CN106011273A - 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106011273A
CN106011273A CN201610548970.4A CN201610548970A CN106011273A CN 106011273 A CN106011273 A CN 106011273A CN 201610548970 A CN201610548970 A CN 201610548970A CN 106011273 A CN106011273 A CN 106011273A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cattle
mononucleotide polymorphism
pcr
exon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610548970.4A
Other languages
English (en)
Inventor
徐建峰
容维中
王珂
郭海龙
桑国俊
杨明
保国俊
陈万辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GANSU INSTITUTE OF ANIMAL HUSHANDRY VETERINARY MEDICINE
Original Assignee
GANSU INSTITUTE OF ANIMAL HUSHANDRY VETERINARY MEDICINE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GANSU INSTITUTE OF ANIMAL HUSHANDRY VETERINARY MEDICINE filed Critical GANSU INSTITUTE OF ANIMAL HUSHANDRY VETERINARY MEDICINE
Priority to CN201610548970.4A priority Critical patent/CN106011273A/zh
Publication of CN106011273A publication Critical patent/CN106011273A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，为确定与肉牛生长发育性状相关的SNPs位点，选留优势基因型个体组建核心群，加快肉牛新品种培育提供分子生物学依据。它包括如下步骤：血样的采集，基因组DNA提取及检测，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，GH基因不同基因型个体的测序，GH基因不同位点的遗传特性指标，GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析。本发明采用PCR‑SSCP方法和DNA测序技术检测早胜牛GH基因第2外显子和第5外显子的单核苷酸多态性。本发明建立了适用于一般分子生物学研究需要，能够快速、低成本、准确检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，可为开展其它基因的多态性研究提供参考。

Description

一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法。
背景技术
随着分子生物学技术的快速发展，从分子水平上探索物种的遗传结构、遗传多样性及系统发育关系，已成为群体遗传学和进化生物学研究的一个重要领域。这不仅对保护和开发具有优良特性的地方品种具有重要的现实意义，也使得应用分子标记辅助选择技术选育新品种成为可能。
与常规育种方法相比，分子育种技术克服了传统杂交选择法的各种缺陷和年龄、性别、组织以及环境因素的影响，具有高效快速育种的特点，是当前动物遗传育种领域的研究热点。应用分子育种技术，首先要研究确定与动物经济性状相关的重要功能基因及单核苷酸多态性位点（简称为SNPs）。
目前，检测SNPs的方法主要有DNA测序、PCR-RFLP（限制性长度多态性）、PCR-RAPD（随机扩增多态性）、PCR-SSCP（单链构象多态性）等，在上述检测技术中，
DNA测序法虽然检测灵敏度较高，但往往要进行全基因组测序，成本昂贵；并且需要购置专业的测序仪，不适用于一般分子生物学研究的需要。PCR-RFLP技术操作繁琐，通常需要根据不同DNA序列的突变选择较多的限制性内切酶，试验成本较高。PCR-RAPD技术在应用中由于引物是随机合成的，受外界环境条件影响较大，并且检测结果不能判断基因型个体是纯合型还是杂合型。而PCR-SSCP技术因其操作简便、灵敏度高、成本低，是筛选基因突变和检测基因单核苷酸多态性的有效手段之一；但常规的PCR-SSCP检测方法仍存在操作步骤较多，试验过程较长，条件不稳定等不足之处，需要在实践中对反应条件进行优化和改进，才能获得最佳的试验效果。
生长激素（GH）是由脑垂体分泌的一种具有广泛生理功能的多肽类激素，对脊椎动物的骨骼生长及分化，糖类、蛋白质及脂肪代谢具有重要的调节作用，是研究畜禽生长发育性状的重要候选基因。现阶段研究主要集中在GH基因遗传结构上，但在基因多态性和经济性状的相关性方面报道不多，与分子标记辅助选择技术的应用还有一定差距。早胜牛作为秦川牛的优秀类群之一，在分子水平上开展早胜牛GH基因遗传多态性研究，对其遗传改良和种质资源创新是非常必要的，可为选育甘肃现代肉牛新品种提供理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种在实验条件下操作简便、反应条件稳定、成本较低的快速检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法。
本发明方法为确定与肉牛生长发育性状相关的SNPs位点，选留优势基因型个体组建核心群，加快肉牛新品种培育提供分子生物学依据。
本发明采取如下技术方案：一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，包括如下步骤：（1）血样的采集：采集早胜牛血样；（2）基因组DNA提取及检测：采用细胞裂解-核裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，将冷冻血样室温解冻后，吸取500uL至1.5mLEppendorf管，加入800uL细胞裂解液充分混匀，在6000rpm转速下离心2min；倒掉上清液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，6000rpm转速下离心2min，出现白色沉淀；加入200uL核裂解液充分混匀，静置2min后再加入100uL饱和氯化钠和300uL氯仿充分混匀，6000rpm转速下离心8min；吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000rpm转速下离心2min；倒掉上清液，室温下使乙醇挥发干净；待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯水溶解，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度；和紫外分光光度计检测其浓度；（3）PCR扩增：分别在GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，PCR反应体系按照梯度试验进行优化；PCR反应程序为：根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验；首先，保持其他条件不变，将某个条件作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效果；然后再对其他条件依次设置梯度，反复试验，最终确定最佳反应体系；为了确保试验结果的可靠性，可同时对几个样品进行重复试验。（4）、聚丙烯酰胺凝胶电泳，（5）、GH基因不同基因型个体的测序，（6）、GH基因不同位点的遗传特性指标：利用PopGen32软件计算GH基因第2外显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和多台信息含量；（7）、GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析。
作为本发明的进一步改进，一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，细胞裂解液组成为蔗糖110g、浓度为10mmol/L的Tris-HC1缓冲325mL、MgCl2-6H2O为1g和体积浓度为1%的聚乙二醇辛基苯基醚10mL。
作为本发明的进一步改进，核裂解液组成为浓度为10mmol/L的Tris-HC1缓冲液1.57g、乙二胺四乙酸3.75g、十二烷基硫酸钠10g和柠檬酸钠2.94g。
作为本发明的进一步改进，步骤3中PCR反应程序为：根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验，每个梯度范围为0.5℃—1℃，
变性温度、延伸温度一般分别设置为94℃和72℃即可，变性、退火和延伸时间为30sec—1min。
作为本发明的进一步改进，步骤3中PCR扩增结束后，取扩增后的DNA产物1μL与1μL的LoadingBuffer缓冲液充分混合后，点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V
电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察。
常见的聚丙烯酰胺凝胶染色方法为银染法，共4步（固定、染色、显色、终止），染色时间较长，耗时30min左右。作为本发明的进一步改进，采用银染法：上述步骤4中聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤为：先用超纯水冲洗凝胶2次，随后加入染色液轻摇10min，然后倒掉染色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇8min，待条带清晰后，停止显影反应并照相保存。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（7）具体是根据不同基因型与生长发育性状，建立最小二乘线性模型：
运用SPSS19.0软件的GLM（GeneralLinearModel）对生产数据进行统计分析，并运用最小二乘法拟合线性模型对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
本发明采用PCR-SSCP方法和DNA测序技术检测早胜牛GH基因第2外显子和第5外显子的单核苷酸多态性。以早胜牛血液全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2为引物，PCR扩增GH基因特定序列；对检测合格的PCR扩增产物进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行基因型判型和测序，确定GH基因第2外显子和第5外显子的SNPs位点；对不同基因型个体与生长发育性状（体重、体高、体长、胸围、肉用指数等）进行关联分析。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1、对PCR-SSCP检测流程中DNA提取方法和凝胶染色方法进行了优化，采用本发明建立的“细胞裂解-核裂解两步法”提取血液基因组DNA，与传统的酚—氯仿抽提法、试剂盒提取法等相比，提高了DNA浓度和纯度，OD260/OD280值为1.90，且操作简便，耗时仅需20min，成本较低；改进后的凝胶染色法，由4步简化为染色和显色2步，减少了试验耗材，染色时间也缩短至10min。
2、建立了适用于一般分子生物学研究需要，能够快速、低成本、准确检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，可为开展其它基因的多态性研究提供参考；
3、与NCBI公布的黄牛核苷酸序列（Genebank：M57764）进行比较，发现GH基因第2外显子存在2处SNPs，第5外显子存在3处SNPs，多态性较为丰富；
4、应用本发明提供的检测方法对GH基因不同基因型与生长发育性状进行关联分析，结果表明GH基因第2外显子和第5外显子可以作为早胜牛早期生长发育性状选育的标记位点。
附图说明
图1为采用细胞裂解-核裂解两步法提取的血液基因组DNA电泳检测图；
图2为P1引物扩增的PCR产物电泳检测图；
图3为P2引物扩增的PCR产物电泳检测图；
图4为P1引物扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图5为P2引物扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图6为P1引物扩增片段的基因型个体测序图；
图7为P2引物扩增片段的基因型个体测序图。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
术语解释：PCR-SSCP：单链构象多态性，即在中性聚丙烯酰胺凝胶中，相同长度的单链DNA因其序列不同或单个碱基差异，所形成的构象不同，从而出现泳动变位，通过显色在凝胶上显示出带型的差别，表现出多态性。
GH基因：由191个氨基酸组成，含5个外显子和4个内含子，分子量为22kDa，链内含有4个Cys组成两个二硫键。
下述实验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为从试剂公司购买的常规试剂及器材。
实施例1
1、血样的采集
采用静脉采血法从庆阳市宁县兴旺牧业有限责任公司采集早胜牛血样186份，装入一次性使用真空采血管（购自江苏宇力医疗器械有限公司），并保存于超低温冰箱（产品型号：BCD-796WBCN，保存温度：-20℃），样品编号依次为1—186。
2、基因组DNA提取及检测
图1为采用细胞裂解-核裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，可以看出DNA条带清晰，无任何杂带。具体提取方法为：将冷冻血样室温解冻后用移液器吸取500uL至1.5mL微量离心管(Eppendorf管)，加入800uL细胞裂解液（配方参见表1）充分混匀，6000rpm离心2min；倒掉上清液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，6000rpm离心2min，出现白色沉淀；加入200uL核裂解液（配方参见表1）充分混匀，静置2min后再加入100uL饱和氯化钠和300uL氯仿充分混匀，6000rpm离心8min；吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000rpm离心2min；倒掉上清液，室温下使乙醇挥发干净；待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯水溶解，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度；和紫外分光光度计检测其浓度。
结果表明，细胞裂解-核裂解两步法提取的DNA浓度较高，OD260/OD280值为1.90，且用时仅需20min，操作步骤简便，不需要使用蛋白酶K进行消化过夜，成本较低，能够满足一般实验室的要求。
注：(1) Sugarcan为蔗糖，EDTA为乙二胺四乙酸，sodium citrate为柠檬
酸钠，SDS为十二烷基硫酸钠，Triton X-100 为聚乙二醇辛基苯基醚；
(2)10mmol/ L Tris-HC1缓冲液：将1.21 g Tris溶解于800 mL超纯水
中，加入HC1调节pH值至8.0，定容至1000 mL；
（3）配置方法为按照上表用量加入各成分定容至1 L，调节PH值至8.0。
(4)其它试剂均为常规试剂，购自甘肃瑞德生物科技有限公司。
3、PCR扩增
参考NCBI上公布的黄牛GH基因核苷酸序列（Genebank：M57764），采用Rrime5.0软件分别在GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，引物序列见表2。
PCR反应体系按照梯度试验进行优化。首先，保持其他条件不变，将某个条件（如DNA模版体积）作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效果；然后再对其他条件依次设置梯度，反复试验，最终确定最佳反应体系，为了确保试验结果的可靠性，可同时对几个样品进行重复试验。PCR反应体系见表3。
注：2×loadingbuffer、TaqDNA聚合酶购自甘肃瑞德生物科技有限公司，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。
PCR反应程序为：根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验，每个梯度范围为0.5℃—1℃，变性温度、延伸温度一般分别设置为94℃和72℃即可，变性、退火和延伸时间一般为30sec—1min即可。优化后的PCR反应程序见表4。
PCR扩增结束后，取扩增后的DNA产物1μL与1μLLoadingBuffer缓冲液充分混合后，点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察结果。图2为P1引物扩增的PCR产物电泳检测图，其中，泳道1-6为PCR扩增产物，泳道7为MarkerD2000（自下向上片段大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）；图3为P2引物扩增的PCR产物电泳检测图，其中，泳道1-5为PCR扩增产物，泳道6为MarkerD2000（自下向上片段大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）。从上述图例中可以看出，对PCR反应条件进行优化后，扩增后的PCR产物条带清晰，且扩增条带与目的条带大小一致，表明达到了预期效果。
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳
将清洗干燥后的玻璃板和胶条用水粘合后，放在桌子上备用；在50ml三角瓶内依次加入丙烯酰胺、5×TBE、10%AP、TEMED和超纯水，混匀后缓慢倒入已放置好的玻璃板之间；倒好凝胶后插入梳子，观察凝胶聚合情况，随时补加不足的丙烯酰胺；凝胶聚合后缓慢拔掉梳子，用注射器针冲洗点样孔，然后将玻璃板转到电泳槽上用铁夹固定，在上、下槽中分别倒入1×TBE缓冲液（取10×TBE溶液100mL，定容至1000mL），250V电压下预电泳20min；取2ulPCR产物和4ul变性缓冲液（98%甲酰胺、10mmol/LEDTA、0.025%溴酚兰、0.025%二甲苯青）瞬时离心，98℃变性10min后置于冰水浴上5min，上样于中性聚丙烯酰胺凝胶中（浓度为12%、交联度为29:1），然后在4℃、180V条件下电泳12h。
常见的聚丙烯酰胺凝胶染色方法为银染法，共4步（固定→染色→显色→终止），染色时间较长，耗时30min左右；本发明用染色方法进行了改进，即先用超纯水冲洗凝胶2次，随后加入染色液轻摇10min，然后倒掉染色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇8min，待条带清晰后，停止显影反应并照相保存。根据判型结果，GH基因第2外显子（P1引物）存在3种基因型（AA、BB、AB），第5外显子（P2引物）存在2种基因型（CC、CD）。图4为P1引物扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图，图5为P2引物扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。从图中可以清晰地看出不同单链DNA呈现出不同构象，表现为不同带型和位置，从而便于准确进行不同基因型的判定。
5、GH基因不同基因型个体的测序
将不同基因型个体送至北京三博远志生物技术有限责任公司进行纯化和测序。由于2对引物扩增片段均在500bp以内，所以选择单向测序，
采用BioEdit软件对测序序列与原序列进行对比分析，发现GH基因第2外显子存在2处SNPs（C1059T和C1150A），第5外显子存在3处SNPs（C2258T、C2277T和A2291C）。图6为P1引物扩增片段的基因型个体测序图，箭头表示碱基突变，数字表示突变位置；图7为P2引物扩增片段的基因型个体测序图，箭头表示碱基突变，数字表示突变位置。
6、GH基因不同位点的遗传特性指标
利用PopGen32软件计算GH基因第2外显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和多台信息含量，结果见表5、表6。
7、GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析
基因型：根据步骤4确定基因型。
生长发育性状：按照《家畜育种学》中确定的方法，测定早胜牛初生、1月龄、6月龄、周岁体重及周岁体高、体长、胸围、肉用指数。
根据影响肉牛经济性状的不同因素，建立最小二乘线性模型：
运用SPSS19.0软件的GLM（GeneralLinearModel）对生产数据进行统计分析，并运用最小二乘法拟合线性模型对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
相关性分析结果表明：GH基因第2外显子，周岁重和周岁胸围，BB型显著高于AA型和AB型（P<0.05）；初生重、6月龄重，BB型和AB型都显著高于AA型（P<0.05）；而1月龄重、周岁体高、周岁体长、肉用指数，3个基因型间差异不显著（P>0.05）。第5外显子，初生重、6月龄重、周岁重，肉用指数，CD型显著高于CC型（P<0.05）；其他指标，3个基因型间差异不显著（P>0.05）。以上结果表明BB型和CD型可能是影响早胜牛生长发育性能的优势基因型，可以作为早胜牛早期选种的分子标记位点。
本发明通过对早胜牛GH基因第2外显子和第5外显子单核苷酸多态性进行检测与分析，以便筛选出可用于生长发育性状选育的标记位点和优势基因型，建立核心群用于纯种繁育，加快地方肉牛新品种选育进程。

Claims (7)

1.一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于它包括如下步骤：
（1）血样的采集：采集早胜牛血样；
（2）基因组DNA提取及检测：
采用细胞裂解-核裂解两步法提取的早胜牛血液基因组DNA，将冷冻血样室温解冻后，吸取500uL至1.5mLEppendorf管，加入800uL细胞裂解液充分混匀，在6000rpm转速下离心2min；倒掉上清液，加入800uL细胞裂解液充分混匀，6000rpm转速下离心2min，出现白色沉淀；加入200uL核裂解液充分混匀，静置2min后再加入100uL饱和氯化钠和300uL氯仿充分混匀，6000rpm转速下离心8min；吸取上清液200uL，加入600uL无水乙醇充分混匀后，12000rpm转速下离心2min；倒掉上清液，室温下使乙醇挥发干净；待乙醇挥发完全后，加入50uL超纯水溶解，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度；和紫外分光光度计检测其浓度；
（3）PCR扩增：分别在GH基因第2外显子和第5外显子设计1对引物，PCR反应体系按照梯度试验进行优化；PCR反应程序为：根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验；
首先，保持其他条件不变，将某个条件作为参数设置不同梯度，检测PCR扩增效果；然后再对其他条件依次设置梯度，反复试验，最终确定最佳反应体系；
（4）、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（5）、GH基因不同基因型个体的测序
（6）、GH基因不同位点的遗传特性指标
利用PopGen32软件计算GH基因第2外显子和第5外显子的基因型频率、等位基因频率和多台信息含量；
（7）、GH基因不同基因型与生长发育性状的关联性分析。
2.根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：细胞裂解液组成为蔗糖110g、浓度为10mmol/L的Tris-HC1缓冲325mL、
MgCl2-6H2O为1g和体积浓度为1%的聚乙二醇辛基苯基醚10mL。
3. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：核裂解液组成为浓度为10mmol/L的Tris-HC1缓冲液1.57g、乙二胺四
乙酸3.75g、十二烷基硫酸钠10g和柠檬酸钠2.94g。
4.根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：步骤3中PCR反应程序为：根据引物序列中G+C含量初步确定退火温度
的大致范围，然后从低温向高温设置梯度试验，每个梯度范围为0.5℃—1℃，
变性温度、延伸温度一般分别设置为94℃和72℃即可，变性、退火和延伸时间
为30sec—1min。
5. 根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：步骤3中PCR扩增结束后，取扩增后的DNA产物1μL与1μL的
LoadingBuffer缓冲液充分混合后，点样于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上，100V
电压电泳20min后用紫外凝胶成像仪观察。
6.根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：步骤4中聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤为：先用超纯水冲洗凝胶2次，随后加入染色液轻摇10min，然后倒掉染色液，双蒸水清洗凝胶2次，再加入显色液轻摇8min，待条带清晰后，停止显影反应并照相保存。
7.根据权利要求1所述的一种检测早胜牛GH基因单核苷酸多态性的方法，其特
征在于：所述步骤（7）具体是根据不同基因型与生长发育性状，建立最小二乘线性模型：
运用SPSS19.0软件的GLM对生产数据进行统计分析，并运用最小二乘法拟合线性模型对不同基因型群体间进行差异显著性检验。
CN201610548970.4A 2016-07-13 2016-07-13 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法 Pending CN106011273A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610548970.4A CN106011273A (zh) 2016-07-13 2016-07-13 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610548970.4A CN106011273A (zh) 2016-07-13 2016-07-13 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106011273A true CN106011273A (zh) 2016-10-12

Family

ID=57109368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610548970.4A Pending CN106011273A (zh) 2016-07-13 2016-07-13 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011273A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913760A (zh) * 2018-07-26 2018-11-30 武汉生命之美科技有限公司 一种对单核苷酸多态性与特定性状关联性评估和量化的方法
CN114717332A (zh) * 2022-04-24 2022-07-08 华南农业大学 与家禽生长和肉质性状相关的snp分子标记及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928774A (zh) * 2010-06-12 2010-12-29 西北农林科技大学 检测山羊生长激素基因编码区5个碱基突变多态性的方法
CN104745716A (zh) * 2015-04-23 2015-07-01 吉林大学 一种牛agpat6基因单核苷酸多态性的检测方法
CN105200136A (zh) * 2015-09-24 2015-12-30 山西省农业科学院畜牧兽医研究所 与晋南牛生长性状相关的snp标记及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928774A (zh) * 2010-06-12 2010-12-29 西北农林科技大学 检测山羊生长激素基因编码区5个碱基突变多态性的方法
CN104745716A (zh) * 2015-04-23 2015-07-01 吉林大学 一种牛agpat6基因单核苷酸多态性的检测方法
CN105200136A (zh) * 2015-09-24 2015-12-30 山西省农业科学院畜牧兽医研究所 与晋南牛生长性状相关的snp标记及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴海港等: "信阳水牛GH 基因多态性与部分生长性状的相关性", 《信阳农业高等专科学校学报》 *
杜智恒等: "北极狐GHR 基因单核苷酸多态性及其与生长性状的相关性分析", 《遗传》 *
毛晓健等: "一种改良的变性聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染显色方法", 《现代临床医学生物工程学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913760A (zh) * 2018-07-26 2018-11-30 武汉生命之美科技有限公司 一种对单核苷酸多态性与特定性状关联性评估和量化的方法
CN108913760B (zh) * 2018-07-26 2022-06-07 武汉生命之美科技有限公司 一种对单核苷酸多态性与特定性状关联性评估和量化的方法
CN114717332A (zh) * 2022-04-24 2022-07-08 华南农业大学 与家禽生长和肉质性状相关的snp分子标记及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111705140B (zh) 体重性状相关的SNPs分子标记及其在湖羊辅助育种中的应用
CN107022604B (zh) 猪ntf3启动子区snp作为公猪繁殖性状分子标记与应用
CN105624314A (zh) 利用pcr技术检测山羊tmem95基因微小拷贝数变异的方法及其应用
CN106498078B (zh) 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用
CN106591429B (zh) 半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用
CN107619870A (zh) 能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用
CN108531615A (zh) 一种鸡HS6ST3基因43bp indel多态性标记及其应用、检测引物、试剂盒
CN109680078A (zh) 利用snp位点选择信号梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法
CN104131097B (zh) 一种检测肉牛ucp3基因单核苷酸多态性的方法及其应用
CN104862388B (zh) 与猪有效乳头对数性状相关的snp分子标记及应用
CN106011273A (zh) 一种检测早胜牛gh基因单核苷酸多态性的方法
CN113846171A (zh) 一种基于pik3r1基因鉴定鸡饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用
CN105671170B (zh) 一种用于鉴别鸡匍匐性状的引物组合及其应用
CN107988385A (zh) 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
CN101671726A (zh) 一种检测黄牛prdm16基因单核苷酸多态性的方法
CN111286547A (zh) 一种罗非鱼及其遗传多样性的微卫星鉴别引物和方法
Lan et al. A novel indel within the bovine SEPT7 gene is associated with ovary length
CN103290102B (zh) 一种基于pcr的snp分型方法及应用
CN101899500B (zh) 一种黄牛klf7基因的单核苷酸多态性检测方法
CN104131096B (zh) 一种检测肉牛ucp3基因单核苷酸多态性的方法
CN102816836A (zh) 一种黄牛fbxo32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法
CN103789407A (zh) 一种快速检测黄牛apoa2基因多态性的方法及应用
CN105543362A (zh) 一种黄牛PPARβ基因单核苷酸多态性的检测方法及分子育种方法
CN106701930A (zh) 利用pcr‑sscp检测绵羊fth‑1基因插入缺失多态性的方法及其应用
CN102747150B (zh) 一种用anapc13基因检测秦川牛体型大小的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161012