CN102206705B - 一种检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法，以包含Angptl6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(包含P1和P2)为引物，用PCR法扩增黄牛Angptl6基因，然后用限制性内切酶ScaI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Angptl6基因(GenBank Accession number：NW_003104015)第2359位的单核苷酸多态性。由于Angptl6基因功能对生长发育性状具有重要生物学功能，本发明提供的检测方法为Angptl6基因的SNP与生长性状关联的建立奠定了基础。本发明还发现，Angptl6基因单核苷酸多态性对体长指数有显著影响，故本发明提供的检测方法可用于中国黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛Angptl6基因第2359位单核苷酸多态性的方法。

背景技术

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变异。SNP是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种的选育。在肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状有密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得较大的研究进展。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，利用PCR-RFLP法可能是当前检测SNP最理想的遗传标记方法。

血管生成素样蛋白(Angiopoietin-like proteins，Angptls)是一类既与血管生成有关，又与脂类代谢、葡萄糖代谢和胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子，先后发现了该家族的7个成员，分别为Angptl1-7。Angptl6也称为血管生成素相关生长因子(Angiopoietin-related growth factor，AGF)或血管生成素相关蛋白5(angiopoietin-related protein 5，ARP5)，是通过筛选血管生成素类似物的表达序列标签(EST)库而被克隆的。目前，有大量的研究证明Angptl6是能量代谢和肥胖症强有力的调制器，在促进生长发育、能量消耗和减少脂肪量方面发挥着重要的作用。

然而，Angptl6基因的研究绝大多数是在人和小鼠等模型动物上进行，在牛上的研究尚无报道。中国地方黄牛Angptl6基因遗传变异的研究仍是空白。因此，该基因的功能研究及其遗传变异与生长性状指标(如：体重、日增重、体高、体长指数等)关联的研究，可为进一步改良我国地方黄牛品种提供理论基础。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种检测的黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法，以包含Angptl6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl6基因；用限制性内切酶ScaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Angptl6基因第2359位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

P1(上游引物)：5′-ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3′    19bp

P2(下游引物)：5′-ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3′     18bp

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为2％琼脂糖凝胶电泳。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Angptl6基因第2359位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为731bp一条带；TC基因型表现为731bp、481bp、250bp三条带；TT基因型表现为481bp和250bp两条带。

与现有技术相比，本发明具有以下独特的技术效果：

本发明根据已公布牛Angptl6基因(NCBI：NW_003104015)的序列设计引物，分别以4种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛Angptl6基因的部分序列与NCBI公布的序列(NCBI：NW_003104015)进行比较，发现在Angptl6基因的第2359位存在SNP多态性。

针对上述第2359位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，用特定的限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性：

PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGTACT时，其能被限制性内切酶ScaI识别；当上述该位点发生T＞C突变时，PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGCACT，此时不能被限制性内切酶ScaI所识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

由于Angptl6基因功能涉及初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状以及体长指数、体躯指数、胸围指数等生长指标，本发明提供的检测方法为Angptl6基因的SNP与黄牛部分生长性状(体高、体重和体长等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛早期体长指数的分子标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛血样基因组DNA电泳检测图；

图2为黄牛Angptl6基因包含第2359位的多态位点的731bp PCR产物电泳检测图；其中，泳道1、2、3为Angptl6基因包含第2359位的多态位点的731bp片段的琼脂糖电泳检测图；泳道M为Marker D2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

图3为黄牛Angptl6基因包含第2359位的多态位点的731bp PCR产物的ScaI酶切电泳检测图(2.0％琼脂糖凝胶电泳)；其中，泳道1：未进行酶切消化的PCR产物(731bp)；泳道3：CC基因型个体(731bp)；泳道4：TT基因型个体(481bp，250bp)；泳道5：TC基因型个体(731bp，481bp，250bp)；M：D2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

图4为黄牛Angptl6基因SNP的不同基因型测序图。(图4a、4b和4c分别为基因型TC、TT、CC的测序图，a表现为双峰，而b和c均为单峰；NNNNNN为酶切识别位点，其中TT基因型的AGTACT序列(如图4b)能被限制性内切酶Sca I切断，而CC基因型的AGCACT序列(如图4c)不能被限制性内切酶Sca I切断；

代表Angptl6基因第2359bp处T＞A的突变，

代表Angptl6基因第2359bp处为纯合基因型TT，代表Angptl6基因第2359bp处为纯合基因型CC)。

图5是黄牛Angptl6基因第2内含子DNA序列的Sca I酶切分析图，以Sca I PCR-RFLP方法检测黄牛Angptl6基因第2内含子SNP(NW_003104015：g.2359T＞C)，图中有三条序列，其中NW_003104015_g.Angptl6代表牛Angptl6基因DNA部分序列，g.Angptl6intron2TT代表以所述引物扩增得到的基因型为TT的片段序列，g.Angptl6intron2CC代表以所述引物扩增得到的基因型为CC时的片段序列；

带方框的碱基序列，分别为上游和下游引物序列；AGTACT：为Sca I酶切位点；*：代表相同碱基；第2359位方框下的碱基代表突变NW_003104015：g.2359T＞C。

具体实施方式

本发明通过对黄牛Angptl6基因第2359位突变的单核苷酸多态性进行检测，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。下面结合具体样本的检测和性状关联对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、以下实施例中所用的主要试剂来源

1、生化试剂与生物学试剂

①Taq DNA聚合酶(购自北京天根生化科技有限公司)；

②2×buffer<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>(北京天根生化科技有限公司Mix)

③限制性内切酶Sca I(购自TAKARA公司)；

④蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；

⑤Marker D2000：购自北京天根生化科技有限公司；

2.普通试剂

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

(1)样品采集所用溶液

抗凝剂ACD：柠檬酸2.4g；柠檬酸三钠6.6g；葡萄糖7.35g，定容至50mL ddH₂O中，高压灭菌。每10mL新鲜血液中加入0.2mL的ACD液。这一抗凝剂优于肝素，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-70℃长期保存。

(2)血样基因组DNA分离所用溶液

①PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌。

②10％SDS：10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。

③0.5mol/L EDTA：EDTA 186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

④1mol/L Tris·Cl：121.14g Tris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。

⑤5mol/L NaCl：NaCl 292.2g溶于1000mL超纯水中。

⑥DNA抽提缓冲液：0.5mmol/L EDTA 40mL，1mmol/L Tris·Cl 10mL。

⑦5mmol/L NaCl 4mL，10％SDS 10mL定容至100mL。实际浓度为200mmol/L EDTA，pH 8.0：100mmol/L Tris·HCl，pH 8.0，200mmol/L NaCl，2％SDS。RNase 20μg/mL。

⑧NaAc缓冲液：NaAc·3H₂O 20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。

⑨TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液(pH 8.0)10mmol/L，EDTA缓冲液(pH 8.0)0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存。

⑩蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。

(3)琼脂糖电泳分析所用溶液

①1×TBE缓冲液：取10×TBE 100mL定容至1000mL。

②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

b、黄牛Angptl6基因PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NW_003104015.1，Region：153780-157580)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛Angptl6基因第2359bp区域的PCR引物，其引物序列如下：

P1(上游引物)：5′-ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3′    19bp

P2(下游引物)：5′-ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3′     18bp

用以上所述引物对黄牛基因组进行PCR扩增，能够扩增包含黄牛Angptl6基因(NW_003104015.1序列)第1879bp～2609bp的731bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图2所示，其中，泳道1～3为检测片段，泳道M为Marker D2000；对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第2321bp～2380bp的序列为如下所示：

TTGGGGCTTTTATCCTGGAGAGGGAATAAGAGAAGCAG

ACTTCTATTCT GGTGAGGGGA；

经过分析，发现Angptl6基因第2359位存在SNP多态性。

PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGTACT时，其能被限制性内切酶ScaI识别；当上述该位点发生T＞C突变时，PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGCACT，此时不能被限制性内切酶ScaI所识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

c、以引物对P进行PCR扩增待测黄牛Angptl6基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以4个中国地方黄牛品种共计856个个体作为检测对象，具体采集样本见表1：陕西秦川牛(QC，207头)，河南平顶山市郏县红牛(JX，232头)，河南南阳牛(NY，189头)，吉林省草原红牛(CY，228头)。

表1黄牛样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，紫外分光光度计测其浓度，然后稀释至50ng/μL，0.8％的琼脂糖凝胶进行检测，结果见图1。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1.5mL离心管中，混匀后瞬时离心，分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

12.5μL反应体系包括0.25U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 6.25μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含Angptl6基因的黄牛基因组DNA 0.40μL，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL；

PCR反应程序：

对4个黄牛品种的856个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得856个个体的黄牛Angptl6基因中包含该SNP位点的731bp的DNA片段。

d、ScaI酶切消化PCR扩增的Angptl6基因片段

1、ScaI酶切反应消化体系(25μL)：8μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.0μL，ScaI(10U/μL)0.3μL，灭菌超纯水(H₂O)9.7μL。

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

e、ScaI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作2.0％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳40min，电泳结束后EB染色；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：

PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGTACT时，其能被限制性内切酶ScaI识别；当上述该位点发生突变时，PCR扩增Angptl6基因产物的第2357bp～2362bp序列为AGCACT，此时不能被限制性内切酶ScaI所识别，即该扩增片段不能被切割；

因此，黄牛基因组的Angptl6基因第2359位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

CC基因型表现为731bp一条带；TC基因型表现为731bp、481bp、250bp三条带；TT基因型表现为481bp和250bp两条带。

如图3所示的酶切后的凝胶电泳检测结果，其中，泳道1：未进行酶切消化的PCR产物(731bp)；泳道3：CC基因型个体(731bp)；泳道4：TT基因型个体(481bp，250bp)；泳道5：TC基因型个体(731bp，481bp，250bp)；M：D2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含731bp、481bp和250bp条带的杂合子TC基因型个体其2359位的测序图的确表示为T或C，如图4a所示，自左向右第15个峰为两个峰，而TT、CC基因型分别为T和C，测序峰图为单一峰，如图4b、4c所示。

f、黄牛Angptl6基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+......+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，al-an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_T＝(2N_TT+N_TC)/2N

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C等位基因的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

如表3所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种Angptl6基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在72.5％～79.8％，C等位基因频率变化幅度在20.2％～27.5％之间。符合等位基因频率大于1.0％的SNP的定义，故本位点为单核苷酸多态位点。

表3黄牛Angptl6基因第2359bp SNP位点的ScaI PCR-RFLP的频率分布表

g、黄牛Angptl6基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：ScaI识别的基因型(TT、TC和CC)

生产数据：南阳牛初生重，以及6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽、日增重、体躯指数、体长指数和胸围指数。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(18.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表4)：在6月龄CC基因型的个体体长指数均显著高于TC和TT基因型个体(P＜0.05)；而在0日龄和12、18、24月龄三种基因型个体的体长指数差异不显著(P＞0.05)。说明CC基因型可以作为一个提高黄牛早期体长指数的候选分子遗传标记。

表4Angptl6基因第2359位多态位点与南阳牛初生重及各月龄生产指标间的方差分析

注：数字肩部具有相同字母者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。

Claims (3)

1.一种检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Angptl6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，PCR法扩增黄牛Angptl6基因；用限制性内切酶ScaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Angptl6基因第2359位的单核苷酸多态性；

所述的引物对为：

上游引物P1：5′-ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3′19nt

下游引物P2：5′-ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3′18nt；

所述黄牛Angptl6基因第2359位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为731bp一条带；TC基因型表现为731bp、481bp、250bp三条带；TT基因型表现为481bp和250bp两条带；

所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，30～35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

2.如权利要求1所述的检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳。

3.权利要求1或2所述的检测黄牛Angptl6基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的应用，黄牛Angptl6基因第2359位SNP作为黄牛生长性状的分子标记辅助选择，CC基因型作为一个提高黄牛早期体长指数的候选分子遗传标记。

Images