KR20070113336A

KR20070113336A - 돼지 근세포수 증가 확인용 ｄｎａ 표지인자

Info

Publication number: KR20070113336A
Application number: KR1020060046014A
Authority: KR
Inventors: 홍기창; 김병철; 박성수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2006-05-23
Publication date: 2007-11-29
Also published as: KR100784166B1

Abstract

본 발명은 돼지의 근세포 증가 관련 DNA 표지 인자에 관한 것으로, 돼지의 근세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 5’promoter 부위의 단일 염기서열 차이에 의한 변이(SNP)를 새로이 발견하고, 그에 따라서 근세포 수에 차이를 주어 돼지의 육량을 증대시킬 수 있는 표지인자를 개발하였다. 또한 이를 손쉽게 탐지할 수 있는 선발용 kit를 개발하였다.

본 발명을 이용하여 육질의 저하는 가져오지 않으면서, 육량을 증대 시킬 수 있는 표지인자를 육종에 적용함으로써 조기선발과 생산성 향상에 따른 경제적인 효율성과 양질의 돈육을 생산할 수 있는 기반을 마련할 수 있다.

Description

돼지 근세포수 증가 확인용 ＤＮＡ 표지인자 {DNA marker for detecting increase of pig muscle―cell number}

도 1은 근세포분화에 관여하는 것으로 알려진 돼지 Myogenin 유전자의 5’promoter region을 염기서열 분석한 결과이다. (788bp 부위가 새로이 발견한 단일염기변이부위(SNP;single nucleotide polymorphism)이다.)

도 2은 돼지 Myogenin 유전자의 구조를 분석한 결과이다. (SEI,II,III : promoter region의 분석단위(700bp) 별 구분, EX1,2,3 : exon 1,2,3, SNP : 단일염기변이 (Single nucleotide polymorphism), TATA : TATA box, E-Box : CANNTG (transcription factor binding consensus sequence), NF-1 : nuclear factor 1 site, MEF-2 : myocyte-specific enhancer factor 2 site)

도 3은 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR-RFLP를 실시한 결과이다. SNP 부위를 증폭시켜줄 수 있게 제작되었고, 유전자형은 각각 TT, TC, CC 세가지로 나타나며, T allele은 463bp, 158bp, 43bp로 C allele은 463bp, 82bp, 76bp, 43bp로 band가 관찰된다.

본 발명은 돼지 근세포수 증가와 관련된 돼지 근세포수 증가 확인용 DNA 표지인자에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 돼지의 근세포 분화와 관련된 Myogenin 유전자의 5’promoter region의 SNP를 이용한 DNA 표지인자와 이를 손쉽게 탐지할 수 있는 선발용 킷트에 관한 것이다. 근세포는 근육의 기본 단위로 근육성장 및 근육의 이화학적 특성을 설명하는 기본 단위로 활용할 수 있다. 뿐만 아니라 각 근섬유는 산화적/혐기적 대사특성, 수축속도, 섬유의 크기, 모세혈관 비율 등 독특한 특성을 지니고 있기 때문에 육량적 측면 뿐 아니라 사후 근육의 대사변이와 육질 형성과도 밀접히 연관되어 있다(Pette와 Staron, 1990). 이러한 이유로 최근 근세포 분화와 조직학적 특성에 관여하는 유전인자에 대한 관심이 높아지고 있다.

근세포의 세포증식은 임신기간 90일 이내에 종료되는데(Wigmore와 Stickland, 1983), 1차 근원세포(primary myoblast)의 빠른 융합에 의해 1차 근섬유(primary fiber)의 형성이 선행된 후 그 표면에 2차 근섬유(secondary fiber)의 발달이 이루어진다(Duxson과 Usson, 1989). 동물의 근육생산량은 이러한 과정에 의해 형성된 근섬유 수(muscle fiber number)와 깊은 관련이 있으며(Luff와 Goldspink, 1967), 돼지의 경우 근세포 수는 출생 이전에 이미 고정된다(Staun, 1972). Handel과 Stickland(1987)는 돼지에 있어 출생 전 형성된 근섬유수가 최고의 적육성장 능력을 결정한다고 보고하였다. 자돈은 생시체중, 성장율, 근섬유 수 등에서 다양한 변이를 보이는데(Dwyer와 Stickland, 1991), 이들 변이 중 많은 부분이 유전적 요인에 의해 결정되어진다(Coppieters 등 1993).

돼지에 있어 근세포 분화를 조절하는 유전자는 MyoD(Davis 등, 1987), Myogenin (Wright 등, 1989), Myf-5(Braun 등, 1989), MRF4(Miner 등, 1990) 등이 보고되고 있으며, 이들의 유전적 변이를 밝히려는 연구가 시도되고 있다. 현재 돼지 myf-4 유전자에 대한 다형성이 보고 되었으며(Ernst 등, 1993), 최근 근육발달과 성장에 관여하는 Myogenin 유전자 좌위의 변이와 다형성에 대한 유전자형 구분이 시도되어(Ann Soumillion 등, 1997) 표지유전자 개발에 대한 가능성을 시사하였다. 그러나 유전자 내에 다형성의 위치와 육종선발계통 내에 표지인자로 이용 가능한 유전자의 선별은 이루어지지 못하고 있다.

돼지의 생산성 극대화를 위한 육종계획은 다양한 선발강도를 통해 근육이나 지방, 뼈 등 각 조직들에 적용되어져 왔다. 그 중 총근섬유 수, 근섬유 조성, 근섬유 단면적 및 모세혈관의 밀도는 근육성장과정에서 근육의 이화학적 특성에 중요한 영향을 주며, 도축 전ㆍ후 근육의 생화학적 대사변이를 가져와 결과적으로 육질에까지 영향을 미치게 된다(Karlsson 등, 1994).

근세포 분화에 관여하는 여러 유전자의 영향으로 근섬유 수와 근육내 조직학적 특성에 변이를 가져오며 이에 따른 근육의 이화학적 특성변이가 나타나게 된다. 조직학적 연구결과 근섬유는 출생 후 2일 동안 분화하여 각 근섬유 type으로 구분되기 시작하고 성성숙이 일어날 때까지는 type I fiber 비율의 증가가 관찰되며, 그 이후에는 감소하는 것으로 알려져 있다(Pette와 Staron, 1990). 또한 성장 중 oxidative fiber 단면적의 감소와 glycolytic fiber 단면적의 증가가 관찰된다(Essen-Gustavsson 등, 1994). 돼지의 경우, 각 근섬유의 구성비율은 각 개체와 근육에 따라 다르며(Sorensen 등, 1996), 이러한 근섬유 조성은 체중 25∼90kg 사 이의 성장기간 중에는 큰 변화를 나타내지 않지만 근섬유의 단면적, 모세혈관의 밀도, 여러 효소의 활성과 glycogen의 함량은 이 기간동안 큰 변화를 나타낸다(Oksbjerg 등, 1994). Klont 등(1998)은 사료효율과 oxidative fiber의 면적간에 부의 상관관계가 존재하며, 육량증가와 모세혈관의 밀도간에 정의 상관관계가 존재하는 것을 관찰하였다. 이를 바탕으로 적육생산형 육종의 결과 근섬유조성에 많은 변화를 가져와 그 결과로 glycolytic fiber의 비율이 증가하고 섬유직경이 증가했으며 이러한 변화는 직ㆍ간접적으로 육질에 영향을 미치고 있음을 시사하였다. 또한 oxidative fiber의 빈도가 높은 돼지의 경우 스트레스에 대한 저항능력이 크며 도축 후 pH 저하도 완만히 일어난다(Ruusunen과 Puolanne, 1997).

이러한 학문적인 근거를 바탕으로 근세포분화에 작용하는 유전적인 요인을 찾기 위한 연구를 진행하였고, 그 과정중에 Myogenin 유전자를 분석하였다(도 1, 2). 본 발명에서는 그 결과 5‘ promoter region에서 나타나는 단일염기변이(SNP) 부위를 발견하였다. 이 부위는 C→T로 염기가 transition 됨으로써, 유전자의 발현에 차이를 주게되어 근세포분화에 영향을 미치는 것으로 판단되어진다. 본 발명에서는 또한 이들을 손쉽게 검색할 수 있는 kit를 개발하였으며, 특이적인 primer를 제작하여 PCR-RFLP 방법을 이용하는 방식을 적용하였다(도 3).

따라서, 본 발명의 주된 목적은 돼지 근세포수 증가시킴으로서 육질을 저하시키지 않고, 육량을 증대시키는 돼지 근세포 분화 관련 DNA 표지인자 및 이를 이용한 간단한 선발용 킷트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 돼지의 근세포수 증가여부 확인용 DNA 표지인자을 제공한다. 구체적으로 서열번호 9의 염기서열에서 788번째 T 염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 돼지의 근세포수 증가여부 확인용 조성물을 제공한다. 상기 DNA 표지인자는 Gene bank (accession no. X89007 와 U14331)에 등록된 genomic DNA sequence를 바탕으로 porcine myogenin 5‘ promoter region에서 염기의 치환(C→T)으로 생긴 SNP이다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편은 돼지 근세포분화와 관련한 Myogenin 유전자의 새로운 유전적 변이부위(SNP site)인 788번째 T염기를 포함하는 DNA 표지인자이다. 이 유전적 변이부위는 C→T 로 염기가 transition됨으로써, 유전자의 발현에 차이를 주게 되어 결과적으로 근세포수 증가 및 돼지의 육량 증대에 영향을 미친다. 상기 DNA 단편의 크기는 전체 유전자의 full length 가 아닌한 상기 SNP 부위를 포함하는 어떤 단편 크기일 수 있으나, 바람직하게는 15 내지 수백 염기인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 15 내지 700 염기인 것을 특징으로 한다. 15 내지 30 염기의 경우는 상기 SNP를 탐지하기 위한 프로브(probe)나 프라이머로 이용될 수 있으며, 그이상인 염기의 경우는 후술하는 PCR RFLP 방법으로 탐지하는데 이용될 수 있다. 예컨대, 도 3의 경우는 상기 SNP 부위를 포함하는 664 염기 단편을 증폭하여 DNA 표지인자로 이용하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편은 돼지의 근세포수를 증대시키면서 육질을 저하시키지 않게 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 의미하는 ‘돼 지의 근세포 수를 증대시키면서 육질을 저하시키지 않게 하는 것’ 이란 구체적으로 단일염기변이로 인한 개체별 유전자형(TT, TC, CC)에 따른 근세포 수와 육량 관련 형질인 등지방층 두께(Back fat thickness) 및 등심근 단면적(Loin eye area)과의 상관관계 분석결과로서, 근세포 수 증가를 가져오는 유전자형이 육량증대를 가져옴을 입증한 것을 말한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에서 돼지의 Myogenin 유전자의 5′promoter region의 근세포수 증가 관련 SNP를 탐색하기 위해서 당업자가 디자인 할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함되나, 바람직하게는 서열번호 7과 서열번호 8로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 본 발명의 프라이머와 PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 BspCNI으로 구성됨을 특징으로 하는 돼지의 근세포수 증가 관련 SNP 분석용 킷트를 제공한다. 상기 PCR 반응혼합물은 DNA 폴리머라제 및 완충용액을 포함하여 PCR을 수행하기 위해 사용되는 분자생물학적 시약(molecular biological reagent)을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 근세포분화 관련 Myogenin 유전자의 5′promoter region 내에 존재하는 표지인자인 SNP를 이용하여 돼지의 근세포수 증가여부를 확인하는 방법을 제공하며, 구체적으로는

(a) 돼지로부터 genomic DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로하여 Myogenin 유전자의 5‘ promoter region의 788번째 염기인 SNP가 포함된 특정부위를 증폭시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 BspCNI을 처리하는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 얻어진 유전자 단편들의 다형성(RFLP;Restriction Fragment Length Polymorphism)을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 근세포수 증가여부 확인방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 DNA 증폭은 Myogenin 유전자의 5‘ promoter region의 788번째 염기인 SNP가 포함된 특정부위를 증폭시킬 수 있는 어떤 프라이머를 이용할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 7과 서열번호 8로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 돼지의 근세포수 증가여부 확인 방법을 제공한다.

본 발명의 돼지 근세포수 증가여부 확인 방법에서, 상기 유전자 단편들의 다형성은 상기 SNP부위를 인식할 수 있는 어떠한 제한효소로 처리하는 것이 가능하나, 바람직하게는 제한효소 BspCNI로 처리하는 것이 좋다. 본 발명은 상기 SNP 부위 인식에서 표지유전자를 한 번의 PCR 반응과 효소처리로써 탐색하고 진단해 낼 수 있는 가장 효율적인 방법의 하나로써 PCR-RFLP 방법을 이용하여 탐색기법을 개발하였다. 구체적으로, 본 발명은 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 제한효소인 BspCNI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 band 형태를 파악하여 유전자형을 구분하였다. 예컨대, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머로 증폭하였을 경우 유전자형은 TT, TC, CC로 나타나며, T allele은 463bp, 158bp, 43bp로 C allele은 463bp, 82bp, 76bp, 43bp로 band가 관찰된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험예 1. 돼지 Myogenin 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석.

제1단계 :　클로닝

돼지의 Myogenin 5‘ promoter region은 genomic DNA로부터 높은 정제율과 이후 실시될 염기서열 분석의 효율을 높이기 위해서 대상유전자의 cloning을 실시하였다. Porcine myogenin 5' promoter region의 동정을 위하여 Gene bank(accession no. X89007 and U14331)에 등록된 genomic DNA sequence를 바탕으로 Forward primer 5’-GCT CAG AGG ACA AGA GTG TAA ACC C-3'(25mer)(서열번호 1)과 Reverse primer 5'-GAA GTA GGG GGA TGT CTC ATA CAG-3'(24mer)(서열번호 2)를 각각 제작하여 PCR을 수행하였다.

PCR수행 결과 약 2.1kb의 증폭산물을 얻을 수 있었다. 증폭된 porcine myogenin 5' promoter region의 이후 연구할 염기서열 분석을 위하여 약 2.1kb부위를 각 약 700bp씩 세 부분으로 나뉠수 있도록 internal 한 primer를 제작하였다. Primer set는 다음과 같이 M5-1 Reverse 5'-AGT GTT CCC AAT ACA GGA AGG TGA AC-3'(26mer)(서열번호 3), M5-2 Forward 5'-GTT CAC CTT CCT GTA TTG GGA ACA CT-3'(26mer)(서열번호 4), Reverse 5'-CTT AGG TCT CAT GTG ACT GGG GAT AA-3'(26mer)(서열번호 5), M5-3 Forward 5'-TTA CCC CAG TCA CAT GAG ACC TAA G- 3'(25mer)(서열번호 6)로 제작하였고, PCR 반응을 시켜 증폭한 뒤, E. coli용 TA- vector에 cloning한 후 EcoRI enzyme을 이용하여 각 세 개의 insert를 확인하였다.

제2단계 : 염기서열 분석

Autosequencing system을 이용하여 Cloning을 통하여 확보된 Porcine myogenin 5' promoter region 약 2.1kb의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 대상 개체군 내에서 random 하게 추출한 10개의 sample에 대해서 실시하였고, insert를 확인한 clon을 PCR product 내의 반응하고 남은 Template나 Primer를 없애주기 위해서 정제하였다. 이렇게 얻어진 약 700bp씩 3부분으로 분류된 2.1kb의 10개의 sample에 대한 염기서열을 양방향에서 분석하기 위해서 3반복씩 총 8번의 sequencing 반응 Autosequencing system을 통해 실시하였다. 염기서열 분석 결과 전사 시작 코돈으로부터 5‘ upstream에 TATA box 및 몇몇 transcriptional factor binding site를 확인 할 수 있었으며, 특히 5’ upstream -1070bp에서 개체간이 변이를 보이는 SNP site(T 또는 C)를 확인 할 수 있었다(도 1, 2).

실험예 2. DNA 표지인자 탐색용 kit 개발.

제1단계 : 돼지의 genomic DNA 추출

본 실험을 위해서 실험축군(resource population)으로 선정된 경기도 김포시 소재 (주)상원축산의 Yorkshire종과 Landrace종을 대상으로 실시하였다. 총 254마 리를 표본 추출하여, 경정맥으로부터 혈핵을 채취하였고, DNA 추출에 이용하였다.

상기 유전자 다형성 분석을 위한 genomic DNA의 분리는 Sambrook 등 (1989)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지의 경정맥에서 10 ml의 혈액을 채취한 후, 응고를 방지하기 위해서 ACD 용액 (citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32 g, glucose 1.47 g 을 H₂O 100 ml에 넣는다.) 2 ml을 첨가하여 4℃ 유지하여 실험실까지 운반하였다. 50 ml 원심 분리용 튜브에 옮긴 후 1,300 g에서 15분간 원심분리하여 buffy coat를 모아 15 ml의 DNA extraction buffer (10mM Tris-Cl, pH 8.0; 0.1M EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS; 20% ㎍/ml)를 넣고 잘 섞은 후 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 배양한다. 배양 후 Proteinase K (200 ㎍/ml, BRL)를 혼합하여 37℃ 항온수조에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 동량의 0.5M Tris-Cl (pH 8.0)으로 준비된 Phenol에 넣고 30분 동안 섞어 추출한 후 실온에서 15 분간 5,000 g로 원심 분리하여 층이 생기도록 하였다. 이 과정을 3번 반복한 후, 직경이 0.3 cm되는 pippet으로 상징액을 취하여 50 ml Tris-Cl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0) 4 L에서 18시간 동안 4℃ 에서 투석하여 chromosomal DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 순도는 spectrophotometer (Beckman, USA)를 이용하여 흡광도 A₂₆₀ 과 A₂₈₀ 의 비율로 측정하였으며, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동을 시행하여 DNA의 분자량을 확인하였다.

제2단계 : 본 발명 kit 개발을 위한 PCR-RFLP 분석

표지유전자를 한 번의 PCR 반응과 효소처리로서 탐색하고 진단해 낼 수 있는 가장 효율적인 방법의 하나로써 PCR_RFLP 방법을 이용하여 탐색기법을 개발하였다. Restriction mapper sofrware program을 이용해서 새롭게 밝혀낸 SNP부위를 인식할 수 있는 제한효소(Restriction enzyme)를 찾아내었고, 그렇게 찾아낸 제한효소인 BspCNI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 band 형태를 파악하여 유전자형을 구분할 수 있었다. PCR 반응시 primer는 Forward(5' - GTT CAC CTT CCT GTA TTG GGA ACA CT - 3', 26mer)(서열번호 7)와 Reverse(5 '- CTT AGG TCT CAT GTG ACT GGG GAT AA - 3')(서열번호 8)로 제작하여 각각 1㎕(20pmol/㎕)씩 첨가하였고, 그 외의 반응 첨가물은 10×PCR buffer(100mM Tris-Cl; pH 8.3, 500mM KCl, 15mM Mg2Cl) 5㎕, 10×dNTP mix(each 25mM) 5㎕, 10×Enhancer 5㎕, Taq DNA polymerase(5 unit/㎕; Genenmed) 0.5㎕ 와 ddH₂O 30.5㎕, Template DNA 2㎕(약 100ng)였다.

PCR 반응에는 GeneAmp PCR system 2400(Perkin-Elmer Co., USA)기기를 사용하였고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 1분, annealing 60℃ 1분, extension 72℃ 1분을 한 cycle로 하여 35cycle을 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분으로 PCR 반응을 종료하였다.

이렇게 확보된 Myogenin 5' promoter region을 estriction mapper sofrware program을 이용해서 찾아낸 BspCNI 제한효소로 처리하였다. BspCNI enzyme 처리 첨가물은 BspCNI enzyme 2㎕(2 unit/㎕, NEB(New England BioLabs)), 10×Enzyme buffer 1.5㎕, 10×BSA 1.5㎕, 10×S-adenosylmethionine(SAM, 200㎛/㎕) 1.5㎕, ddH2O 5.5㎕, PCR product 3㎕로 총 volume이 15㎕였다. 이 혼합물을 25℃ Incubator에서 약 16시간동안 반응시키고, PAGE(Poly-acrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 그 band pattern을 확인하였다(도 3).

실시예 . 본 kit 를 이용한 표지유전자형 별 육량 및 육질형질 확인.

도 1에서 보는 바와같이, 본 발명 kit를 이용한 유전자형 분석 결과 나타나는 세 개의 유전자형인 TT, TC, CC 유전자형 별로 육량 및 육질형질과의 상관관계를 분석해 보았다. 전체 254 마리의 분석 결과 중에서 유전자형이 TT인 개체는 2마리밖에 관찰되지 않아서 분석대상에서 제외하였고, TC와 CC 유전자형을 비교 분석하였다. 통계분석 프로그램으로는 SAS 9.13 package에서 제공되는 SAS/GLM procedure를 이용하였고, 최소제곱평균(Least Squares Means)을 구하여 유의차를 평가하고 연관성을 분석하였다. 통계분석 모델은 다음과 같다.

Y_ijklm = μ + Geno_i + Sex_j + Season_k + Breed_l + e_ijklm

Y_ijklm = 각 형질의 측정치

μ = 전체 평균

Geno_i = Myogenin 5'promoter region의 유전자형 (i=1,2)

Sex_j = 성별의 효과 (j=1,2)

Season_k = 도축시기에 따른 계절 효과 (k=1,2,3)

Breed_l = 품종의 효과 (l=1,2)

e_ijklm = 임의 오차

표 1. 돼지의 성장 및 육질을 나타내는 형질의 측정치와 유전자형간의 상관관계를 분석한 결과

표 1은 돼지의 성장 및 육질을 나타내는 형질의 측정치와 유전자형간의 상관관계를 분석한 결과이다. 성장형질은 90kg 도달일령(Age at 90kg), 일당증체 량(Average daily gain), 도체율(Carcass percent), 등심근단면적(Back fat thickness), 등지방층 두께(Loin eye area), 육질형질은 보수성(Drip loss), 육색(Lightness) 이다.

표 1에서 보는 바와같이, 분석 결과는 등심근단면적(Back fat thickness)이 더 얇고, 등지방층두께(Loin eye area)가 더 두꺼운 것으로 관찰되는 TC 유전자형이 CC 유전자형에 비해 육량이 더 좋은 것으로 분석되어지고, 육질 항목인 보수성(Drip loss)와 육색(Lightness)에서 차이가 없는 것으로 보아 두 유전자형간의 육질 차이는 없었다. 따라서 근세포분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 발현조절역할을 할 것으로 예상되는 5‘ promoter region의 SNP는 돼지의 육량을 증가시키면서 육질에 차이를 주지 않는 선발 지표로서 활용될 수 있음이 입증된다. 또한 본 발명 kit가 이러한 DNA 표지인자의 탐색용 kit로써 활용될 수 있음도 입증되었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 명백히 보는 바와같이, 본 발명 돼지 근세포분화 관련 Myogenin 유전자의 5‘ promoter region에서 나타나는 SNP 부위는 돼지의 육질의 저하를 막으면서 동시에 육량을 증대시킬 수 있는 생물학적 표지자(Marker)로 사용될 수 있으며, 이를 탐색할 수 있는 kit는 이것의 이용을 통한 조기선발과 생산성향상 등의 이유로 인하여 돼지 육종산업에 매우 유용한 발명이 된다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> DNA marker for detecting increase of pig muscle-cell number <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward pcr primer for porcine myogenin 5' promoter region <400> 1 gctcagagga caagagtgta aaccc 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse pcr primer for porcine myogenin 5'promoter region <400> 2 gaagtagggg gatgtctcat acag 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal M5-1 reverse primer <400> 3 agtgttccca atacaggaag gtgaac 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal M5-2 forward primer <400> 4 gttcaccttc ctgtattggg aacact 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal M5-2 reverse primer <400> 5 cttaggtctc atgtgactgg ggataa 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal M5-3 forward primer <400> 6 ttaccccagt cacatgagac ctaag 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR_RFLP forward primer <400> 7 gttcaccttc ctgtattggg aacact 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR_RFLP reverse primer <400> 8 cttaggtctc atgtgactgg ggataa 26 <210> 9 <211> 2067 <212> DNA <213> Porcine myogenin 5'promoter region <400> 9 gtaaaccgag gtaaggattt tcttttcttt ttttttcttg gtgggatttg cgttaaaaat 60 atagattctt tttcagttca tctagacagg acaaagcaag gttatagcct acagccccca 120 gctgccactt tttattacac ttttttcatc tcaaaggcca agaaccaaat tacagacctt 180 gctactccac ctcgacatgc ttgggttttg aaaaaaaaat tgtctagttt tgtcccttcc 240 ttatctctgt tccttaccct gaaagacacc agcattttcc tggctcctca gcacaatgag 300 aggaagggaa gacaggtttt tcaagctcca ttcagatctt acctcccctg tgacgtcttc 360 cctgaatccc cagcacaatc tctcttcctc ttattgtcct tgtcactggt tagaatatct 420 gtctcatctg tcacaggaga agggatcaga cttagtcaaa cggtctaggg ggaaaaactg 480 ggacaaagat agaagctaga gggagcagac tgcagtcaaa accagaaggc ctcccttcac 540 atcaggggtt gggcttcttt gggtggccac cagggtctac tagacagtaa ggtcctcaag 600 ggcagagacc tgcttgggtc cccgtaatct tcagccataa gactgaacct tgttcactgc 660 ctgatccttg ttcaccttcc tgtattggga acactgtcct cttagactcc aaggtctctg 720 ctgagaggtg actatggact gagaagccca aagtttaagt agtcctcctc cacctgacat 780 ttgaacttag cacaatatat ataaaactaa tggctttgga gttccctggt ggcgcagtgg 840 gtttaggatc agtcatcact gcagcagctc agattgctga tgtggcacgg gtttggtgct 900 ggccaggaac ttcacatgct tggggcacag caaaaagaaa acgaaacaaa aactgaaggc 960 ttatgtggga agaccacaac aatacaagcc aagtggtaag gagagggcat attaaatgga 1020 gtttgaaggt ctctcttttc tttccttccc accacaccca cagtaaggag ccaggaaaac 1080 cctagtattc aaaaggggta ggagacaaag ttgaagaggt gacataggag gacaaaacaa 1140 atgattcagg gtgagaaagg gcctaataga tcttgacctt gtcattgtgg ggaaggtggt 1200 gatgtgcaga ctgtaaattc taatctttgc tctgaccctg gccagctgta ttagagagaa 1260 aacttccact gctccggcaa aaaggaaaaa cagaaccaaa atattcctct tgcctcaatt 1320 tatccccagt cacatgagac ctaagagcat gatgtcaaag ctgctctgaa accccaaaat 1380 tgagttcatt tgcccacatt tcaatcttct tacccaggac actgagtacc aatacctgcc 1440 tctaatttga agcactctca ccctctgggg ggggatcttt ttttaagaga gtctcatctg 1500 actgacacag tctgggtaag gtgctgtgag gaagcagggg gatgcataaa ctgacttctc 1560 caggcccctt ccagcctaca cctacccccc cccccgcctc acccccaccc ccactggctt 1620 ctttgggact ggcgagtagg caggcgccca gctaggagta attgaaagga gcagatgaga 1680 ggagaatgtg tgtcctcccc cacctcccca gccccatggg ggctgcagag aaatgaaaac 1740 taatcaaatt acaccctatg gcctccttac ccgtgcacag gagcctgctg ggggcagggg 1800 caggctggct gtggggaggg ggggtgcagg gggagaggga aggggaatca catctaatcc 1860 actgtaaacg tcttgatgtg cagcaacagc ttagaggggg ctcaggtttc tgtggcgttg 1920 gctatattta tctctggttc catgccagcg gggagggttt aaatggcacc cagcagttgg 1980 cgtgaggggc tgcaggagct tgggggctgg tggcaggaac aagtcttttc tgaccccatg 2040 gaggtgtatg agacatcccc ctacttc 2067

Claims

서열번호 9의 염기서열에서 788번째 T 염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 돼지의 근세포수 증가여부 확인용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 돼지의 근세포수를 증대시키면서 육질을 저하시키지 않게 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 7과 서열번호 8로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성되는, 돼지의 Myogenin 유전자의 5′promoter region의 근세포수 증가 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머.
제 3항의 프라이머와 PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 BspCNI를 포함하는 돼지의 근세포수 증가 관련 SNP 분석용 킷트.
하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 근세포수 증가여부 확인 방법:

(a) 돼지로부터 genomic DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로하여 Myogenin 유전자의 5‘ promoter region의 SNP가 포함된 특정부위를 증폭시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 BspCNI로 처리하는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 얻어진 유전자 단편들의 다형성(RFLP;Restriction Fragment Length Polymorphism)을 비교하는 단계.
제 5항에 있어서, 상기 (b)단계에서 서열번호 7과 서열번호 8로 표시된 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 돼지의 근세포수 증가여부 확인 방법.