KR20070066352A - 초위성체 표지인자를 이용한 한우육의 판별방법 - Google Patents

초위성체 표지인자를 이용한 한우육의 판별방법 Download PDF

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김종주
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박응우
이승환
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Abstract

본 발명에 따른 한우육 및 수입우육의 판별방법은 선정된 소의 초위성체 표지인자들에 대응하는 대립유전자들을 증폭하기 위한 유전자 증폭(PCR) 반응액을 조성하는 단계, 상기 조성된 반응액을 다단계로 이루어진 다중 유전자증폭반응(다중 PCR반응) 시킴으로써, 상기 대립유전자들을 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 각각의 대립유전자를 분리하고 상기 대립유전자의 크기를 분석하는 단계, 상기 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 품종별 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계, 및 상기 표지인자에 대응한 대립유전자들의 정보은행을 구축하여 통계분석에 의하여 품종식별을 하는 단계를 포함한다. 상기 판별방법에 의하면 DNA 수준에서 한우와 수입우육을 판별할 수 있고, 그 정확도가 매우 우수하다.

Description

초위성체 표지인자를 이용한 한우육의 판별방법{Molecular genetic method for the identification of Hanwoo meat by microsatellite loci}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 게놈 DNA를 추출하여 형광염색된 초위성체 표지인자의 프라이머들을 이용하여 다중 PCR증폭하고 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 사진이다.
본 발명은 한우육과 수입우육과 구별하기 위한 유전자 감식 방법으로서, 더욱 자세하게는 DNA 수준에서 한우 및 수입우의 판별을 위한 초위성체(microsatellites) 표지인자들의 조합 및 이들 조합을 이용한 유전자 감식방법에 관한 것이다.
일반적으로 선진국에서는 쇠고기의 부정유통 및 광우병 또는 다른 질병 등을 방지하기 위하여 원산지를 추적할 수 있는 방법이 이용되고 있는데, 유럽의 경우 원산지로부터 개체 식별이 된 소만이 도축되거나 이동될 수 있도록 의무적으로 이표(귀에 부착된 바코드 표식)를 달도록 제도화하고 있으며 도축 후에는 생축에서 확인된 바코드 번호가 연계되어 상품에 부착됨으로 인해 유통점에서 쇠고기의 원산 지가 추적되는 시스템을 채택하고 있다. 그러나 우리나라 및 일본 등지에서는 외국산 쇠고기와 국내산 쇠고기 및 한우 쇠고기의 가격차이가 매우 높기 때문에, 의도적으로 도축 후에 한우 및 한우 이외의 품종임을 증명하는 서류 등을 부정하게 사용하여 유통질서의 문란을 초래하고 있다. 또한 의도적이지 않는 경우에도 소의 개체 식별체계(이표)의 오류 등의 원인으로 완벽한 한우육 및 수입우육 등의 정보가 연계되지 못하고 있다. 이에 몇몇 나라에서는 유전자 감식 기법의 도입을 통한 소 품종식별 및 원산지 정보의 진위 여부을 시도하고 있다.
소의 게놈(genome) 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 소의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 한우의 개체 식별을 위해서는 한우의 특이적인 유전양상에 근거한 표지인자를 선정하여, 이들을 활용한 유전자 감식 기법을 설정하는 것이 매우 중요하다. 또한, 현재 개발된 일부의 초위성체 표지인자들은 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있는 실정이고, 우리나라로 수입되는 다양한 소 품종에 대한 초위성체 표지인자들의 원시 유전자정보가 없기 때문에, 좀더 다양하고 유용한 초위성체 표지인자들을 선별하여 한우 품종 식별을 위한 방법을 개발할 필요가 있다.
DNA 분석에 의한 소 품종을 구분할 수 있는 기술개발에 대한 연구보고는 몇몇 국내 연구진들에 의해 보고된 바 있다(홍 등, 1998; 조 등, 1996; 이 등, 1994). 이 등(1994)은 RAPD 분석방법에 의한 한우와 젖소의 판별기술 개발에 대한 보고가 있었으나 신뢰도가 평균 95%이하였고, 홍 등(1998)이 보고한 SCAR 마커는 이전 방법보다 신뢰도 및 재현성에서는 비교적 높은 기술임을 인정 받았으나, 이 역시 정확도에 있어서는 100%에 못미침으로 인하여 만족할 만한 신뢰를 얻지 못하였다. 한편 김 등(2000)이 개발한 방법은 소의 모색에 관련하는 유전자로부터 품종구별을 위한 유전자 감식기법을 개발하였으나, 이는 한우와 홀스타인 종의 젖소, 즉 황갈색과 검정색의 모색을 구분할 수 있으나, 한우와 같은 모색의 리무진종이나 모색이 흰색이 샤로레종 등은 구분이 불가능하다.
일반적으로 가축의 종 식별, 품종식별, 친자감별 등에 있어서의 유전자 감식법에는 1990년대 들어 비약적으로 그 기술이 발전된 PCR을 이용한 AFLP (Amplification Fragment Length Polymorphism) 방법이 사용되고 있으며, 보다 간단하면서도 정확한 DNA 타이핑을 위해 초위성체 표지인자가 유전자 감식의 마커로서 아주 유용한 것으로 확인되었다.
상기 초위성체 표지인자는 Short Tandem Repeat(STR) 또는 Simple Sequences Repeat (SSR)이라고도 불리어 지며, 이들은 대개 2 내지 6개의 염기쌍의 짧은 반복서열로 구성되어 있는데, 개체마다 표지인자들의 유전자형 조합에 특이성을 나타내므로 충분한 수의 표지인자와 조합으로 품종식별은 물론 개체식별도 가능하다. 한편, 유전자 감식기법의 정확성 및 신속성을 높이기 위해서는 많은 초위성체 표지인자를 대상으로 조사가 수행되어야 하는데, 많은 초위성체를 대상으로 유전자 감식을 수행할 경우에는 수많은 초위성체 표지인자들 마다의 대립유전자 확인에 따른 시간과 인력의 소모라는 문제점이 있었다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 한 번의 PCR 반응에 여러 표지인자의 프라이머를 넣고 동시에 반응을 수행하는 다중 PCR (multiplex-PCR) 방법이 대안으로 제시되고 있다. 예를 들어, 3개의 초위성 체 표지인자의 반응을 동시에 수행하는 트리플렉스 시스템(triplex system)을 사용할 경우 소요시간, 시약, 장비 및 인력을 3분의 1정도로 줄일 수 있게 된다. 이와 같이 다중 PCR 방법이 갖는 장점 때문에 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 다중 PCR 방법을 확립하는데 박차를 가하고 있으며, 이러한 방법은 인간의 친자감별 및 범죄수사 등에서도 개발 및 이용되고 있는 실정이다. 이러한 다중 PCR방법 및 각 증폭된 유전자좌위들의 대립유전자 크기에 따른 분포도를 이용하여 한우 및 수입되는 소 품종별 유전자정보은행을 구축하면 한우육 및 수입우육의 판별이 가능하게 하는 근간을 이루게 된다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서는 독자적인 유전자정보은행의 구축을 위해 한우 품종집단에 맞는 초위성체 유전자 좌위들의 선별과 유전자감식법의 개발이 절실히 요구되어 왔다. 특히, 초위성체 유전자 좌위들의 확인을 기존의 은염색(silver staining)법이 아닌 형광염색 프라이머를 이용하면, 유전자좌위의 증폭산물의 크기와 다른 유전자좌위의 증폭산물의 크기가 중복될 경우에도 확인을 가능하게 하며 동일 염색체에 존재하는 유전자 좌위들만을 선택할 경우 유전자좌위들의 연관(linkage)에 의해 판별력에 있어 정확성이 떨어지기 때문에 각기 다른 염색체에 존재하는 유전자 좌위들의 선정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 매우 중요한 의미를 갖고 있다.
본 발명의 목적은 한우육의 판별을 위하여 한우 집단에서 특이적으로 발현되는 초위성체 표지인자들을 선정하여 제공하고, 이들 표지인자들의 다중 PCR방법 을 제시하고 이를 통한 표지인자들의 유전자좌위 조합을 구성하여 수입되는 쇠고기를 한우육과 판별하기 위한 유전자 감식방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 아직까지 확립되지 않은 한우육의 유전자 감식 방법에 있어서, 한우 집단에서 특이적으로 발현되는 초위성체 표지인자들에서 선정된 각각의 프라이머들을 형광염색하고, 다중 PCR반응의 조건을 확립하여 다중 PCR 반응을 위한 반응액을 조성하고, 조성된 반응액을 순차적인 단계로 특정 온도조건에서 다중 PCR 반응을 실시하여 표지인자에 대한 각각의 대립유전자를 증폭하는 단계와 증폭된 각각의 대립유전자를 5%의 아크릴아미드 겔 또는 모세관을 이용하여 전기영동으로 분리하고, 상기 대립유전자의 수와 크기를 분석하는 단계, 및 상기 대립유전자의 수와 크기를 수치 정보 표기로 전환하여 한우육 및 수입우육을 판별하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 특징에 따른 한우육 및 수입우육의 판별방법은 선정된 소의 초위성체 표지인자들에 대응하는 대립유전자들을 증폭하기 위한 유전자 증폭(PCR) 반응액을 조성하는 단계, 상기 조성된 반응액을 다단계로 이루어진 다중 유전자증폭반응(다중 PCR반응) 시킴으로써, 상기 대립유전자들을 유전자 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 각각의 대립유전자를 분리하고 상기 대립유전자의 크기를 분석하는 단계, 상기 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 품종별 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계, 및 상기 표지인자에 대응한 대립유전자들의 정보은행을 구축하여 통계분석에 의하여 품종식별을 하는 단계를 포 함한다.
상기 선정된 초위성체 표지인자는 ILSTS005, ILSTS013, ILSTS028, ILSTS103, ILSTS006, ILSTS008, ILSTS023, ILSTS050, TGLA122, TGLA126, MGTG4B, TGLA227, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, SPS115 등이다. 상기 표지인자들은 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
특히 상기 유전자 증폭 반응액은 ETH225, ETH10, ETH3, BM2113, BM 1824 및 SPS115의 조합으로 이루어진 초위성체 표지인자들의 정방향 및 역방향 프라이머들을 포함할 수 있다. 이 경우 상기 유전자 증폭 반응액 내의 상기 프라이머들의 함량은 각각 3.0 내지 4.0 pmole%인 것이 바람직하다. 또한 상기 조합 하에서 상기 다중 유전자 증폭반응 중 일부 단계는 59 내지 63℃의 온도에서 진행되는 것이 바람직하다.
상기와 다르게 상기 유전자 증폭 반응액은 하기 식 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 조합으로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머들을 포함할 수 있다.
ILSTS013 + ILSTS028 ------------ (1)
ILSTS050 + ILSTS023 + ILSTS006 ------------ (2)
TGLA227 + TGLA126 ------------ (3)
MGTG4B + ILSTS008 ------------ (4)
TGLA112 + ILSTS005 + ILSTS103 ------------ (5)
상기 조합들의 경우, 다중 유전자 증폭반응 중 일부 단계는 51 내지 58℃의 온도 하에서 진행되는 것을 바람직하다.
상기 초위성체 표지인자는 대립유전자의 수가 6개 이상이고, 상기 대립유전자의 크기가 78 내지 303 bp이며, 이형성 비율이 50% 이상인 것으로 선정되는 것이 바람직하다.
상기 대립유전자는 4 내지 6%의 폴리아크릴아미드 겔 또는 모세관을 이용한 전기영동에 의하여 분리된다.
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다.
1. 공시재료
한우는 농촌진흥청 축산연구소, 농협 한우개량사업소 및 전국농가에서 사육된 개체들을 대상으로 채혈을 하였고, 우리나라의 대표적인 수입우육 품종인 앵거스, 헤어포드, 심멘탈, 브라운스위스 및 리무진은 미국에서 수입된 종모우의 동결정액을, 홀스타인 및 샤롤레는 제주도 제동목장에서 사육된 개체들의 혈액을 채취하거나, 국제축산연구소(케냐 나이로비 소재)에서 DNA상태로 분양받았다. 중국 소 품종인 연변우, 노서우 및 난양우는 중국 농업과학원 축목연구소(중국 베이징 소재), 일본 흑모화우 및 갈모화우는 일본 축산시험장(일본 쯔쿠바 소재), 아프리카 지역의 Bos indicus 소 품종인 Kavirondo Zebu와 White Fulani, 아시아 Bos indicus인 사히왈은 국제축산연구소에서 각기 DNA 상태로 분양 받아 본 발명에 사용하였다. 이번 발명에 이용된 소 품종들의 주 사육지, 공시시료수 및 시료 구입방법 등에 대해서는 표 1에 나타내었고, 총 16품종 471두이었다.
Figure 112005075122882-PAT00001
2. DNA 분리 및 농도측정
소 혈액에서의 게놈 DNA(genomic DNA) 분리 및 정제는 밀러(Miller)(1988) 등의 방법을 다소 변경하여 수행하였는데, 변경된 방법은 다음과 같다. 채혈된 전혈에서 백혈구(buffy coats)를 원심분리에 의해 회수하여, 0.14 M NH4Cl을 첨가하여 혼합한 후, 다시 원심분리하여 적혈구에 의한 붉은 색이 띄지 않을 때까지 원심분리관의 바닥에 모인 백혈구층을 회수하였다. 뉴클레이 라이시스 버퍼(Nuclei lysis buffer) (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 2 mM Na2EDTA, pH 8.2)를 첨가하여 격렬하게 혼합한 다음, 10% SDS와 proteinase K를 첨가하여 37℃의 항온수조에서 16시간 가량 배양하였다. 배양된 각 시험관에 포화 NaCl을 첨가하고 원심분리를 실시한 후, 상층액을 새로운 15 ml 시험관에 옮겨 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 DNA 가닥이 엉키도록 용액을 조심스럽게 혼합하여 유리봉이나 피펫팁으로 엉킨 DNA를 깨끗한 1.5 ㎖ 미세원심분리관(microcentrifuge tube)에 옮겨 70% 에탄올로 세척을 실시한 후 건조된 DNA 펠렛들을 3차 증류수에 용해하였다.
동결정액에서의 Genomic DNA 분리 및 정제는 샘브룩(Sambrook)(1989) 등의 방법을 다소 변경하여 수행하였다. 동결정액을 얼음 위에서 녹여 1.5 ㎖의 미세원심분리관에 옮기고 4℃, 8,000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시한 후, 상층액을 제거하고 0.9% NaCl과 1 mM EDTA를 첨가하여 완전히 부유시켰다. 부유액을 SDS buffer (5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 10% SDS), proteinase K, 1 M DTT가 들어 있는 15 ㎖ 원심분리관(centrifuge tube)에 소량씩 넣어주어 잘 섞은 후 55℃의 항온수조에서 약 16시간 배양한 후, RNase A를 첨가하여 37℃의 항온수조에서 2시간 반응시키고, 3 M 소듐 아세테이트(sodium acetate)(pH 5.2)를 1/20 부피로 첨가한 후, 잘 혼합하여 주고 같은 량의 페놀(phenol)을 넣고 10분간 잘 섞어주었다. 이후, 상기 혼합물을 8,000 rpm, 10분간 원심분리하고 상층액을 회수하였다. 회수된 량의 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 DNA가 엉키도록 조심스럽게 튜브를 뒤집어면서 섞어주었다. 엉킨 DNA을 70%의 에탄올로 세척하고, DNA펠렛을 건조시켜 3차 멸균증류수에 용해하였다. 분리 정제된 DNA 및 분양받은 DNA시료들은 DNA/RNA 분광계(Spectrophotometer)[제품명:GeneQuant II, 파마시아 바이오텍사(Pharmacia Biotech, Ltd.) 제조] 및 아가로오스겔(Agarose gel) 전기영동을 실시하여 농도 및 상태를 확인하고 PCR에 공시하였다.
3. 대상 표지인자 및 PCR 증폭용 프라이머 제작
본 발명에서 사용한 DNA 마커로는 초위성체 표지인자(microsatellite loci)를 이용하였으며, 선정된 초위성체 표진인자들의 PCR 증폭을 위해 정방향 프라이머들에 6-FAM, HEX, TET의 화학물질 중 한가지로 형광 표지된 올리고뉴클레오티드(flourescent labelled oligonucleotide)를 (주)정화과학(서울)에 주문하여 제작하였다. 본 발명에 사용한 초위성체 표지인자의 소 염색체 위치, 프라이머 염기서열, 형광염색방법 등의 정보는 표 2에 나타내었다.
Figure 112005075122882-PAT00002
4. 다중 PCR (Multiplex PCR)
PCR증폭 반응은 형광 염색된 초위성체 표지인자의 형광염색종류와 이의 대립 유전자의 크기별 분포를 고려하여 다중 PCR을 수행하였고, 18종에 대한 유전자형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 초위성체의 유전자 표지를 인지하기 위한, 형광 물질을 유전자 증폭 프라이머에 부착하였다.
[실시예1]
다중 PCR 반응을 위해 상기 표 2에서 제시된 프라이머들중 ETH225, ETH10, ETH3, BM2113, BM1824 및 SPS115의 초위성체 표지인자들의 조합으로 PCR증폭을 실시하였는데, 여기에서 반응조건은 10X PCR buffer (100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25% nonidet P40 and 20mM MgCl2) 3.0 ㎕, 1.25 mM dNTPs 4.0 ㎕, 상기 6종류 초위성체 표지인자의 프라이머 혼합액 (각 프라이머당 10 pmole의 농도로 동량을 혼합한 것)의 5.5 ㎕, 0.5 unit의 Taq DNA중합효소 (TaKaRa) 및 50 ng의 genomic DNA를 혼합하여 반응액의 총량이 15.0 ㎕가 되게 하였다.
상기 혼합물을 GeneAmp 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 95℃ 에서 15분간 첫 반응을 시작하여, 94℃에서 45초, 61℃에서 45초, 72℃에서 1분의 반응을 한 사이클로 하여 31회 반복반응을 실시하고 마지막으로 신장반응을 위해 72℃에서 1시간 실시하고, 25℃에서 2시간 방치하여 반응을 완료하였다.
[실시예2]
상기 표2의 초위성체 표지인자들중 다중 PCR증폭을 위한 반응조건을 설정하였는데, 설정된 표지인자들의 조합은 표 3에서 보는 바와 같다.
Figure 112005075122882-PAT00003
표 3의 초위성체 표지인자들의 조합에 의한 다중 PCR증폭 조건은 10X PCR buffer (100 mM Tris--HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25% nonidet P40 and 15 mM MgCl2) 1.5 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1.5 ㎕, 상기 표 3의 초위성체 조합별 형광염색 프라이머 10 pmole의 0.2 ㎕, 1 unit의 Taq DNA중합효소 (Promega) 및 50 ng의 genomic DNA를 혼합하여 반응액의 총량이 15.0 ㎕가 되게 하였다.
상기 혼합물을 Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA)을 이용하여 95℃에서 15분간의 첫 반응을 시작으로 95℃에서 45초, 상기 표 3의 초위성체 조합별 반응온도에서 1분, 72℃에서 1분으로 총 35회 반복 반응을 실시하고, 마지막으로 신장반응은 72℃에서 1시간 실시하고, 25℃에서 2시간 방치하여 반응을 완료하였다.
상기 실시예1 및 실시예2에서 반응이 종료된 다중 PCR증폭산물에 대해서는,
각각의 다중 PCR 수행후, PCR 증폭산물들과 로딩 혼합액을 일정비율로 혼합하였는데, 여기에서의 로딩 혼합액은 탈이온된 포름아미드(deionized formamide) 210.0 ㎕, 로딩 완충용액(loading buffer) 50.0 ㎕ 및 표준용액(GeneScan 350-TAMRA internal size standard) 50.0 ㎕을 포함하였다. 이렇게 조성된 로딩 혼합액 2.0 ㎕와 각각의 다중 PCR 증폭산물 0.8 ㎕와 혼합하여 잘 섞은 후, DNA 시퀀서[제품명: ABI PRISM 377 sequencer, 미국 바이오시스템스사 제조(Biosystems, USA))에 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하였다. 유전자스캔 분석 소프트웨어(Genescan analysis software)(미국 바이오시스템스사 제조)를 이용하여 각 PCR 증폭된 초위성체 표지인자들을 3차원 최소자승법(Third order least squares method)으로 분석하였고, 유전자형 분석 소프트웨어(Genotyper analysis software)(미국 바이오시스템스사 제조)를 이용하여 초위성체 표지인자 유전자좌위(loci)별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.
그 결과, 각 초위성체 표지인자별로 대립유전자(allele)의 크기 분포, 분석된 소 전체 품종에 대한 대립유전자의 수, 한우에서의 대립유전자의 수, 기대이형성(expected heterozygosity) 및 유전적 분화정도를 표 4에 나타내었다. 여기에서 기대이형성은 다음과 같이 계산하였다.
Figure 112005075122882-PAT00004
상기 수학식 (1)에서 i 는 I 번째 대립유전자, 즉 초위성체 표지인자 마다의 특정 대립유전자이고, q는 대립유전자의 수, 즉 각 초위성체 표지인자에서 검출된 대립유전자의 수이며, Pi는 i번째 대립유전자의 빈도를 나타낸다.
Figure 112005075122882-PAT00005
상기의 초위성체 표지인자 좌위별 크기를 소 품종별 및 개체별로 기대이형성 및 실제의 관측이형성을 상기의 방법으로 산출하였고, 또한 품종별 각 유전좌위별 평균대립유전자 수를 계산하여 표 5에 제시하였다.
Figure 112005075122882-PAT00006
상기의 방법으로 18개의 초위성체 표지인자 좌위에 따른 개체별의 대립유전자에 대한 대립유전자 정보은행을 구축하였고, 구축된 대립유전자의 정보로부터 한우 및 우리나라의 대표적인 수입우육의 품종에 대한 초위성체 표지인자별 대립유전자의 크기에 따른 빈도들을 표 6에 제시하였다.
Figure 112005075122882-PAT00007
Figure 112005075122882-PAT00008
Figure 112005075122882-PAT00009
Figure 112005075122882-PAT00010
Figure 112005075122882-PAT00011
본 발명에서 선정된 초위성체 표지인자를 이용하여 한우 및 수입우육의 품종식별에 대한 통계분석은 본 자료 특성과 품종 분별의 정확도 및 신뢰도를 높이기 위하여 베이지안 방법(Rannala & Mountain, 1997)과 Monte Carlo resampling method (Paetkau et al. 1994)을 적용한 Geneclass2 프로그램을 이용하여 수행하였다. 이를 통하여 품종배제력(exclusion power) 및 품종할당력(inclusion power)의 통계량을 추정하였다. 그 결과 한우 모든 개체들은 한우 품종에 속할 확률(품종할당력)이 다른 품종에 속하는 경우보다 월등히 높았으며 (예: 100(한우품종):0(다른품종)% 또는 99:1% 한우품종 할당력), 다른 품종에 속한 모든 개체들은 한우 품종으로 할당될 확률(품종배제력)이 모두 30%로 이하로 나타나 한우 품종 개체들이 다른 품종 개체들과 확연히(100%) 구분되는 품종 배제력에 대한 임계값을 얻을 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명은 한우 집단 및 외국소 품종에서 특이적으로 발현되는 초위성체 표지인자들을 분석하는 기법으로 이를 통한 각 개체가 고유로 가지고 있는 대립유전자 정보들을 활용하여 도축 이후의 유통 및 소비단계에서 외관상 구별이 어려움을 해결하는 유전자 감식기법을 제공하게 되었다.
이에 따라, 본 발명은 쇠고기의 유통질서 확립 및 안정성을 높여줌으로써 한우농가의 경영, 수익성 및 소비자의 신뢰성이 향상되는 효과를 나타내게 된다.
또한 본 발명으로 한우의 순수성 복원을 위한 유전자수준에서의 검사에도 이용 가능할 것이다.
이상 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 선정된 소의 초위성체 표지인자들에 대응하는 대립유전자들을 증폭하기 위한 유전자 증폭(PCR) 반응액을 조성하는 단계;
    상기 조성된 반응액을 다단계로 이루어진 다중 유전자증폭반응(다중 PCR반응) 시킴으로써, 상기 대립유전자들을 유전자 증폭시키는 단계;
    상기 증폭된 각각의 대립유전자를 분리하고 상기 대립유전자의 크기를 분석하는 단계;
    상기 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 품종별 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계; 및
    상기 표지인자에 대응한 대립유전자들의 정보은행을 구축하여 통계분석에 의하여 품종식별을 하는 단계를 포함하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 초위성체 표지인자는 ILSTS005, ILSTS013, ILSTS028, ILSTS103, ILSTS006, ILSTS008, ILSTS023, ILSTS050, TGLA122, TGLA126, MGTG4B, TGLA227, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, SPS115로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응액은 ETH225, ETH10, ETH3, BM2113, BM 1824 및 SPS115의 조합으로 이루어진 초위성체 표지인자들의 정방향 및 역방향 프라이머들을 포함하는 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응액 내의 상기 프라이머들의 함량은 각각 3.0 내지 4.0 pmole인 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 다중 유전자 증폭반응 중 일부 단계는 59 내지 63℃의 온도에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응액은 하기 식 (1) 내지 (5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 초위성체 표지인자 조합으로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머들을 포함하는 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
    ILSTS013 + ILSTS028 ------------ (1)
    ILSTS050 + ILSTS023 + ILSTS006 ------------ (2)
    TGLA227 + TGLA126 ------------ (3)
    MGTG4B + ILSTS008 ------------ (4)
    TGLA112 + ILSTS005 + ILSTS103 ------------ (5)
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 다중 유전자 증폭반응 중 일부 단계는 51 내지 58℃ 의 온도 하에서 진행되는 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 초위성체 표지인자는 대립유전자의 수가 6개 이상이고, 상기 대립유전자의 크기가 78 내지 303 bp이며, 이형성 비율이 50% 이상인 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 대립유전자는 4 내지 6%의 폴리아크릴아미드 겔 또는 모세관을 이용한 전기영동에 의하여 분리되는 것을 특징으로 하는 한우육 및 수입우육의 판별방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101008941B1 (ko) * 2007-10-05 2011-01-17 경상대학교산학협력단 멀티플렉싱 피씨알에 의한 한우와 수입우의 판별방법 및이에 사용되는 프라이머

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