CN103320510A

CN103320510A - 一种黄牛hgf基因单核苷酸多态性的检测方法及应用

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Publication number: CN103320510A
Application number: CN2013102068165A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 蔡含芳; 蓝贤勇; 李爱民; 周扬; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明公开了一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法及应用，以包含黄牛HGF基因的全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增获得黄牛HGF基因，PCR产物经限制性内切酶HincII消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛HGF基因组第72801位的单核苷酸多态性。由于HGF基因功能涉及肌肉及机体各个组织器官的正常生长发育，本发明所阐述的方法能够快速的检测黄牛HGF基因的单核苷酸多态性，为HGF基因的SNP与生长性状关系的建立奠定基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择（MAS）育种提供基础资料，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及黄牛单核苷酸多态性（SNP）分子标记的筛选与检测，特别涉及一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法及应用。

背景技术

近20年来，尤其是近10年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的发展，其中，分子遗传标记是目前在家畜育种中研究得最多的内容，也是近期内最可能在家畜育种中得到广泛应用的研究项目。遗传标记是指那些可以准确鉴别的、能反映个体特异性的遗传特征。分子遗传标记则是指以个体遗传物质即核苷酸序列变异为基础的DNA分子标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。利用分子标记辅助选择育种，是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在DNA水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。

单核苷酸多态性（SNP）是一种重要的分子遗传标记，它是由美国学者Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。由于DNA序列改变，甚至1个核苷酸的变化都会引起1个限制性内切酶位点的丢失或产生，因此，在发现SNP位点后，利用限制性内切酶进行切割，然后进行凝胶电泳分析，就能准确的鉴别SNP位点的基因型，即所谓的PCR-RFLP方法。美国学者Botstein等认为限制性片段长度多态性（RFLP）可作为遗传标记应用于育种中。该方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且检测序列位点无特殊要求。

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）最早于1984从肝切除后的残余肝组织中被发现，后从大鼠血小板中分离提纯，其活性不具种属特异性，因最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名。HGF具有刺激肝细胞分裂、促进细胞运动、启动肝再生等多种生理作用，此外，越来越多的报道表明，HGF对许多组织和细胞的生长、分化起重要调控作用，是一类作用广泛的细胞因子。肌肉发育过程中所涉及的多个因子及各种生物学功能的研究越来越被研究者所关注。HGF是一个大的多区域蛋白质,作为重要的形态发生原和有丝分裂原在肌肉发育过程中有着举足轻重的作用。HGF与其受体c-met结合启动一系列的信号通路在肌肉发育的增殖和分化过程中行使生物学功能。黄牛的HGF基因定位在第4号染色体上，全长81704bp，编码区全长2193bp，包括18个外显子和17个内含子。HGF是一种间充质合成和分泌的多小型细胞因子，通过自分泌或旁分泌的形式作用于数种上皮源细胞胞膜上的特异性c-met受体，从而发挥多种生物学效应。目前，国内外对HGF基因多态性的研究主要集中于其与心血管疾病，肿瘤等的关联性研究，而对于家畜HGF基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法与应用，利用PCR-RFLP方法快速检测黄牛HGF基因的单核苷酸多态性，以多态性为黄牛的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国黄牛的种质资源改良工作。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，以包含黄牛HGF基因的全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛HGF基因，然后利用限制性内切酶HincII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛HGF基因组第72801位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P序列为：

上游引物F：AGAAAGCTGAGAGGCACAGG；

下游引物R：GGAATTCCATTTACAACTGTCA。

所述的PCR反应程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火40s，72℃延伸15s；40个循环；72℃后延伸10min。

所述的黄牛HGF基因组第72801位的单核苷酸多态性，即为黄牛HGF基因编码区的第1476位，也即HGF基因13外显子第32位的G>A突变的单核苷酸多态性。

所述用于检测的琼脂糖凝胶的质量浓度为3%，在室温下，120V电泳1h。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛HGF基因编码区的第1476位，即黄牛HGF基因组第72801位，也即HGF基因13外显子第32位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为121bp一条条带；AG基因型表现为121bp、100bp和21bp三条条带，GG基因型表现为100bp和21bp两条条带。其中，21bp条带在3%琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但不影响鉴定基因型。

黄牛HGF基因编码区的第1476位的单核苷酸多态性作为分子标记在黄牛生长性状的辅助选择中的应用。

所述在辅助选择时，将基因型为AA和AG型的个体淘汰；基因型为GG型的个体留种进行扩繁。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据黄牛HGF基因的序列设计引物，分别以5个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛HGF基因的部分序列。与NCBI上公布的序列进行比对后，发现在黄牛HGF基因组第72801位存在G>A的突变。该突变位点位于黄牛HGF基因编码区的1476位，产生一个错义突变。

针对上述第72801位的突变，本发明还公开了其筛选和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定。该方法解决了传统的PCR-SSCP方法的繁琐和不稳定，能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。

本发明对突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将该位点与南阳牛的生长性状进行关联分析。结果表明该位点可作为提高南阳牛12月龄体高的分子遗传标记。

附图说明

图1为黄牛HGF基因组第72801位GG基因型个体的测序图；三角表示该位点发生突变：AC_000161.1：g.72801G。

图2为黄牛HGF基因组第72801位AG基因型个体的测序图；三角表示该位点发生突变：AC_000161.1：g.72801G>A。

图3为黄牛HGF基因组第72801位AA基因型个体的测序图；三角表示该位点发生突变：AC_000161.1：g.72801A。

图4为黄牛HGF基因组第72801位不同基因型PCR产物经HincII酶切后电泳结果（泳道1为AA基因型；泳道2为Marker；泳道3为GG基因型；泳道4,5均为AG基因型；Marker为Marker I,分别是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp）。

具体实施方式

本发明根据黄牛HGF基因组序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，产物测序得到黄牛HGF基因的部分序列。与参考序列比对，发现一处突变，利用PCR-RFLP方法对该突变进行检测。下面对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、黄牛HGF基因部分序列的克隆及其多态性检测

1.样本采集及基因组DNA提取

⑴血样的采集

本发明采用了5个黄牛品种，共计1186个个体作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示：

表1实验动物情况

⑵血样DNA的提取

①冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液（PBS）混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至3μL（20mg/mL），并混匀，55℃水浴中消化过夜（16h左右）至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μLTris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液（24:1）500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。

2.DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，DNA浓度（ng/μL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数。如果OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从5个黄牛群体中随机选择50个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建DNA池。

二、扩增引物设计

1.黄牛HGF基因第13外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛（AC_000161.1）序列为参考，利用Primer5.0软件设计能够扩增包含黄牛HGF基因第13外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

E13F:5’-TTTTGGGTCTGATCTGGCACT-3’ 21nt

E13R:5’-CAAGCAGGATGGGATTCGTC-3’ 20nt

三、PCR扩增

PCR反应体系如表2所示。

表2PCR反应体系

Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）	0.25μL
		上游引物（10pmol/μL）	0.5μL
下游引物（10pmol/μL）	0.5μL
		2×Reaction Mix（内含Mg²⁺、dNTP等）	12.5μL
灭菌的双蒸水	9.75μL
		DNA模板（50ng/μL）	1μL
总体积	25μL

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火40s，72℃延伸15s；40个循环；72℃后延伸10min。

四、PCR产物测序

将用以上混合的DNA池为模板扩增的PCR产物送南京金斯瑞有限公司进行双向测序。对黄牛HGF基因目的片段测序结果与参考序列进行比对，发现在第13外显子的32位存在一个G>A的突变，但不能形成任何酶切位点。故采用引物错配的方法引入突变碱基从而构成酶切位点。

五、黄牛HGF基因PCR-RFLP分析中引入酶切位点的引物P的设计

DNA池扩增测序后，发现该位点的突变没有合适的酶切位点，从而人为构建了一个HincII的酶切位点，从而可以使用PCR-RFLP方法进行基因型的判定。

上游引物F：5’-AGAAAGCTGAGAGGCACAGG-3’ 20nt

下游引物R：5’-GGAATTCCATTTACAACTGTCA-3’ 22nt

其中下游引物3’端起第3和4位引入错配碱基，即为带下划线的碱基。六、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先进行HincII酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。20μL的HincII酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer2.0μL，HincII（10U/μL）1.0uL，7.0μL灭菌双蒸水。混合样品37℃恒温培养箱中消化5～16h，3%的琼脂糖凝胶120V电压室温条件下电泳1h，溴化乙锭（EB）染色检测酶切结果，用Bio-RAD凝胶成像仪成像。根据电泳条带的图像，判断基因型。由于引物对P的扩增产物不含其它的HincII的酶切位点，因此，含“G”的PCR扩增产物片段会被切成两个片段（100bp和21bp）；含“A”的PCR产物不能被HincII所识别，故被“切”成一条带（121bp）。因此，AA基因型表现为121bp一条条带；AG基因型表现为121bp、100bp和21bp三条条带，GG基因型表现为100bp和21bp两条条带。但由于21bp太短而在电泳图中看不见，故在实际的电泳分析中，只能观察到两条带，如图4所示。

七、黄牛HGF基因SNP位点的频率统计及其与生长性状的关联分析

1.基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位点的BB基因型频率；N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

P_B=(2N_BB＋N_Bb1＋N_Bb2＋N_Bb3＋N_Bb4＋……＋N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B频率，N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数量，N_Bbi表示群体中具有Bb_i基因型个体数量，b₁～b_n为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。

各品种中的基因频率与基因型频率的统计结果如下表3所示：

表3五个黄牛品种中HGF基因的基因型和等位基因频率

从表3中可以看出等位基因A的频率变化范围为0.661～0.836，等位基因G的频率变化范围为0.164～0.339，由此可见，在5个黄牛品种中，对于等位基因G的选择具有很大的潜力。

2.相关分析统计模型

利用SPSS（18.0）软件分析基因位点与生长性状的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响体尺和体重等生长发育指标的因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk=μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的基因型效应；E_ijk为随机误差。

表4HGF基因单核苷酸多态性与南阳牛生长性状之间的方差分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），平均值肩标上字母不同表示差异显著（P<0.05）。

结果表明，在黄牛HGF基因组序列的第72801位单核苷酸多态位点上的不同基因型与南阳牛体尺和体重等生长发育指标关联分析表明，GG基因的个体的12月龄体高都显著优于AA和AG两种基因的个体。因此GG基因型可作为黄牛体高早期选择的分子育种基因标记。

Claims

1.一种黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，以包含黄牛HGF基因的全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛HGF基因，然后利用限制性内切酶HincII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛HGF基因编码区的第1476位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P序列为：

上游引物F：AGAAAGCTGAGAGGCACAGG；

下游引物R：GGAATTCCATTTACAACTGTCA。

2.如权利要求1所述的黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应程序为：

3.如权利要求1所述的黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的黄牛HGF基因编码区的第1476位的单核苷酸多态性，即为黄牛HGF基因组第72801位，也即HGF基因13外显子第32位的G>A突变的单核苷酸多态性。

4.如权利要求1所述的黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，用于检测的琼脂糖凝胶的质量浓度为3%，在室温下，120V电泳1h。

5.如权利要求1所述的黄牛HGF基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，根据电泳结果判定黄牛HGF基因编码区的第1476位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为121bp一条带；AG基因型表现为121bp、100bp和21bp三条带，GG基因型表现为100bp和21bp两条带。

6.黄牛HGF基因编码区的第1476位的单核苷酸多态性作为分子标记在黄牛生长性状的辅助选择中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在辅助选择时，将基因型为AA和AG型的个体淘汰；基因型为GG型的个体留种进行扩繁。