CN101928774A - 检测山羊生长激素基因编码区5个碱基突变多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测山羊生长激素(GH)基因编码区5个碱基突变多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，以山羊基因组DNA序列为模板，在TaqDNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用两对反应(PCR)引物P1和P2，在PCR条件下进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行扩增目的片段大小判定；采用DNA测序技术筛查到山羊GH基因编码区5个碱基的突变，然后对GH基因的SNPs进行基因分型和基因频率分析，以及与布尔山羊、布尔山羊和关中奶山羊的杂交后代(F1和F2代)3月龄的生长性状之间进行了关联分析；结果表明：GH基因P1和P2检测的SNPs位点可用作山羊生长性状早期选择(3月龄)的分子标记。

Description

检测山羊生长激素基因编码区5个碱基突变多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测山羊生长激素（GH）基因编码区5个碱基突变多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换（以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤）以及颠换（嘌呤与嘧啶互换）所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG（表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后）二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs（cSNPs）、基因周边SNPs（pSNPs）和基因间SNPs（iSNPs）等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。

根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即：1）DNA序列测定方法；2）PCR-SSCP与DNA测序结合法；3）AS-PCR方法；4）引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法。当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

生长激素（以下称GH）是由垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的单链多肽激素，由190～191个氨基酸组成。GH是一种具有广泛生理功能的生长调节激素，能影响几乎所有的组织类型和细胞，在动物的生长发育中发挥着重要的作用，具有促进肌肉、骨及软骨的生长，影响蛋白质、糖类、脂类的代谢，调节各种形式的RNA的生物合成等一些重要的生物学功能，对动物生长起着关键性的作用，但有人认为这种功能因动物种类不同而异。Sejrsen等（1996）认为，GH对哺乳动物有促进生长作用，而对禽类动物却不确定，同时也有很多研究证明GH对家禽确有促进生长的作用，不过GH作用的发挥与动物自身也有关系。

（1）促生长作用。GH能直接作用于全身的组织细胞，增加细胞的体积和数量，还可通过生长素介质的间接作用，促进钙、磷和硫酸根在软骨中的沉积，加速软骨基质的合成和软骨细胞的分裂，使骨髓部的软骨生长，再钙化成骨，从而促进骨的生长；不过一般认为GH对幼龄动物具有促生长作用，对成年动物则主要是调节能量代谢，保持能量的平衡。

（2）调节物质代谢。生长激素能促进氨基酸，特别是甘氨酸、亮氨酸进入细胞，能促进DNA合成，刺激RNA的形成，提高氨基酸合成蛋白质的速度，降低氨基酸的氧化分解。同时生长激素通过抑制脂肪酸合成酶mRNA的转录，降低脂肪酸合成酶活性，从而减少脂肪的沉积，还能加速脂肪分解，使进入肝脏的脂肪酸增多，经氧化后提供能量，游离脂肪酸增加还可对葡萄糖氧化产生抑制作用，从而减少葡萄糖的消耗。生理水平的GH可刺激胰岛素B细胞，引起胰岛素分泌，加强葡萄糖的利用。

生长激素发挥作用主要有两种途径：一是通过与生长激素受体（GHR）结合，刺激肝细胞、肌细胞产生胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）。IGF-Ⅰ通过旁分泌或自分泌方式作用于肌肉、骨骼等，促进机体生长发育。血中的生长介素对GH分泌也有负反馈调节作用。IGF-Ⅰ能刺激下丘脑释放GHRIH，从而抑制GH的分泌。IGF-Ⅰ还能直接抑制培养的腺垂体细胞GH的基础分泌和GHRH刺激的GH分泌，这说明IGF-Ⅰ可通过下丘脑和垂体两个水平对GH分泌进行负反馈调节；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。

因此，寻找快速、准确和操作简便的检测山羊生长激素（GH）基因突变多态性的方法，为山羊早期生长性状的标记辅助选择（MAS）提供宝贵的资料，是本领域技术人员一直关注的课题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测山羊生长激素（GH）基因编码区5个碱基突变多态性的方法，该方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），具有快速、准确和操作简便的特点。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种检测山羊生长激素（GH）基因编码区单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer（缓冲环境）、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用两对引物P1和P2，在PCR条件下进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的片段大小判定；采用DNA测序技术筛查到山羊激素基因编码区5个碱基突变，然后对生长激素基因的SNPs进行基因分型和基因频率分析，同时分析不同基因型与布尔山羊、布尔山羊和关中奶山羊的杂交后代（F1和F2代）3月龄的生长性状之间的关系。

所述的两对引物P1和P2分别如下：

引物P1：

上游引物1F：5'-TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT-3'；

下游引物1R：5'-CATCCTCCACTGCCATCCAACA-3'；

引物P2：

上游引物2F：5'-TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3'；

下游引物2R：5'-TCTAGGAAGGCACGGGGAGG-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

25μL反应体系：包括0.5U Taq DNA聚合酶（北京天根科技有限公司），12.5 μL 2×Buffer（内含Mg²⁺、dNTPs等，北京天根科技有限公司 Mix），0.3μL的山羊基因组DNA样品，10pmol/μL引物P1和P2的上、下游引物各0.3μL和灭菌超纯水11.4μL。

PCR反应程序如下：

（1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸40 s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，得到扩增片段，4℃保存。

（2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，得到扩增片段，4℃保存。

所述的山羊生长激素（GH）基因编码区编码区5个碱基突变位点分别位于山羊生长激素基因外显子3的第112bp、第142bp、第214bp以及山羊生长激素基因外显子4的第214bp和第266bp。

所述的电泳检测是先用2%琼脂糖检测PCR扩增片段大小（320bp和302bp），再用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析利用引物P1扩增的PCR产物，结果如下：纯合型AA在112bp、142bp和214bp位的碱基是A、C和C，杂合型AB在112bp和142bp位的碱基是G\A和T\C，杂合型AC在214bp位的碱基是T\C；同样用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析利用引物P2扩增的PCR产物，结果如下：纯合型EE在214bp和266bp位的碱基是C和C，杂合型EF在214bp位的碱基是T\C，杂合型EG在266bp位的碱基是A\C。

本发明与现有技术相比，具有以下有益的技术效果：

给出了与山羊生长性状相关的功能基因GH外显子3及其外显子5单核苷酸多态性，这5个SNPs能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

对GH基因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，以及与布尔山羊、布尔山羊和关中奶山羊的杂交后代（F1和F2代）3月龄的生长性状之间进行了关联分析；结果表明：GH基因P1和P2检测SNP位点可用作山羊生长性状早期选择（3月龄）的分子标记。

本发明提供的检测方法为GH基因的SNPs与山羊的生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于山羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

附图说明

图1是山羊GH基因外显子3扩增产物的电泳图；

图2是山羊GH基因外显子5扩增产物的电泳图；

图3是利用引物P1得到的山羊GH基因外显子3的PCR产物的电泳分析（10%聚丙烯酰胺凝胶电泳）图，图中，1和4表示：AA基因型；2、5和6表示：AB基因型；3表示：AC基因型；

图4是利用引物P2得到的山羊GH基因外显子5的PCR产物的电泳分析（10%聚丙烯酰胺凝胶电泳）图，图中，1和2表示：EG基因型；3、5和6表示：EF基因型；4表示：EE基因型；

图5是利用引物P1得到的山羊GH基因外显子3的PCR产物不同基因型测序图，图中，a表示：AA基因型；b表示：AB基因型；c表示：AC基因型；

图6是利用引物P2得到的山羊GH基因外显子5的PCR产物不同基因型测序图。

以下通过对山羊样本采集及基因组DNA提取、检测和浓度分析、山羊GH基因外显子3和外显子5的PCR扩增、山羊GH基因外显子3和外显子5扩增产物的聚丙烯凝胶电泳分析实例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

 1、山羊GH基因外显子3和5的PCR扩增及其多态性的检测

（1）山羊血样的采集及处理

取山羊血样5mL，加入0.2 μL的ACD（柠檬酸2.4g；柠檬酸三钠6.6g；葡萄糖7.35g；定容至50mL，高压灭菌）抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

采用3个山羊群体共计686个无血缘关系的母羊血样，具体为：西农萨能羊血样190份，采自陕西省千阳萨能羊种羊场；布尔山羊血样168份、布尔与关中奶山羊杂交F1代（血样136份）和F2代（血样192份），采自陕西麟游县波尔山羊种羊场和陕西省杨凌金坤公司洛南分公司。

（2）血样基因组DNA的提取和纯化

）将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL的Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，4℃条件下12000r/min离心10min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612 g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水至500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

3）加蛋白酶K 3μL（20mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃条件下，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃条件下，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5 mL离心管中。

6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

7）4℃条件下，12000r/min离心10min，弃去上清液，用浓度为70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

8）4℃条件下，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

9）干燥后的DNA溶于80μL～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

10）在500μL的DNA溶液中加入10% SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

11）5℃条件下保温10h左右。

12）用苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合物和氯仿分别抽提一次，其中，苯酚、氯仿、异戊醇混合物和氯仿体积相等。

13）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

14）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

15）倒掉液体，用浓度70%的乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

（3）DNA池的构建

1）1%琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

2）OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（μg/mL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数

3）品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从西农萨能奶山羊190个个体、浓度为50ng/μL的DNA的样品中取5μL混合构建成DNA池；按照同样的方法构建布尔山羊、布尔与关中奶山羊杂交F1代和F2代的DNA池。

（4）PCR扩增引物设计

按照GenBank提供的GH基因序列（登录号：D00476）设计引物P1和引物P2。

引物P1如下：

上游引物1F：5'-TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT-3'；

下游引物1R：5'-CATCCTCCACTGCCATCCAACA-3' 

引物P2如下：

上游引物2F：5'-TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3'；

下游引物2R：5'-TCTAGGAAGGCACGGGGAGG-3'。

（5）PCR扩增山羊 GH基因外显子3和5

分别以3个山羊群体的DNA池为模版，利用引物P1和P2进行PCR扩增，反应条件及程序如下所示：

PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.5UTaq DNA聚合酶（北京天根科技有限公司），12.5μL2×Buffer（内含Mg²⁺、dNTPs等，北京天根科技有限公司 Mix），0.3μL的山羊基因组DNA样品，10pmol/μL引物P1和P2的上、下游引物各0.3μL，灭菌超纯水11.4μL。

PCR反应程序如下：

（1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸40 s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。

（2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸40 s，如此进行35个循环，最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。

（6）PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1和2所示，可以清楚看到利用引物P1和引物P2扩增的目的片段分别是320bp和302bp的条带，说明目的基因片段扩增成功；

然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃保温箱中数分钟，彻底晾干。

7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2 min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上以3个山羊群体DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰是发生了单核苷酸突变；位于山羊GH基因外显子3的第112bp、142bp和214bp位出现单核苷酸突变，其多态性分别为G\A、T\C和T\C，杂合型AC在214bp位的碱基是；山羊GH基因外显子5的第214bp和266bp位出现单核苷酸突变，其多态性分别为T\C和A\C；即筛查到山羊GH基因的5个SNP多态性。

 2、山羊 GH 基因5个SNPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

利用引物P1对3个山羊群体686份基因组DNA进行PCR扩增，获得686个包含山羊GH基因外显子3的DNA片段（包含3个碱基突变）；再利用引物P2对3个山羊群体686份基因组DNA进行PCR扩增，获得686个包含山羊GH基因外显子5的DNA片段（包含2个碱基突变）。然后利用如下方法对每个山羊的GH基因进行基因分型，具体方法如下：

取引物P1和引物P2的PCR产物各5μL，分别与5μL的变性缓冲液（95%的甲酰胺、0.5mol/L的EDTA、0.025%的二甲苯青FF和0.025%的溴酚蓝）混合，95℃变性10min，然后迅速放入冰水混合物中作用10min，最后点样于10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液中，在4℃的条件下，260V电泳10min，之后200V衡压条件下电泳4.5h。电泳结束后，加入0.1%的硝酸银溶液中，于摇床上轻摇10min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2次，加入显色液（5g的NaOH、0.1g的Na₂CO₃，加入0.5mL甲醛，定容至250mL），于摇床上轻摇15min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2，拍照保存（图3和图4）。

 3、不同基因型个体PCR产物的测序验证

将利用引物P1扩增的PCR产物的纯合基因型和杂合基因型个体各挑出10个送至上海生工进行正反向测序（图5）；同时，将利用引物P2扩增的PCR产物的纯合基因型和杂合基因型个体各挑出10个送至上海生工进行正反向测序（图6）。

 4、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋……＋N_Aan）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai 表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；3个羊群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率的统计分析结果如表1所示。

 5、群体平衡性检验

某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用皮尔逊                                                

统计量，其公式为：

其中，

为某一遗传位点基因型应有个数；

为基因型序号；

代表第个基因型的实际个体数量；

为样本数量；

代表第

个基因型的理论频率。

利用引物P1和P2扩增的山羊GH基因外显子3和外显子5个SNPs的基因型分布、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡如表1和表2所示，利用引物P1和P2扩增的山羊GH基因外显子3和外显子5连锁不平衡分析如表3所示。

表1：引物P1扩增的GH基因外显子3多态位点的基因频率、基因型频率和哈代温伯格平衡检验

表2：引物P2扩增的GH基因外显子5多态位点的基因频率、基因型频率和哈代温伯格平衡检验

表3：引物P1和P2扩增的山羊GH基因外显子3和外显子5连锁不平衡分析

由表1和表2可以看出，在引物P1和P2扩增的 GH基因外显子3和外显子5多态位点，3个山羊品种均处于哈代温伯格不平衡状态，且西农萨能奶山羊和布尔与关中奶山羊杂交F1代的杂合程度还比较高，也说明这两个山羊品种具有巨大的选种潜力。由表3可知，引物P1和P2扩增的 GH基因外显子3和外显子5的位点不存在连锁不平衡的关系（r²<0.03）。

 6、布尔山羊以及布尔与关中奶山羊F1和F1代基因效应的关联分析

生产数据：布尔山羊以及布尔与关中奶山羊F1和F1代（3月龄）的生长性状，包括：体重、体高、体长、胸围。

关联分析样本：有完整生长性状记录的布尔山羊168头、布尔与关中奶山羊杂交F1代136头以及布尔与关中奶山羊杂交F2代192头。

关联分析模型：

利用SPSS（13.0）软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影生长发育指标的因素不同，考虑到场效应（Farm）、品种效应（Breed）、种公畜效应（S）、种公畜内母畜间效应（SD）、年龄（Age）和性别效应（Sex）、基因型效应（Genotype）及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijklmnpq = μ+ Farm_i + Breed_j + S_p+SD_q+Age_k + Sex_l + Genotype_m +X_n＋e_ijklmnpq

其中：y_ijklmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应；Sex_l：性别效应；Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应，如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Sex，Farm×Genotype，Breed×Age，Breed×Sex，Breed×Genotype，Age×Sex，Age×Genotype，Sex×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijklmnpq：随机误差；运用SPSS（13.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生长性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表4和表5所示：

表4：引物P1扩增的GH基因外显子3基因型与布尔山羊及布尔与关中奶山羊杂交后代F1和F2代羊生长性状的相关分析

同一列中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)  

表5：引物P2扩增的GH基因外显子5基因型与布尔山羊及布尔与关中奶山羊杂交后代F1和F2代羊生长性状的相关分析

同一列中不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）

统计结果显示，引物P1扩增的GH基因外显子3与布尔山羊及布尔与关中奶山羊杂交后代F1和F2代的生长性状（3月龄）显著相关。特别是在布尔山羊及布尔与奶山羊杂交F1代山羊中，AB基因型山羊的生长性状显著高于AA和AC基因型山羊（P<0.05）；引物P2扩增的GH基因外显子5与布尔山羊及布尔与关中奶山羊杂交后代F1和F2代的生长性状（3月龄）也显著相关，在布尔山羊及布尔与奶山羊杂交F1代和F2代山羊中，EF基因型山羊的生长性状显著高于EE和EG基因型山羊（P<0.05），因此，利用引物P1和P2检测SNP位点可用作山羊生长性状早期选择的分子标记。

Claims (4)

1.一种检测山羊生长激素基因编码区5个碱基突变多态性的方法，其特征在于，该方法以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用两对引物P1和P2，在PCR条件下进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的片段大小，采用DNA测序技术筛查山羊生长激素基因编码区5个碱基的突变点，然后对生长激素基因的SNPs进行基因分型和基因频率分析，同时分析不同基因型与布尔山羊、布尔山羊和关中奶山羊的杂交后代3月龄的生长性状之间关系；

所述的两对引物P1和P2分别如下：

引物P1：

上游引物1F：5'-TAGAAATGGGGGTGTGTGGGGT-3'；

下游引物1R：5'-CATCCTCCACTGCCATCCAACA-3'；

引物P2：

上游引物2F：5'-TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3'；

下游引物2R：5'-TCTAGGAAGGCACGGGGAGG-3'。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：

25μL反应体系：包括0.5U Taq DNA聚合酶，12.5μL 2×Buffer，0.3μL的山羊基因组DNA样品，10 pmol/μL引物P1和P2的上、下游引物各0.3μL和灭菌超纯水11.4μL；

PCR反应程序如下：

（1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，得到扩增片段，4℃保存；

（2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，得到扩增片段，4℃保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的山羊生长激素基因编码区5个碱基突变点分别位于山羊生长激素基因外显子3的第112bp、第142bp、第214bp以及山羊生长激素基因外显子4的第214bp和第266bp。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生长激素基因的SNPs基因分型是用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析利用引物P1扩增的PCR产物，结果如下：纯合型AA在第112bp、第142bp和第214bp位的碱基是A、C和C，杂合型AB在第112bp和第142bp位的碱基是G\A和T\C，杂合型AC在第214bp位的碱基是T\C；同样用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析利用引物P2扩增的PCR产物，结果如下：纯合型EE在第214bp和第266bp位的碱基是C和C，杂合型EF在第214bp位的碱基是T\C，杂合型EG在第266bp位的碱基是A\C。

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