CN101962684B

CN101962684B - 黄牛pcsk1基因的单核苷酸多态性及其检测方法

Info

Publication number: CN101962684B
Application number: CN2010105315654A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 单俐敏; 张春雷; 房兴堂; 汪琴
Original assignee: Xuzhou Normal University
Current assignee: Xuzhou Normal University
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2030-11-04
Also published as: CN101962684A

Abstract

本发明公开了黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括：以包含PCSK1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PCSK1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSK1基因第44686bp的碱基多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的分子遗传标记，以用于黄牛的辅助选择和分子育种，加快黄牛良种繁育速度。

Description

黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及三种黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

黄牛是我国的主要的畜牧之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、祖代及其它亲属在小的动物模型中的遗传信息，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，每个基因对性状有相对较小的贡献，因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，新的方法正在不断涌现，已定位的标记基因数目与日俱增。这将为数量遗传学提供分子水平信息，家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加黄牛的产肉量和改善肉品质的先进的有效的方法。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。

目前，主要采用几种不同的方法来发现SNPs:DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)等。在这些SNP检测技术中，(1)DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；(2)PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；(3)AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；(4)TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)都是在荧光能量转移(FluorescenceResornance Energ Transfer，FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(Pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术。(5)RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

PCSKs是一类丝氨酸蛋白酶，负责许多激素原和神经肽前体的剪切和成熟。到目前为止，已经发现9种PCSKs包括PCSK1(PC1/3，PC1)，PCSK2(PC2)，PCSK3(furin)，PCSK4(PC4)，PCSK5(PC5/6)，PCSK6(PACE4)，PCSK7(PC7/8)，PCSK8(SKI)，PCSK9(NARC-1)。其中前7种PCs在碱性氨基酸末端分开，且这些碱性氨基酸具有一致序列Arg/Lys/His-X-X/Lys/Arg-Arg，它的下游X表示除Cys外的任何氨基酸，后两种PCs在非基本氨基酸末端分开。大量研究显示PCs在健康和疾病如肿瘤发生，肥胖症，糖尿病，病毒感染，细菌致病机理，动脉粥样硬化和神经退行性变疾病中发挥不同的作用。

PCSK1的转录物最初是在神经内分泌细胞中发现的，PCSK1能生成一种前蛋白转化酶，它可激活人体内控制食欲的胰岛素、胰高血糖素以及令人产生饱胀感的阿黑皮素原(POMC)等。PCSK1大量存在于脑垂体的垂体前叶(AL)中，PCSK2存在于神经中叶(NIL).PCSK1和PCSK2共同参与POMC的激活过程。在AL中POMC被转化成ACTH(促肾上腺皮质激素)和β-LPR(β-促脂肪动用激素)，在NIL中ACTH被进一步转化为α-MSH(α-促黑色素细胞激素)和CLIP(中间叶促皮质样态)，β-LPR进一步转化为β-MSH(β-促黑色素细胞激素)和β-END(β-内啡肽)。为此，PCSK1基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对生长发育性状具有重要的作用。

关于动物PCSK1基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而少见黄牛PCSK1基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前黄牛PCSK1基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：生长发育性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供黄牛PCSK1基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，寻找与黄牛经济性状相关的SNP作为分子标记，加快黄牛良种繁育速度。

本发明通过以下技术方案来实现：

三种黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：

黄牛PCSK1基因第44686位为T或G的单核苷酸多态性。

上述黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性的检测方法为：

以包含PCSK1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PCSK1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSK1基因第44686位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物P1：TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21；

下游引物P2：ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结PCSK1基因第44686位的碱基多态性为：TT型表现：203bp和103bp；TG型表现：306bp、203bp和103bp；GG型表现：306bp。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与黄牛生长发育相关的功能基因PCSK1的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明对PCSK1基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与三种黄牛体尺性状之间进行了性状关联分析；结果显示PCSK1基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

本发明提供的检测方法为PCSK1基因的SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛血样基因组DNA电泳检测图；

图2为黄牛PCSK1基因第14外显子及侧翼区306bp克隆测序PCR产物电泳图；

图3为黄牛PCSK1基因第14外显子及侧翼区306bp PCR产物的HinfI酶切电泳检测PCSK1基因多态性的电泳结果图；泳道1，3，4，6：GG基因型个体(306bp)；泳道2、7：TG基因型个体(306bp，203bp，103bp)；泳道5：TT基因型个体(203bp，103bp)；M：Marker(622bp，pBR322DNA/Msp I Markers)。

图4为黄牛PCSK1基因SNP的不同基因型测序峰图。

具体实施方式

本发明以PCSK1基因保守序列设计引物扩增PCSK1基因第14外显子及侧翼区306bp片段，分别以三种黄牛品种的基因组为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得PCSK1基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。

a、黄牛PCSK1基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、黄牛血样的采集及处理

取黄牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本实施例采用了3个黄牛品种，具体如表1所示。

表1奶山羊样品来源表

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

(11)5℃保温10h左右；

(12)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

(15)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA质量(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从鲁西牛品种50个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建秦川牛和郏县牛品种DNA池。

黄牛血样基因组DNA、组织样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出黄牛基因组DNA的质量非常高。

4、克隆测序PCR扩增引物设计

由于牛PCSK1基因的序列已知，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得牛的GenBank登录号为：NC-007305.4的PCSK1基因DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用Primer 5.0设计黄牛PCSK1基因第14外显子及侧翼区306bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物P1：TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21；

下游引物P2：ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。

5、PCR克隆黄牛PCSK1基因

分别以3个黄牛品种的DNA池为模版，用设计的克隆测序引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。

表2PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		10×PCR缓冲液(MBI)	2.5
MgCl₂(25mmol/L)	1.5
		dNTPs(2.5mmol/L)	2.5
上游引物(10pmol/L)	0.25
		下游引物(10pmol/L)	0.25
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	2.0
		DNA模板(50ng/μL)	1.0
灭菌超纯水(H₂O)	15.0
		总体积	25.0

表3PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到306bp的条带，说明目的基因克隆成功；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上三个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。黄牛PCSK1基因目的片段306bp的测序结果如SEQ IDNO.1所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于黄牛PCSK1基因的第44686位出现了T、G两种检测结果，即为筛查到的黄牛PCSK1基因的SNP多态性，该位点是为T或G的碱基多态性。

b、黄牛PCSK1基因T＞G突变多态性的RFLP-PCR检测

当黄牛的PCSK1基因第44686位发生T＞G突变时，即T突变为G，利用引物扩增的PCSK1基因序列gactc也相应地变成gacgc，从而成为HinfI的限制性内切酶识别位点，由于筛查到的碱基多态性能被HinfI限制性内切酶识别，所以直接用HinfI酶对目的片段进行酶切，最后进行基因分型。

3、PCR扩增产物的HinfI酶切

(1)20μL HinfI酶切反应体系：10μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，HinfI(10U/μL)为1.0μL，8.0μL灭菌纯水(H₂O)；

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化过夜。

(3)HinfI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

用12.0％的聚丙烯酰胺凝胶，180V电压电泳35分钟，染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；

由于RFLP-PCR扩增的306bp片段中不包含其它的HinfI酶切识别位点，当PCSK1基因第5001位发生T＞G突变时，PCR扩增的PCSK1基因产物被限制性内切酶HinfI识别后，在g/actc对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当PCSK1基因第44686位没有发生突变，不能形成新的限制性内切酶HinfI酶切识别位点，扩增片段不能被酶切；

由于黄牛为2倍体动物，所以当发生T＞G的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为TT、TG、GG，其RFLP-PCR检测的凝胶结果图如图3所示：

其中，TT基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点均能被HinfI酶切，表现为306bp条带；发生突变后的野生型GG的两条链的SNP位点均能被酶切，表现为203bp和103bp条带；杂合子TG的两条链中的一条的SNP位点能够被识别而另一条不能被识别，表现为306bp，203bp和103bp条带；根据条带的个数和条带的大小，如3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含306bp、203bp和103bp条带的杂合子TG基因型个体其第44686位的测序图的确表示为T或G，如图4所示。

c、黄牛的HinfI基因第44686位的SNP作为分子标记在不同黄牛群体多态性中的应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对鲁西牛65份DNA样品、秦川牛116份DNA样品、郏县牛374份DNA样品，分别进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率以及与性状的关联情况。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4黄牛PCSK1基因第44686位SNP基因频率分布表

3、基因效应的关联分析

基因型数据：HinfI识别的基因型(TT、TG和GG)

生产数据：体尺数据(体长、体高、胸围、体重)

关联分析模型：

利用SPSS(17.0)软件分析基因位点、公畜、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Age_m+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F₁场别效应；S_j为种公畜效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(17.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表5)：对于HinfI可识别的第44686位的SNP位点，TG基因型为优势基因型；对于体重，TG基因型个体的数值均显著高于GG基因型个体，这说明TG基因型可以成为一个提高黄牛体重育种速度的分子遗传标记。

表5HinfI多态位点与秦川牛体尺之间的方差分析

注：字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性序列，其特征在于，所述黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性序列包括：

黄牛PCSK1基因第44686位为T或G的单核苷酸多态性序列。

2.黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含PCSK1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PCSK1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSK1基因第44686位的单核苷酸多态性为：TT型表现：203bp和103bp；TG型表现：306bp、203bp和103bp；GG型表现：306bp；

所述的引物对P为：

上游引物P1：TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21；

下游引物P2：ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。

3.如权利要求2所述的黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

4.如权利要求2所述的黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12％。