga gatgcctcgc 180

aacctgtcgg gcatgatggg cttgtctctg cggtacaaca gcctttcaga gctgcatgac 240

ggacagttca cagggttaat gcagctcacg tggctctatc tggatcacaa tcacatttgc 300

tcagtggagg ggaatgcctt tcaaaaattg cggcgagtga aagagctcac cctgagttcc 360

aacaaaataa cccaactgcc caacaccacg ttccgaccca tgccaaactt gcgcagtgtg 420

gatttatcgt acaacaacat ccaggcgctg gagcccgacc tgtttcacgg gctgagaaaa 480

ctcacgacgt tgcacatgcg gtcgaacgcc atcaagttcg tgccggtgag aatttttcag 540

gactgtcgca gcctgaagtt tctagacata ggatacaatc agttaaagag cctggctcga 600

aactcttttg caggcttgtt caagctcacc gagctgcacc tcgagcacaa tgacttggtg 660

aaggtgaatt tagcccactt tcccaggctc atctccctgc actcgctctg cttgcggcgg 720

aataaagtta ccatcgtcgt caacactttg gactggatat ggcaactgga aaagctggat 780

ctctctggca acgaaatcga gtacatcgaa cctcacgtct tcgaaagcgt gcctcacctc 840

aagtccctgc agctggactc caaccggctg acctacatcg actcccgcat cctggactcc 900

tggaagtccc tcactagcat cagcctctcc gccaacacct gggactgcgg ccgcaacgtc 960

tgcgccctgg cctcctggct gagcaacttc aagggccgct acgacagcaa cctgctctgt 1020

gccacccccg agtatgcgca gggtgaggac gttttggatg ccgtgtacgc tttccactta 1080

tgcgaggaca cggcggaccc cacgagcatc aacaccctct cccctgtgac caacaacagc 1140

gaccaaatgt tcggctacgg ctcggcgacc gccacgtcca acgtgccgga tgccgacgag 1200

gagccgacga cgtacgccat caccgtgacg ctgcccggcg agaacgccga gaacgccgyg 1260

cagattcaca aggtggtgac ggggaccatg gcgctgattt tcagcttcct catcgtggtt 1320

ttagtgttgt acgtctcctg gaagtgcttt cctgccagca tcaggcagct aagacagtgc 1380

tttgtgacac agcgcaggaa gcagaagcag aaacagacca tgcatca 1427

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttccttctta tcggtctc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcatggtc tgtttctg 18

Claims (8)

1.一种与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记，其特征在于，所述蛋鸭品种为荆江蛋鸭，所述的分子标记位于蛋鸭LRRTM1基因部分编码区序列，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列长度为1427bp，该序列的第1259bp处存在一个T/C的等位基因突变。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述序列的第1259bp处的T或C的碱基多态性位点，表现为TT、TC或CC三种基因型，其中TC基因型为蛋鸭产蛋和蛋品质性状的优势基因型。

3.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，用于扩增所述分子标记的引物对为：

上游引物：如序列表SEQ ID NO：2所示，

下游引物：如序列表SEQ ID NO：3所示。

4.一种筛选与蛋鸭产蛋和蛋品质性状相关的分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：

从蛋鸭血液中提取基因组DNA，用权利要求3中所述的引物对在蛋鸭的基因组DNA进行扩增，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列并测序，根据测序结果筛查DNA序列变异，在1259bp处存在一个T/C的等位基因突变，并在蛋鸭中进行其基因型与产蛋和蛋品质性状的关联分析，其中所述蛋鸭品种为荆江蛋鸭。

5.权利要求1-2任一所述的分子标记在蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择中的应用，其特征在于，所述蛋鸭品种为荆江蛋鸭。

6.权利要求3中所述的引物对在蛋鸭产蛋和蛋品质性状辅助选择中的应用，其特征在于，所述蛋鸭品种为荆江蛋鸭。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产蛋和蛋品质性状包括蛋鸭开产日龄、72周产蛋数、蛋壳强度和蛋白高度中的一种或多种。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，TC基因型个体的72周产蛋数和开产日龄显著优于TT、CC两种基因型；对于蛋壳强度和蛋白高度性状，TT基因型表现最佳，其次为TC基因型，最后为CC基因型个体。

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