CN103789407A - 一种快速检测黄牛apoa2基因多态性的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测中国地方黄牛APOA2基因序列突变的PCR-RFLP的方法，以包含APOA2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增牛APOA2基因，发现3个突变位点；针对这3个突变位点，设计3对引物PR1、PR2和PR1，分别利用Bmgt120Ⅰ，HindⅢ和HaeⅢ三种限制性内切酶酶切PCR产物，然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定黄牛APOA2基因3个突变位点的多态性。因此，本发明为中国地方黄牛生长性状的标记辅助选择（MAS）育种提供了一种在DNA水平筛查和鉴定与黄牛生长性状密切相关基因多态性的方法，有利于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种快速检测黄牛APOA2基因多态性的方法及应用
技术领域
本发明属于动物分子育种领域，涉及一种检测黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G多态性的方法，及其在肉牛生长性状的标记辅助选择（MAS）育种中快速建立遗传资源优良的黄牛种群的应用。 
背景技术
在黄牛生长发育性状的MAS育种中，研究DNA标记与目标性状之间的关系，有两种基本方法：候选基因分析和连锁标记分析。在动物研究中，候选基因分析比连锁标记分析更易操作，且不需要进行特意实验设计、费用低、统计功效强，被广泛采用，适用于任何可取得基因型和表型数据的群体。该方法通过统计方法建立相应的数学模型，从而确定该候选基因与未知基因的关系或效应。一般而言，候选基因通常是一些与研究性状生长发育过程有关的基因，可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。 
PCR-RFLP方法是一种简单快速检测基因突变多态性的有效技术。利用测序技术发现序列突变后，根据序列特征选择合适的酶切位点或设计合适的引物人工引入酶切位点，经PCR后，用对应的限制性内切酶酶切PCR产物，然后直接用琼脂糖凝胶电泳检测。此方法不仅准确度高，又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。 
在本发明中，APOA2基因符合黄牛生长发育性状候选基因的要求。高密度载脂蛋白是血清中重要的组成部分，在脂质的运输和脂质代谢过程中发 挥着不可或缺的作用。APOA2作为高密度载脂蛋白第二个主要的组成部分，调节着高密度载脂蛋白的稳定和结构。研究表明APOA2的代谢决定着高密度载脂蛋白在血清中的浓度，并且其可以作为与高密度载脂蛋白受体特异结合的信号分子。在人的研究中，APOA2基因被当做是2型糖尿病的候选基因。2型糖尿病主要是由过度肥胖或者食用大量的高能量食物引起的。因此，APOA2基因可能是影响肥胖或与肥胖相关的其它性状的候选基因。在小鼠的研究中，过表达APOA2基因的小鼠中甘油三酯分解代谢受阻并增加了脂肪的沉积，敲除APOA2基因的小鼠降低了甘油三酯的合成代谢。因此，分析APOA2基因遗传变异特别是多态位点与黄牛生长性状的关联程度，对培育具有优良性状的肉牛品种具有重要的理论指导意义。 
国内外未见关于牛APOA2基因的遗传变异研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状（如体重等）关联研究仍是空白。由于APOA2基因功能涉及多种黄牛生长性状，本发明提供的检测方法为APOA2基因多态位点与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。 
主要参考文献 
Allayee,H.,L.W.Castellani,R.M.Cantor,T.W.de Bruin,and A.J.Lusis.2003.Biochemical and genetic association of plasma apolipoprotein A-II levels with familial combined hyperlipidemia.Circulation research.92:1262-1267. 
Blanco-Vaca,F.,J.M.Martín-Campos,and J.Julve.2001.Role of apoA-II in lipid metabolism and atherosclerosis:advances in the study of an enigmatic protein.Journal of lipid research.42:1727-1739. 
Boucher,J.,T.A.Ramsamy,S.Braschi,D.Sahoo,T.A.Neville,and D.L.Sparks.2004. Apolipoprotein A-II regulates HDL stability and affects hepatic lipase association and activity.Journal of lipid research.45:849-858. 
Corella,D.,G.Peloso,D.K.Arnett,S.Demissie,L.A.Cupples,K.Tucker,C.-Q.Lai,L.D.Parnell,O.Coltell,and Y.-C.Lee.2009.APOA2,Dietary Fat and Body Mass Index:Replication of a Gene-Diet Interaction in Three Independent Populations.Archives of internal medicine.169:1897. 
Corella,D.,E.S.Tai,J.V.Sorlí,S.K.Chew,O.Coltell,M.Sotos-Prieto,A.García-Rios,R.Estruch,and J.M.Ordovas.2010.Association between the APOA2promoter polymorphism and body weight in Mediterranean and Asian populations:replication of a gene–saturated fat interaction.International journal of obesity.35:666-675. 
Dugué-Pujol,S.,X.Rousset,D.Chateau,D.Pastier,C.Klein,J.Demeurie,C.Cywiner-Golenzer,M.Chabert,P.Verroust,and J.Chambaz.2007.Apolipoprotein A-II is catabolized in the kidney as a function of its plasma concentration.Journal of lipid research.48:2151-2161. 
Konsta,D.,C.Guillaume,M.Michel,and T.Jean.Evaluating the association of common APOA2variants with type2diabetes. 
Mehta,R.,D.L.Gantz,and O.Gursky.2003.Human plasma high-density lipoproteins are stabilized by kinetic factors.Journal of molecular biology.328:183-192. 
发明内容
本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查中国地方黄牛APOA2基因的多态性，寻找与黄牛相关的突变作为分子标记，从而提供一种快速检测APOA2基因多态性的方法，以此作为黄牛标记辅助选择的分子标记，为中国黄牛品种的改良提供一定的指导作用。 
本发明是通过以下技术方案来实现： 
一种检测黄牛APOA2基因多态性的方法，以包含APOA2基因的待测黄 牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛APOA2基因,经测序发现3个突变位点；针对这3个位点设计3对引物PR1、PR2和PR1，分别利用Bmgt120Ⅰ，HindⅢ和HaeⅢ三种限制性内切酶酶切PCR产物，根据琼脂糖凝胶电泳鉴定黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G三个突变位点的多态性。 
所述的引物对P为： 
上游引物：5'-CTCCTCCAAAGTCCTTATCACC-3' 
下游引物：5'-GCAGGCTCACAACTTAACTCC-3’。 
P：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s；72℃延伸10min。 
所述的引物对PR1为： 
上游引物：5'-AATCCCAAGGAGGAGAAGGTGGCC-3' 
下游引物：5'-ATTCAGCCTCAGCTCTCAGCCCT-3’。 
PR1：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。 
所述的引物对PR2为： 
上游引物：5'-CACTTTCCCTGCCGTTAA-3' 
下游引物：5'-TTTCTGGGCTTTAGAGAGGGGAAG-3’。 
PR2：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。 
所述的引物对PR1为： 
上游引物：5'-CCTTGAAGGTGGGTGTGA-3' 
下游引物：5'-CAGGCTCTGCAGATTCGACTCC-3’。 
PR3：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。 
所述的检测AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G位点多态性的琼脂糖凝胶浓度均为3%。AC_000160.1g.360T>G位点多态性为：CC基因型表现为144bp条带和22bp条带，CT基因型表现为166bp条带、144bp条带和22bp条带，TT基因型表现为166bp条带；AC_000160.1g.424G>C位点多态性为：GG基因型表现为171bp条带和26bp条带，GT基因型表现为197bp条带、171bp条带和26bp条带，TT基因型表现为197bp条带；AC_000160.1g.540A>G位点多态性为：GG基因型表现为288bp条带和26bp条带；AG基因型表现为314bp条带，288bp条带和26b p条带；AA基因型表现为314bp条带。 
与现有技术相比，本发明把DNA池测序技术和PCR-RFLP技术相结合起来大大降低了SSCP技术的法所和不稳定性，这种方法能够简单、快速、低成本、精确的检测各突变位点的多态性。 
本发明根据APOA2基因的序列设计引物，分别以5个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛APOA2基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现存在三个单核苷酸突变：AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G。针对上述APOA2基因三个突变位点，本发明公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物进行PCR扩增，然后用特定的限制性内切酶酶切PCR产物并用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。 
本发明对APOA2基因三个多态位点进行了基因频率分析，并对三个位点与南阳牛的生长性状进行关联分析，结果表明该位点可以作为南阳牛生长性状的分子标记。 
附图说明
图1为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G位点各基因型个体的测序图，依次为GG基因型、GT基因型和TT基因型。 
图2为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.424G>C位点各基因型个体的测序图，依次为CC基因型、CG基因型和GG基因型。 
图3为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.540A>G位点各基因型个体的测序图，依次为AA基因型、AG基因型和GG基因型。 
图4为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G位点PR1扩增经酶切后琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为Marker I（分别是由上及下为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp）。 
图5为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.424G>C位点PR2扩增经酶切后琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为Marker I。 
图6为黄牛APOA2基因AC_000160.1g.540A>G位点PR3扩增经酶切后琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为Marker I。 
具体实施方案
本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G三个位点多态性进行检测， 下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定的。 
一、黄牛APOA2基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测 
1、血液样品采集 
本发明具体以4个中国地方黄牛品种共计1021头黄牛个体为检测对象， 
具体采集样本见表1： 
表1样本采集信息表 
品种 样本数 样品来源 采样方式
南阳牛 225 河南省南阳市黄牛良种繁育场 颈静脉采血
秦川牛 246 陕西省秦川牛良种繁育中心 颈静脉采血
郏县红牛 415 河南省平顶山市郏县红牛繁育中心及各村镇 颈静脉采血
草原红牛 135 吉林省通榆县三家子草原红牛保种场 颈静脉采血
2、血样基因组DNA的提取及纯化 
（1）、冷冻血样在室温下解冻后，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS溶液，充分混匀，12000r/min,4℃,离心10min,弃去上清，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色； 
（2）、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动混匀，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，在37℃水浴1h; 
（3）、加3μL（20mg/mL）蛋白酶K混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，补加1μL蛋白酶K混匀后继续消化至澄清； 
（4）、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，轻轻摇动离心管20min，充分混匀；4℃，12000r/min离心10min,将上清液转入另一个1.5mL离心管中，重复一次； 
（5）、加入500μL氯仿，充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将 上清转入另一1.5mL离心管中； 
（6）、加入500μL氯仿和异戊醇混合液（24:1），充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清转入另一1.5mL离心管中； 
（7）、加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min； 
（8）、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清，70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次； 
（9）、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清，室温下使乙醇挥发干净； 
（10）将干燥后的DNA溶于80～100μL的TE溶液，4℃保存直至DNA完全溶解，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存； 
（11）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其最终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL,5℃保温10h左右； 
(12)用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇（25：24:1）和氯仿分别抽提一次； 
（13）、4℃，12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中； 
（14）、加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA； 
（15）、轻轻倒掉液体，用70%乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，检测后4℃储存。 
3、DNA池的构建 
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，DNA浓度（ng/μL）=50×OD260值×稀释倍数。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取 出一定的量稀释至50ng/μL，然后从5个黄牛群体中随机选择100个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建DNA池。 
4、扩增引物设计 
（1）黄牛APOA2基因PCR引物的设计 
从NCBI上获得已公布的牛(AC_000164.1)序列，利用Primer5.0软件设计能够扩增包含APOA2基因所有外显子和内含子的PCR引物，其引物对P序列如下： 
上游引物：5'-CTCCTCCAAAGTCCTTATCACC-3' 
下游引物：5'-GCAGGCTCACAACTTAACTCC-3’。 
5、PCR扩增 
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需要的各种组分的数量和1次反映所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，然后分装到0.2mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，轻轻吹打混匀后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2。 
表2PCR反应体系 
体系成分 体积
灭菌超纯水（ddH2O） 10.80
2×Buffer(内含Mg2+、dNTPs等) 12.50
上游引物（10pmol/L） 0.50
下游引物（10pmol/L） 0.50
TaqDNA聚合酶（2.5U/μL） 0.25
DNA模板（50ng/μL） 0.45
总体积 25.00
PCR反应程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸1min30s；72℃延伸5min。 
将用以上混合的DNA池为模板的PCR产物送南京金斯瑞有限公司进行双向测序。对黄牛APOA2基因目的片段1349bp测序峰图进行分析，其中在AC_000160.1g.360、g.424和g.540位置发现峰图均为双峰，经过序列分析，初步判定为黄牛APOA2基因的突变位点。 
6、基因型分型引物设计 
（1）对于AC_000160.1g.360T>G位点，设计引物PR1，其中PR1上游引物：TCCCAAGGAGGAGAAGGTG
Figure BDA0000390336520000102
CC，方框中AA和G碱基为引入错配，引入AA错配碱基为避免Bmgt120Ⅰ酶切，引入G错配碱基为引入Bmgt120Ⅰ酶切位点。若酶切成功，CC基因型表现为144bp条带和22bp条带，CT基因型表现为166bp条带、144bp条带和22bp条带，TT基因型表现为166bp条带。 
（2）对于AC_000160.1g.424G>C位点，设计引物PR2，其中PR1上游引物：TTTCTGGGCTTTAGAGAGGGGA
Figure BDA0000390336520000103
G，方框中A碱基为HindⅢ酶切位点。若酶切成功，GG基因型表现为171bp条带和26bp条带，GT基因型表现为197bp条带、171bp条带和26bp条带，TT基因型表现为197bp条带。 
（3）对于AC_000160.1g.424G>C位点，设计引物PR3，对多态位点选择用HaeⅢ酶切。若酶切成功，GG基因型表现为288bp条带和26bp条带；AG基因型表现为314bp条带，288bp条带和26bp条带；AA基因型表现为314bp条带。 
7、PR1、PR2和PR3引物对PCR扩增和PCR产物酶切 
对于PR1、PR2和PR3引物分别按照表2反应体系进行加样，并分别在PCR仪中扩增，PR1扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min；PR2扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min；PR3扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。对PCR产物分别进行Bmgt120Ⅰ、HindⅢ和HaeⅢ酶切。酶切体系为20μL，包括1μL（10U）限制性内切酶、2μL Buffer、10μL PCR扩增产物和7μL双蒸水。酶切条件为：37℃消化5-10h。 
8、琼脂糖凝胶电泳检测样本个体基因型 
分别在120V电压下用0.3%琼脂糖凝胶检测PCR产物酶切结果。经EB染色后，用BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统进行照相分析，根据之前引物设计的判型规则判断各个个体基因型。 
9、不同基因型个体PCR产物测序验证 
随机抽取所述的多态位点的不同基因型个体PCR产物，利用ABI377和ABI3730测序仪进行正反向测序验证，结果显示基因型判断正确。 
二、黄牛APOA2基因3个多态位点的频率统计以及生长型关联分析 
1、基因和基因型频率 
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA= （2NAA＋NAa1＋NAa2＋……＋NAan）/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。 
表3 4个黄牛品种中APOA2基因3个多态位点位点的基因型和等位基因频率 
Figure BDA0000390336520000121
从上表可以看出，4个黄牛品种的3个突变位点各等位基因频率均大于1.00％，符合SNP的定义标准。因此，本发明首次成功利用PCR-RFLP方法快速检测出黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G位点的多态性。 
2、基因效应的关联分析 
（1）基因型数据：AC_000160.1g.360T>G位点的TT和CT基因型；AC_000160.1g.424G>C位点的TT和GG基因型；AC_000160.1g.540A>G位点的GG和CG基因型。 
（2）生产数据：南阳牛出生体重以及6月龄、12月龄、18月龄、24月龄 的各种生长性状（包括体重、体高、体斜长、胸围和坐骨髋宽）。 
关联分析模型： 
利用SPSS（16.0）软件分析基因位点的各种基因型和各种年龄对应的生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下： 
Yijk=μ+Ai+Gj+Xn+Eijk
其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Ai为年龄效应；Gj为各位点的基因型效应；Xn为年龄和基因型的互作效应；Eijk为随机误差。 
表4APOA2基因3个突变位点与南阳牛生长性状之间的t检验分析 
Figure BDA0000390336520000131
注：BL12：12月龄体斜长；HG12：12月龄胸围；HW12：12月龄坐骨端宽；BL18：18月龄体斜长；HG18：18月龄胸围；BW24：24月龄体重；BH24：24月龄体高；HW24：24月龄坐骨端宽。由于AC_000160.1g.360T>G位点CC基因型、AC_000160.1g.424G>C位点GT基因型和AC_000160.1g.540A>G位点CC基因型个体数目较少，在数据统计中舍去；平均值肩标上具有相同小写字母或大写字母表示差异不显著或极显著（P>0.05或P>0.01），平均值肩标上小写字母或大写字母不同表示差异显著或极显著（P<0.05或 P<0.01）。 
结果表明：黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G位点的多态性显著影响黄牛12月份坐骨端宽、18月份体长和18月份胸围，AC_000160.1g.424G>C位点的多态性显著影响黄牛12月份体长和12月份胸围，AC_000160.1g.540A>G位点显著影响黄牛24月份体重、24月份体高和24月份坐骨端宽。因此这三个位点可以作为黄牛生长性状的分子标记，本实验为肉牛优良品种的培育提供了一定的参考。 

Claims (7)

1.一种快速检测中国地方黄牛APOA2基因多态性的方法，其特征在于，以包含APOA2基因的待测牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛APOA2基因,经测序发现3个突变位点；针对这3个位点设计3对引物PR1、PR2和PR1，分别利用Bmgt120Ⅰ，HindⅢ和HaeⅢ三种限制性内切酶酶切PCR产物，根据琼脂糖凝胶电泳鉴定了黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G三个突变位点的多态性。 
2.根据权利要求1所述的快速检测黄牛APOA2基因3个突变位点多态性的方法，其特征在于，所述的筛选APOA2基因突变位点的PCR扩增反应所需引物和程序为： 
所述的引物对P为： 
上游引物：5'-CTCCTCCAAAGTCCTTATCACC-3' 
下游引物：5'-GCAGGCTCACAACTTAACTCC-3’ 
P：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s；72℃延伸10min。 
3.根据权利要求1所述的一种快速检测黄牛APOA2基因3个突变位点多态性的方法，其特征在于，针对筛选得到的APOA2基因3个突变位点设计3对引物PR1、PR2和PR1。所述的鉴定APOA2基因突变位点的PCR扩增反应所需引物和程序为： 
所述的引物对PR1为： 
上游引物：5'-AATCCCAAGGAGGAGAAGGTGGCC-3' 
下游引物：5'-ATTCAGCCTCAGCTCTCAGCCCT-3’ 
PR1：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸10s；72℃延伸5min。 
所述的引物对PR2为： 
上游引物：5'-CACTTTCCCTGCCGTTAA-3' 
下游引物：5'-TTTCTGGGCTTTAGAGAGGGGAAG-3’
PR2：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s；72℃延伸5min， 
所述的引物对PR1为： 
上游引物：5'-CCTTGAAGGTGGGTGTGA-3' 
下游引物：5'-CAGGCTCTGCAGATTCGACTCC-3’ 
P：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s；72℃延伸5min。 
4.根据权利要求1所述的一种快速检测黄牛APOA2基因3个突变位点多态性的方法，其特征在于，分别利用Bmgt120Ⅰ，HindⅢ和HaeⅢ三种限制性内切酶酶切PCR产物，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G位点多态性为：CC基因型表现为144bp条带和22bp条带，CT基因型表现为166bp条带、144bp条带和22bp条带，TT基因型表现为166bp条带；AC_000160.1g.424G>C位点多态性为：GG基因型表现为171bp条带和26bp条带，GT基因型表现为197bp条带、171bp条带和26bp条带，TT基因型表现为197bp条带；AC_000160.1g.540A>G位点多态性为：GG基因型表现为288bp条带和26bp条带；AG基因型表现为314bp条带，288bp条带和26bp条带；AA基因型表现为314bp条带。 
5.根据权利要求1所述的一种快速检测黄牛APOA2基因3个突变位点多态性的方法，其特征在于，检测3个位点多态性所用的琼脂糖浓度为3%。 
6.权利要求1至5中任意一项权利要求所述的快速检测黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G，AC_000160.1g.424G>C和AC_000160.1g.540A>G三个突变位点的多态性的方法在鉴定不同牛群体多态性中的诊断应用。 
7.权利要求6所述的诊断应用，其特征在于，鉴定不同黄牛群体多态性，黄牛APOA2基因AC_000160.1g.360T>G位点的多态性作为一个在黄牛生长性状的标记辅助选择育种中影响黄牛12月龄坐骨端宽、18月龄体长和18月龄胸围的分子遗传标记，黄牛APOA2基因AC_000160.1g.424G>C位点的多态性作为一个在黄牛生长性状的标记辅助选择育种中影响黄牛12月龄体长和12月龄胸围的分子遗传标记，黄牛APOA2基因AC_000160.1g.540A>G位点的多态性作为一个在黄牛生长性状的标记辅助选择育种中影响黄牛24月龄体重、体高和坐骨端宽的分子遗传标记。 
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