CN116024354A - 一种与黄牛生长性状相关的snp分子标记、检测引物、试剂盒及育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记、检测引物、试剂盒及育种方法。本发明的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5’端起第96位碱基为T或G。该SNP位点能够作为黄牛品种遗传改良的分子标记，采用该分子标记对黄牛进行选育，有利于提高黄牛群体的体高性状，可应用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择育种中，有利于性状优良的黄牛种群的遗传改良。本发明提供了检测FGF13基因SNP分子标记的引物、试剂盒，同时提供了基于FGF13基因SNP分子标记的黄牛生长性状改良育种方法，有利于缩短育种时间，加快育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记、检测引物、试剂盒及育种方法，属于分子生物学技术和牛育种领域。
背景技术
SNPs是指由单个核苷酸在基因组水平发生变异造成的DNA序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式，其中一种等位基因在群体中的频率不少于1％。由于SNPs具有数量多、分布广，遗传稳定性高等特点，且一些单核苷酸突变可直接影响基因转录或翻译产物的表达，SNPs可作为分子遗传标记，应用于动物育种和改良工作中，也即分子标记辅助选择育种(DNA Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)。MAS是直接在DNA水平上对与性状显著相关的基因型进行选择，因此其选种的准确性和强度大大提高，可缩短时代间隔，克服了传统动物育种方法的缺陷。
由于DNA序列改变，甚至1个核苷酸的变化都会引起1个限制性内切酶位点的丢失或产生，所以可利用限制性内切酶对SNPs进行切割，然后进行凝胶电泳分析，通过不同的带型，就能准确的鉴别SNPs位点的基因型，即所谓的PCR-RFLP方法。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性高的缺点，而且多检测序列位点无特殊要求。
作为重要的生长因子，成纤维生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)参与机体的多种生理过程，在胚胎发育、细胞增殖、形态发生和组织修复过程中发挥着重要的功能。FGF13基因属于成纤维生长因子家族的成员之一，位于X染色体上，在神经系统中作为微管结合蛋白发挥作用。此外，FGF13是重要的有丝分裂原，参与蛋白激酶信号通路。研究表明，FGF13基因在骨骼肌组织中高表达，说明FGF13对于机体的生长发育起着举足轻重的作用。因此，FGF13基因是调控黄牛生长发育的重要候选基因。目前，国内外对FGF13基因多态性的研究，特别是家畜FGF13基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记，丰富了黄牛育种的分子标记遗传资源库，该SNP分子标记可应用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)育种中，有利于性状优良的黄牛种群的遗传改良。
本发明的第二个目的是提供该SNP分子标记在黄牛生长性状改良育种中的应用，采用该分子标记对黄牛进行选育，能增加对黄牛生长性状选择的准确性，从而有利于提高黄牛群体的体高性状。
本发明的第三个目的是提供一种检测该SNP分子标记基因型的检测引物。
本发明的第四个目的是提供一种检测该SNP分子标记基因型的试剂盒。
本发明的第五个目的是提供检测引物和试剂盒在黄牛种质资源改良中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种黄牛生长改良育种方法，采用本方法可以快速对体高性状的黄牛进行选育，有利于性状优良的黄牛种群的遗传改良。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，5’端起第96位碱基为T或G(序列表中以n代替)。
本发明首次发现上述的SNP分子标记，该SNP分子标记对应黄牛FGF13基因CDS区(Genebank Accession No.XM_005227536.2)上游启动子区域-1273位脱氧核苷酸，也即FGF13基因组序列(Genebank Accession No.AC_000187.1)的27122位脱氧核苷酸，该SNP位点在之前没有被报道过，是一新发现的分子标记。
该SNP分子标记在黄牛生长性状改良育种中的应用。
经研究分析发现该SNP分子标记与黄牛体高密切相关，可应用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择育种中，有利于性状优良的黄牛种群的遗传改良。
优选地，对SNP分子标记的基因型进行检测，当SNP分子标记的基因型为TG时，待测黄牛为高体型个体。
在实际应用时，检测如SEQ ID NO.1所示序列5'端起第96位核苷酸的种类，选择该位点为TG杂合型的黄牛个体建立遗传资源优良的黄牛种群。
一种检测引物，所述引物用于检测如权利要求1所述的分子标记的基因型；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示。
使用此引物对可快速扩增包含有该SNP分子标记的目标片段，该引物采用现有技术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。
一种用于检测该SNP分子标记基因型的试剂盒，所述试剂盒包含检测引物对，以及限制性内切酶RsaI。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶中的一种或几种。
上述的检测引物及检测试剂盒在黄牛种质资源改良中的应用。
本发明的检测引物及检测试剂盒，检测结果准确可靠，可操作性强，为本领域提供了一种能快速高效区别携带有TG杂合型个体黄牛的方法。
一种黄牛生长改良育种方法，包括以下步骤：以待测黄牛的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR扩增，对PCR产物用RsaI内切酶进行酶切反应，若酶切产物为317bp一条条带，突变处碱基为纯合GG型，若酶切产物为317bp、221bp和96bp三条条带，突变处碱基为杂合TG型，如酶切产物为221bp和96bp两条条带，突变处碱基为纯合TT型；当SNP分子标记的基因型为TG时，待测黄牛为高体型个体；选留TG杂合基因型的黄牛个体。
该方法对上述SNP分子标记基因型进行检测，能够早期、有效地预测18月龄黄牛的体高，从而缩短了育种时间，加快育种进程，具有很大的经济应用价值和科研价值，在黄牛种植资源改良方面具有广阔的应用前景。
优选地，所述PCR反应程序为：
95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；36个循环；72℃延伸10min。
优选地，所述的黄牛生长性状为体高。
附图说明
图1为本发明实施例1中秦川牛FGF13基因组第27122位点DNA池测序结果(红三角表示该位点发生突变：AC_000187.1：g.27122T>G)；
图2为本发明实施例1中秦川牛FGF13基因组第27122位点不同基因型PCR产物RsaI酶切电泳结果(泳道1为marker，泳道2,3均为GG基因型；泳道4为TT基因型；泳道5为TG基因型；Marker为DNA marker I，分别是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
实施例1一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记
本实施例的与黄牛生长性状相关的SNP分子标记如SEQ ID NO.1所示，该序列5’端起第96位碱基为T或G(序列表中以n代替)。经比对该SNP位点对应于牛FGF13基因CDS区(Genebank Accession No.XM_005227536.2)上游启动子区域-1273位脱氧核苷酸，也即FGF13基因组序列(Genebank Accession No.AC_000187.1)的27122位脱氧核苷酸。该SNP位点获得的具体操作步骤如下：
1、川牛FGF13基因启动子区域序列的克隆及其多态性检测
1.1本采集及基因组DNA提取
1.1.1样的采集
本发明采用了共计330个秦川牛作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血，秦川牛来自于陕西省秦川牛原种场和陕西省秦川牛繁育中心。
1.1.2血样DNA的提取
①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色；
②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h；
③加蛋白酶K至30μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；
④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次；
⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管；
⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出；
⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净；
⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。
1.2DNA池的构建
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA。检测完毕后，取出一定量的DNA样品，稀释至50ng/μL，然后从中随机选择50个样品，从中抽取5μL混合均匀，构建DNA池。
1.3秦川牛FGF13基因启动子区域PCR引物的设计
以NCBI所公布的牛FGF13基因的序列(Genebank Accession No.AC_000187.1)为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含黄牛FGF13基因启动子区域的PCR引物对P1，其引物序列如下：
上游引物F-1:5’-TGCCCTACTGACACCCAGATCC-3’(SEQ ID No.2)
下游引物R-1:5’-TGAGCCTGTTACACCGCAAAGC-3’(SEQ ID No.3)。
1.4PCR扩增
PCR反应体系如表1所示。
表1 PCR反应体系
| Taq DNA聚合酶(2.5U/μL) | 0.25μL |
| 上游引物(10pmol/μL) | 0.5μL |
| 下游引物(10pmol/μL) | 0.5μL |
| <![CDATA[2×Reaction Mix(内含Mg<sup>2+</sup>、dNTP等)]]> | 12.5μL |
| 灭菌的双蒸水 | 10.75μL |
| DNA模板(50ng/μL) | 0.5μL |
| 总体积 | 25μL |
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，36个循环；72℃延伸10min。
1.5PCR产物测序
将用以上混合的DNA池为模板，用引物对P1扩增的PCR产物送南京金斯瑞有限公司进行双向测序。将测序结果与参考序列进行比对，发现在FGF13基因组第27122位，也即启动子区-1273位存在一个T>G的突变，由图1所示，即为筛查到的秦川牛FGF13基因的单核苷酸多态性，造成一个RsaI限制性内切酶酶切位点的缺失。
1.6牛FGF13基因PCR-RFLP分析中引物P2的设计
由于引物对P1扩增的PCR产物中另外存在一个RsaI酶切位点，为了节约使用限制性内切酶，另又设计一对包含该突变位点的引物对P2，以用于PCR-RFLP方法进行基因型的判定。
其引物序列如下：
上游引物F-2：5’-GCGGAGTCCCCAAAGTGTAG-3’(SEQ ID No.4)；
下游引物R-2：5’-CGGCGGGCTGTAGTAAAAG-3’(SEQ ID No.5)。
1.7 PCR产物酶切及RFLP检测
PCR扩增后(扩增条件与反应体系如实施例1中1.4中所述)的产物首先进行RsaI酶切，然后根据电泳结果判定个体的基因型。20μL的RsaI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer 2.0μL，RsaI(10U/μL)1.0uL，7.0μL灭菌双蒸水。反应体系混合均匀，37℃恒温培养箱中消化5～16h，采用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，120V电压电泳40min，溴化乙锭(EB)染色检测，Bio-RAD凝胶成像仪成像。根据电泳条带的图像，判断个体基因型。
RsaI酶的酶切位点为GT↓AC，所以含“T”的DNA扩增片段会被酶切成两个片段(221bp和96bp)；含“G”的DNA产物不能被RsaI所识别，故不能被酶切，呈现一条带(317bp)。由于秦川牛为二倍体动物，当发生T>G突变时，可以形成3种不同的基因型，分别为GG、TG、TT。因此，在凝胶电泳结果中，GG基因型表现为317bp一条条带；TG基因型表现为317bp、221bp和96bp三条条带，TT基因型表现为221bp和96bp两条条带，如图2所示。
2、秦川牛FGF13基因SNPs位点的频率统计及其与生长性状的相关分析
2.1基因和基因频率
基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：
PAA＝NAA/N
其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：
PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+……+NAan)/2N
式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1～an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。通过计算，具体的统计结果见表2。
表2秦川牛FGF13基因SNP位点的等位基因和基因型频率
2.2关联分析统计模型
利用SPSS(18.0)软件分析基因位点与238头秦川牛生长性状的相关性，以期揭示该SNP位点是否是与黄牛生长发育显著相关的分子标记，是否能用于后续黄牛分子育种工作。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用方差分析分析基因型效应。在数据处理中，根据影响体尺和体重等生长发育指标的因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：
Yij＝μ+Gj+εij
其中：Yijk为个体表型记录；μ为总体均值；Gj为各位点的基因型效应；εij为随机误差。
结果表明，在黄牛FGF13基因组第27122位的单核苷酸多态位点与18月龄秦川牛体高显著关(P<0.05)，其中TT、TG和GG基因型个体所对应的体高(平均值±标准差，cm)分别为：122.8±9.78、135.17±8.86和130.92±6.37，并且TG基因型的个体的18月龄体高显著高于TT基因型的个体(P<0.05)，因此，黄牛FGF13基因的该SNP位点，可作为黄牛早期分子育种的分子标记。
实施例2一种检测引物
本实施例中用于检测与黄牛生长性状相关SNP基因型的检测引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物F-2：5’-GCGGAGTCCCCAAAGTGTAG-3’(SEQ ID No.4)；
下游引物R-2：5’-CGGCGGGCTGTAGTAAAAG-3’(SEQ ID No.5)。
实施例3一种检测试剂盒
本实施例中用于检测与黄牛生长性状相关SNP基因型的的试剂盒，包括如实施例2所示的引物，还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和RsaI内切酶。
实施例4一种黄牛生长改良育种方法
本实施例的一种黄牛生长改良育种方法，包括以下步骤：
首先，提取待测黄牛的基因组DNA构建DNA池，用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR扩增：
PCR扩增的反应体系为：Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.25μL，2×Reaction Mix(内含Mg2+、dNTP等)12.5μL；DNA模板(50ng/μL)0.5μL，上游引物(10pmol/μL)0.5μL，下游引物(10pmol/μL)0.5μL，ddH2O 10.75μL。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s；36个循环；72℃延伸10min。
其次，利用限制性内切酶长度多态性(RFLP,Restriction Fragment LengthPolymorphism)，对PCR产物用RsaI内切酶进行酶切鉴定：该位置碱基为T时则能被RsaI酶切，为G时则不能被RsaI酶切，借此用于分型。
酶切反应的体系为10μL PCR产物，10×Buffer 2.0μL，RsaI(10U/μL)1.0uL，7.0μL灭菌双蒸水。反应条件为37℃恒温培养箱中消化5～16h。
最后，通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测所述酶切产物的大小，以判断SNP分子标记的基因型，120V电压电泳40min，溴化乙锭(EB)染色。
若酶切产物为317bp一条条带，突变处碱基为纯合GG型，若酶切产物为317bp、221bp和96bp三条条带，突变处碱基为杂合TG型，如酶切产物为221bp和96bp两条条带，突变处碱基为纯合TT型。在育种中应予以保留携带TG基因型个体，从而有利于提高牛群体的体高性状。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明构思的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与黄牛生长性状相关的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5’端起第96位碱基为T或G。
2.一种如权利要求1所述的SNP分子标记在黄牛生长性状改良育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：对SNP分子标记的基因型进行检测，当SNP分子标记的基因型为TG时，待测黄牛为高体型个体。
4.一种检测引物，其特征在于，所述引物用于检测如权利要求1所述的分子标记的基因型；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
5.一种用于检测权利要求1所述SNP分子标记基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求4所述的引物对，以及限制性内切酶RsaI。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶中的一种或几种。
7.一种如权利要求4所述的引物或权利要求5所述的试剂盒在黄牛种质资源改良中的应用。
8.一种黄牛生长改良育种方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测黄牛的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR扩增，对PCR产物用RsaI内切酶进行酶切反应，若酶切产物为317bp一条条带，突变处碱基为纯合GG型，若酶切产物为317bp、221bp和96bp三条条带，突变处碱基为杂合TG型，如酶切产物为221bp和96bp两条条带，突变处碱基为纯合TT型；当SNP分子标记的基因型为TG时，待测黄牛为高体型个体；选留TG杂合基因型的黄牛个体。
9.根据权利要求8所述的黄牛生长改良育种方法，其特征在于：所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；36个循环；72℃延伸10min。
10.根据权利要求8所述的黄牛生长改良育种方法，其特征在于：所述的黄牛生长性状为体高。
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