KR100974645B1 - 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 판별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한우 고유의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위와 mismatch 부위를 탐색하기 위하여 제작된 신규 프라이머 세트 및 이를 이용하여 수행한 PCR 결과를 분석하여 한우와 수입소을 구분하는 한우 판별방법으로서, 시중에 유통되는 다양한 품종의 수입육으로부터 한우육을 신속하고 간편하게 판별할 수 있어 한우의 유통 및 검색과정에서 효과적으로 사용될 수 있다.
삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위, mismatch 부위, 프라이머, 한우
Description
본 발명은 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 판별방법에 관한 것이다.
최근 국민경제의 성장, 소득의 증대와 더불어 한국인의 식생활이 급격히 서구화 되어가는 경향을 보임에 따라 육류의 소비가 증가되었으며, 이러한 추세와 함께 쇠고기의 수요 역시 증가되었다. 한편, 쇠고기 시장이 완전 개방됨에 따라 수입 쇠고기가 무차별적으로 국내 시장에 들어오게 되었고, 한우육에 비해 상대적으로 값이 저렴한 수입 쇠고기는 빠르게 국내 쇠고기 시장을 장악하고 있다.
이러한 상황에 대한 국내 축산 농가의 대응전략은 고가의 고품질 한우육 생산을 통하여 수입 쇠고기와 차별화를 꾀하는 것이다. 이와 같은 한우육의 고품질화는 한우육과 수입 쇠고기의 가격 격차를 심화시켰으며, 이러한 가격 격차로 인하여 값싼 수입 쇠고기가 고가의 한우육으로 둔갑 판매되는 유통 부조리 사례가 빈번하게 일어나게 되었다. 실례로, 대형 할인마트를 비롯한 백화점 등에서 젖소고기 및 수입육을 한우육과 혼합하여 한우고기 선물세트로 만들어 판매하는 등의 둔갑 판매와 관련된 여러 사례들이 보도되었다.
둔갑 판매는 한우육의 대외 경쟁력을 약화시키는 또 하나의 원인으로 지적되고 있다. 이를 근절하기 위하여 식육거래기록의무제(거래내역 비치제)가 실시와 더불어 정부의 지속적인 단속이 수행되었으나, 둔갑 판매는 근절되지 않는 것으로 나타났다. 그 이유 중 하나가 과학적이고 객관성이 담보된 한우육과 수입 쇠고기의 판별기술의 부재이다. 즉, 순수 한우육과 젖소고기 및 수입육을 명확히 구별할 수 있는 한우육 판별 기술의 개발이 둔갑 판매를 근본적으로 차단하고, 한우 사육농가 및 쇠고기 시장보호를 위하여 절실히 필요하다. 한편, 소의 품종은 외형적 특징인 모색이나 체형 등에 구별하는 것이 일반적이다. 따라서, 도축하여 고기 형태로 전환된 소에서 품종구별은 사실상 불가능하다.
최근 분자생물학과 유전자 분석 기술의 발달과 함께, DNA 염기서열의 차이를 이용한 동종 내 품종 판별 기술들이 제시되었다. 이러한 판별 기술들은 DNA의 다형성(polymorphism)을 기초로 하며, 구체적인 예로는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), DNA 지문 감식법(AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism), 붕괴촉진인자(DAF, Decay Accelerating Factor), 마이크로새틀라이트(Microsatellite), RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)와 RAPD 프라이머의 염기서열 일부를 신장시킨 SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions) 프라이머 등을 이용한 판별 기술들이 있다.
그러나, 이러한 판별 기술들 역시, 한우육을 판별하기 위한 실제적인 방법으 로 문제점을 가지고 있다. 구체적인 예로, 상기한 식별 기술 중 RAPD를 이용한 한우육 판별법(민병록, 이무하, 한재용, RAPD 기법을 이용한 쇠고기의 품종(한우육, 육우육(Holstein육), 수입우육) 구분, 한국축산학회지 Vol. 37(6): 651-660 (1995))은 PCR 증폭조건의 민감성 문제로 인하여 결과의 재현성 및 정확성이 낮으므로 실용화가 곤란하다는 문제점을 가지고 있다.
또한, 이러한 RAPD 판별번의 개성방법인 RAPD 프라이머의 염기서열을 일부 확장한 한우 특이 SCAR 프라이머를 이용한 한우 판별법(홍영호, 정일정, 김태헌, 김희발, 윤두학, 김형선, 조병욱, 한재용, 품종 특이성을 이용한 한우 판별 표지인자 개발, 한국동물유전육종학회지 Vol 2(2):107- 114(1998))은 RAPD 기법을 이용한 판별법에 비하여 비교적 안정한 것으로 인정되었으나, 이 또한 판별 신뢰도에서 문제점이 지적되었다.
또한, 최근에는 흑모색과 적모색 발현에 관여하는 것으로 알려진 MC1R (Melanocortin 1 Receptor)유전자를 이용한 판별 기술들이 제시되었다.
구체적인 예로는 Bse118Ⅰ, MspⅠ 및 Aci Ⅰ등의 3가지 제한 효소를 이용한 PCR-RFLP를 수행하는 한우 판별법(김태헌, 윤두학, 박응우, 이혜영, 오성종, 정일정, 탁태영, 김경남, 한재용, 소 품종별 Melanocortin Receptor 1 (MC1R) 유전자의 유전자형 빈도에 관한 연구, 한국동물자원과학회지 Vol 42(6):735-744 (2000))과 BsrFⅠ과 MspⅡ의 2가지 제한 효소를 이용한 PCR-RFLP 방법(정의룡, 김우태, 김연수, 한상기, 소 모색관련 유전자 MC1R의 PCR-RFLP marker를 이용한 한우육 판별, 한국동물자원과학회지 Vol 42:379-390(2000))이 발표 되었다.
이러한 MC1R 유전자를 이용하는 한우육 판별법은 한우육을 젖소고기(Holstein종)와 일부 수입육(black Angus종)과 구분하는데는 매우 효율적이고 경제적이지만, 국내에 수입되는 다양한 품종의 수입육 중 상기 수입육을 제외한 다른 수입육 특히, 한우와 비슷한 모색을 가진 리무진 종, 모색이 밝은 황갈색에서 진한 적갈색의 모색을 가진 심멘탈 종 또는 한우와 젖소(Holstein 종)의 교잡종의 고기와 한우육을 구분할 수 없다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기한 바와 같이, 기존의 한우육과 수입육을 판별하는 방법이 갖는 문제점을 해결하여, 다양한 품종의 수입육과 한우육을 신속하고 정확하게 판별하기 위한 신규한 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우육 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한우 선별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 한우 선별용 프라이머 세트를 이용하는 한우육과 수입육을 구분하는 한우육 판별방법을 제공한다.
본 발명자는 한우의 DNA 염기서열과 외국소의 DNA 염기서열을 비교·분석한 결과, 한우에 존재하는 고유의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위와 mismatch 부위를 확인하고 이를 탐색할 수 있는 프라이머 세트를 제조하고 이를 이용하여 한우와 외국소의 고기를 판별하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 한우(Hanwoo)란 한국 고유의 소품종으로서 수 천년동안 한국 풍토에 적응하여 그에 적합한 체질로 고정되었으며 역용(일소) 또는 육용으로 사육되는 가축을 의미한다.
본 발명에 있어서, 한우 고유의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위와 mismatch 부위는 외국소의 게놈데이터(genome Data)와 비교?검색한 결과 한우 특이적 또는 한우에 우세적으로 나타나는 삽입 또는 결실 부위나 mismatch 부위를 의미한다.
본 발명은 한우 선별용 프라이머 세트를 제공한다.
상세하게는, 상기 한우 선별용 프라이머 세트는 본 발명은 외국소와 구분되는 한우 고유의 삽입-결실 부위(Indel, Insertion and Deletion)나 mismatch 부위를 이용하여, 한우육과 수입육을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 의미하며, 바람직하게는 한우육과 수입육을 구별할 수 있도록, 한우육의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
구체예에 있어서, 서열번호 1에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 1에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 1에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제1 프라이머와 서열번호 1에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 1에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 1에 나타낸 염기 서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제2 프라이머 로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제1 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제2 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 10의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 2에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 2에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 2에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제3 프라이머와 서열번호 2에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 2에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 2에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제4 프라이머 로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제3 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제4 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 12의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 13의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 3에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 3에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 3에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제5 프라이머와 서열번호 3에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 3에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 3에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제6 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제5 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제6 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 14의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 15의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 4에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택 된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 4에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 4에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제7 프라이머와 서열번호 4에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 4에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 4에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제8 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제7 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제8 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 16의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 5에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 5에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 5에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제9 프라이머와 서열번호 5에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 5에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 5에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제10 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제9 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제10 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 18의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 18의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 19의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 6에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 6에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 6에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제11 프라이머와 서열번호 6에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 6에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 6에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제12 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제11 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제12 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 20의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 21의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 7에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 7에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 7에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제13 프라이머와 서열번호 7에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 7에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 7에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제14 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제13 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제14 프라 이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 22의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 22의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 8에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 8에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 8에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제15 프라이머와 서열번호 8에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 8에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 8에 나 타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제16 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제15 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제16 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 24의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 24의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 25의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 9에 나타난 염기서열의 5'말단 쪽 첫번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 9에 나타낸 염기서열의 5'-말단쪽 1번째 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 9에 나타낸 염기서열의 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기인 제17 프라이머와 서열번호 9에 나타난 염기서열의 3'말단 쪽 1번째 염기부터 40번째 염기로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 중에서 연속적으로 이루어지는 15bp 내지 40bp 크기를 갖 는 폴리뉴클레오타이드들로 구성된 군에서 선택된 한우선별용 프라이머로서, 상기 프라이머의 5' 말단은 서열번호 9에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 15번째 내지 40번째 염기서열 중 어느 하나의 염기이고, 상기 프라이머 3'말단은 서열번호 9에 나타낸 염기서열의 3'-말단쪽 1번째 염기인 제18 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
상기 제17 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머와 상기 제18 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트
로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 26의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 한우에서 추출된 DNA인 주형 DNA에 대해 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 경우, 각각 증폭된 결과물의 수, 크기와 Annealing Temperature(TA) 즉, DNA의 이중가닥(double strand)이 한가닥으로 분리되는 온도가 상이하므로, 상기 9 종의 한우 선별용 프라이머 세트를 동시에 사용할 수 있다.
또한, 상기 한우 선별용 프라이머 세트는 한우에서 추출된 DNA이기만 하면, 그 채취 부위가 한정되지 아니하므로, 도축되어 고기형태로 전환된 소의 품종 구분 즉, 한우육인지 수입육인지의 구분이 가능하다는 점에서 산업적으로 그 효과가 매우 크다.
상기 한우 선별용 프라이머 세트의 일 예에 해당하는 프라이머 세트의 염기서열, 증폭산물의 크기 및 TA를 하기 표 1에 기재하였다.
상기 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 1을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 301bp이고 TA가 59℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 7%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 40%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한우육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 2를 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 370bp이고 TA가 59℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 2%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 39%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한우육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 3을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 394bp이고 TA가 65℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 5%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 41%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한우육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 4를 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 482bp이고 TA가 65℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 31%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 0%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 복수 개인지 여부를 확인하여 한우 또는 한우육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 5를 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 286bp이고 TA가 62℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 51%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 6%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 복수 개인지 여부를 확인하여 한우 또는 한우육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 6을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 287bp이고 TA가 62℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 29%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 6%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 복수 개인지 여부를 확인하여 한우 또는 한유육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 7을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 231bp이고 TA가 59℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 3%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 28%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한유육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 24의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 8을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 267bp이고 TA가 62℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 15%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 39%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한유육인지 여부를 확인할 수 있다.
서열번호 26의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 27의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 9을 이용하여 한우의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형(template DNA)으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 증폭된 결과물은 크기가 253bp이고 TA가 65℃인 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 0%인 반면, 외국소의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 상기 밴드 외에 다른 밴드가 나타날 확률이 15%인 것으로 확인되어, 증폭된 결과물의 밴드 수가 하나인지 여부를 확인하여 한우 또는 한유육인지 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 한우 선별용 프라이머 세트를 이용하여 한우 또는 한우육과 수입소 또는 수입육을 구분하는 한우 또는 한우육의 판별방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 한우 또는 한우육과 수입소 또는 수입육을 구분할 수 있는 한우 또는 한우육 판별 키트(KIT)를 제공한다.
상기 한우 또는 한우육과 수입소 또는 수입육을 구분하는 한우 또는 한우육의 판별방법은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 1, 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 2, 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 3, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 4, 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 5, 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 6, 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 7, 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 8 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 27의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 9로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 세트를 이용하여 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 단계를 포함하는 한우 또는 한우육 판별방법이다.
바람직하게는 상기 한우 또는 한우육 판별방법은
a) 판별 대상이 되는 소로부터 DNA 시료를 채취하는 단계; 및
b) 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 1, 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 2, 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 3, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 4, 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 5, 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 6, 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 7, 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 8 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 27의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 9로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시키고, 상기 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 단계를 포함하는 한우 또는 한우육의 판별방법이다.
상기 a) 단계에서 판별대상이 되는 소로부터 DNA 시료를 채취하는 단계는 판별대상이 되는 소의 혈액, 정액 또는 육즙이거나 우육의 조직으로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 채취하는 방법으로 수행할 수 있고, 바람직하게는 소의 육즙 또는 우육의 조직으로부터 게놈 DNA를 채취하는 방법으로 수행할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 게놈 DNA를 채취하는 방법은 DNA 시료가 혈액시료의 경우, 통상의 혈액으로부터 DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 FlexiGene DNA 키트와 같은 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 DNA 시료가 우육의 조직인 경우, 통상의 동물 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 조질을 균질기 등을 이용하여 분쇄한 후, 여과된 시료액에 대하여 상기 FlexiGene DNA 키트와 같은 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 DNA 시료가 정액시료인 경우, 통상의 동물 정액으로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 상기 동물 정액으로부터 정자를 분리한 후, 상기 정자에 대하여 세포로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계를 행하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 b) 단계에서, 한우 고유의 유전자표식이란 수입소와 구분되는 한우 유전자의 특징적인 부위를 의미하며, 본 발명의 구체예에 있어서는 한우 고유의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위 또는 mismatch 부위를 의미한다.
상기 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 단계는 통상의 유전자서열 탐지방법으로 수행할 수 있다.
구체적으로는, 상기 b) 단계는 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시키는 과정 및 상기 증폭 산물을 분석하여, 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시키는 과정은 상기 DNA 시료를 주형(template)으로 하고 상기 한우 선별용 프라이머 세트를 프라이머로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 진행하여 상기 DNA 시료를 증폭하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 과정은 상기 증폭 산물에 한우 고유의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위 또는 mismatch 부위의 서열이 포함되어 있는지 여부를 확인하거나, 상기 증폭산물을 전기영동한 결과 확인된 증폭산물의 밴드 수 및 밴드의 크기를 확인하거나 추가로 TA를 더욱 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물에서 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 과정은 증폭에 이용된 프라이머 세트의 종류에 따라 구별될 수 있다. 일 예로, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트 1을 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 43번째 염기 뒤에 GGGTGC의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트 2를 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 147번째 염기 뒤에 AAA의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트 3을 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 3‘말단 쪽 40번째 염기 뒤에 TGACTG의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트 4를 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 189번째 염기 뒤에 GGGGGGGG의 한우 고유의 mismatch 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트 5를 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 162번째 염기 뒤에 5bp의 한우 고유의 결실 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트 6을 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 96번째 염기 뒤에 GA의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트 7을 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 176번째 염기 뒤에 5bp의 한우 고유의 결실 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트 8을 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 121쪽 번째 염기 뒤에 TGATG의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트 9를 이용하여 증폭한 증폭산물의 경우, 증폭산물의 5‘말단 쪽 96번째 염기 뒤에 AGC의 한우 고유의 삽입 염기서열이 존재하는지와 5‘말단 쪽 103번째 염기 뒤에 2bp의 한우 고유의 결실 염기서열이 존재하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 증폭 산물에서 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 과정은 증폭산물을 전기영동하여 나온 결과를 분석하는 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 방법은 상기 전기영동결과를 증폭 산물의 증폭에 이용된 프라이머 세트의 종류에 따라 확인된 결과와 비교하는 방법일 수 있다.
일 예로, 한우로부터 채취한 시료의 경우에는 상기 전기영동의 결과인 DNA 밴드가 단일 밴드 또는 복수 개의 밴드로 나타나는 경향이 수입소로부터 채취한 시료의 경우와 상이한 것으로 확인된 것을 기초로, 전기영동 결과 DNA 밴드의 크기와 수를 확인하여, 특정 시료 DNA의 DNA 밴드의 수가 단일 밴드 또는 복수 개의 밴드인 경우 한우 또는 한우육으로 판별할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응일 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응의 증폭 산물을 확인하는 과정은 상기 증폭 산물이 특정 크기인지 여부 또는 특정 크기의 DNA 외에 다른 크기의 DNA도 포함하고 있는지 즉, 복수 개의 DNA인지 여부를 확인하는 것일 수 있고, 상기 DNA의 크기를 확인하는 방법은 DNA의 크기를 확인하기 위한 통상의 방법일 수 있고, 일 예로 전기영동법으로 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 컨벤셔널 중합효소연쇄반응인 경우에는 상기 중합효소연쇄반응은 상기 프라이머 세트 1, 상기 프라이머 세트 2, 상기 프라이머 세트 3, 상기 프라이머 세트 4, 상기 프라이머 세트 5, 상기 프라이머 세트 6, 상기 프라이머 세트 7, 상기 프라이머 세트 8 및 상기 프라이머 세트 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 프라이머 세트를 이용한 것일 수 있고, 상기 증폭 산물을 확인하는 과정은 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하는 DNA, 구체적으로는 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하는 특정 크기의 DNA가 증폭되었는지 여부와 상기 특정 크기의 DNA 외에 다른 크기의 DNA가 증폭되었는지 여부 즉, 증폭 산물이 크기가 상이한 복수 개의 DNA를 포함하는지 여부를 확인하여 수행할 수 있으며, 상기 특정 크기의 DNA는 상기 표 1에 기재된 각 프라이머 세트에 의해 증폭될 것으로 예상되는 예상 증폭 DNA 산물의 크기의 DNA일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응의 증폭 산물의 크기 및 수를 확인하는 과정은 상기 증폭 산물을 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마드 겔 (polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동한 후에, 상기 전기영동의 결과인 DNA 밴드(DNA band)를 확인하여 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우에는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 상기 DNA 산물의 크기와 DNA 산물의 이중나선이 분리되는 온도(annealing temperature)가 각각 상이하므로, 이를 이용하여 1 종 이상의 주형 DNA에 대한 중합효소연쇄반응을 동시에 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우에는 상기 중합효소연쇄반응은 상기 프라이머 세트 1, 상기 프라이머 세트 2, 상기 프라이머 세트 3, 상기 프라이머 세트 4, 상기 프라이머 세트 5, 상기 프라이머 세트 6, 상기 프라이머 세트 7, 상기 프라이머 세트 8 및 상기 프라이머 세트 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용하는 중합효소연쇄반응 또는 2 종 이상을 이용하는 다중 중합효소연쇄반응일 수 있고, 상기 증폭 산물을 확인하는 과정은 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하는 DNA, 구체적으로는 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하는 특정 크기의 DNA가 증폭되었는지 여부와 상기 특정 크기의 DNA 외에 다른 크기의 DNA가 증폭되었는지 여부 즉, 증폭 산물이 크기가 상이한 복수 개의 DNA를 포함하는지 여부 및 상기 증폭된 DNA의 이중나선이 분리되는 온도(annealing temperature)를 확인하여 수행할 수 있으며, 상기 특정 크기의 DNA는 상기 표 1에 기재된 각 프라이머 세트에 의해 증폭될 것으로 예상되는 예상 증폭 DNA 산물의 크기의 DNA일 수 있다.
상기 중합효소 연쇄 반응은 통상의 반응조건에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 각 프라이머 세트 종류에 따라 하기 표 2에 기재된 반응조건에서 수행할 수 있다.
| 단계(step) | 온도 | 반응시간 |
| First(1st) denaturation | 94℃ | 3 minutes |
| Second(2nd) denaturation | 94℃ | 30 seconds |
| Annealing | 표 1에 기재된 각 프라이머 세트의 TA 온도 |
30 seconds |
| Extension | 72℃ | 45 seconds |
| Cycle | go to 2nd denaturation | 35 cycle |
| Final Extension | 72℃ | 5 minutes |
상기 한우 또는 한우육 판별 키트는 판별 대상이 되는 소로부터 채취된 DNA 시료로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하여 한우 또는 한우육을 판별할 수 있는 키트일 수 있다.
바람직하게는, 상기 한우 또는 한우육 판별 키트는 상기 프라이머 세트 1, 상기 프라이머 세트 2, 상기 프라이머 세트 3, 상기 프라이머 세트 4, 상기 프라이머 세트 5, 상기 프라이머 세트 6, 상기 프라이머 세트 7, 상기 프라이머 세트 8 및 상기 프라이머 세트 9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 한우 또는 한우육 선별용 프라이머 세트 및 상기 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단으로 이루어진 것일 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 한우 또는 한우육 판별 키트는 상기 한우 또는 한우육 선별용 프라이머 세트; 상기 프라이머 세트를 이용하여 DNA 시료를 증폭시킬 수 있는 증폭 수단 및 상기 증폭 수단에 의해 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단을 포함하는 것일 수 있다.
상기 판별대상이 되는 소로부터 채취된 DNA 시료는 판별대상이 되는 소의 혈액, 정액 또는 육즙이거나 우육의 조직으로부터 채취된 게놈 DNA(genomic DNA)일 수 있고, 바람직하게는 소의 육즙 또는 우육의 조직으로부터 채취된 게놈 DNA일 수 있다.
상기 DNA 시료 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시킬 수 있는 증폭 수단 및 상기 증폭 수단에 의해 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단을 포함하는 것일 수 있다.
상기 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단은 상기 DNA 시료 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시킬 수 있는 증폭 수단 및 상기 증폭 수단에 의해 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단을 포함하는 것일 수 있다.
상기 증폭 수단은 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 통상의 수단일 수 있으며, 일 예로 중합효소연쇄반응기를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있는 반응혼합액(mixture)일 수 있다. 상기 반응혼합액은 반응완충액, Taq DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2을 포함하는 것일 수 있고, 상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우에는 추가로 SYBR Green I과 같이 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 측정하여 형광정도를 측정할 수 있는 수단을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 증폭 수단은 상기 반응혼합액에 추가로 중합효소연쇄반응기를 포함하는 것일 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응기는 통상의 중합효소연쇄반응기일 수 있고, 일 예로 리얼타임 중합효소연쇄반응기, 열 블록 중합효소연쇄반응기(Thermal Block PCR machine) 또는 마이크로 중합효소연쇄반응기(Micro PCR machine)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 증폭 수단에 의해 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단은 통상의 유전자표식을 탐지할 수 있는 수단일 수 있으며, 바람직하게는 상기 증폭 산물에 한우 고유의 삽입-결실 부위 또는 mismatch 부위가 있는지 여부를 확인하거나 상기 증폭 산물의 전기영동 결과의 DNA 밴드의 크기, 개수 또는 상기 증폭된 DNA의 이중나선이 분리되는 온도(annealing temperature)를 확인할 수 있는 수단일 수 있다.
상기 증폭 수단에 의한 증폭과정 및 상기 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단에 의한 탐지과정은 하나의 수단에서 수행될 수 있다. 일 예로, 상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우에는 SYBR Green I과 같이 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 측정하여 형광정도를 측정할 수 있는 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있는 반응혼합액(mixture)과 리얼타임 중합효소연쇄반응기에서 상기 증폭과정 및 탐지과정이 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 한우 또는 한우육 선별용 프라이머 세트를 이용하는 경우, 기존의 방법에 비하여 다양한 품종의 수입육에 대해서 판별이 가능할 뿐만 아 니라, 전문적인 지식을 가진 자의 도움없이 간편하고 신속하게 한우 또는 한우육을 판별할 수 있어, 유통과정의 어느 시점에서도 한우육과 수입육을 구별하는 것을 가능하게 하여 산업적으로 널리 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
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실시예
>
<
실시예
1> 한우 고유의 유전자 표식의 검색
실시예 1-1: BAC 라이브러리( Bacterial Arificial Chromosome library , BAC library)의 제작
농협중앙회 한우개량부에서 실시해 온 26차 내지 35차 한우 후대검정집단 중, 도축 결과 육량과 육질이 뛰어난 것으로 판단된 한우의 혈액을 체취하였다.
상기 채취한 혈액은 염색체 DNA 추출에 이용되기 전까지 응고를 방지하기 위하여 EDTA를 첨가하여 4℃에서 냉장 보관하였다.
BAC 라이브러리의 제작은 기존에 발표된 방법으로 제작하였다(Cai L., Taylor J.F., Wing R.A., Gallagher D.S., Woo S.S., Davis S.K. Construction and Characterization of a Bovine Bacterial Artificial Chromosome Library. Genomics. 29, 413-425(1995) 및 Osoegawa K., Woon P.Y., Zhao B., Frengen E., Tateno M., Catanese J.J., de Jong P.J. An improved approach for construction of bacterial artificial chromosome libraries. Genomics. 52, 1-8(1998)).
DNA 분리 키트(Genotein, 대한민국) 및 상기 DNA 분리 키트 제조사에서 공급받은 프로토콜을 이용하여 상기 채취한 혈액으로부터 백혈구 세포의 염색체 DNA를 분리 및 정제하였다.
상기 분리·정제된 염색체 DNA를 아가로스 플러그(agarose plug)로 제조한 후, 이를 이용하여 기존에 발표된 방법(An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries, Genomics 52:1-8(1998), 본 발명에서 참조로써 포함됨)으로 총 150,000개의 각각 다른 부위의 한우 염색체 조각을 포함하는 BAC(Bacterial Artificial Chromosome) 클론을 제작하였다.
보다 상세하게는, 상기 분리·정제된 염색체 DNA를 EcoRⅠ과 HindⅢ 제한효소(NEB, USA)를 이용하여 절단하고, 상기 절단된 한우 염색체 DNA를 pBACe3.6벡터(Accession No. U80929)와 pIndigoBAC-5벡터(Epicentre, WI, USA)에 각각 라이게이션하였다. 상기 라이게이션은 50ng의 pBACe3.6벡터 또는 pIndigoBAC-5벡터에 15μl 10 X T4 라이게이즈 버퍼(ligase buffer, Fermentas, Hanover, USA), 3μl T4 라이게이즈(ligase, Fermentas, Hanover, USA), 300ng의 삽입 DNA 즉, 상기 절단된 한우 염색체 DNA를 혼합하고 초고순도 물로 총량을 150μl로 맞추어 16℃에서 밤새도록(overnight) 반응시켜 수행하였다.
일렉트로포레이터(electrophorator)를 이용하여 상기 라이게이션에 의해 제작된 재조합 벡터를 박테리아 수용성 세포(bacteria competent cell)에 형질전환(transformation)시킨 후에, LB 플레이트에 도말한다. LB 플레이트 상에서 한우 의 염색체 DNA를 포함하고 있는 BAC 클론들만 선별하여, 2 X LB 배지를 1ml 함유한 96 deep well plate에 접종한 후 20시간 배양하였다. 상기 배양액 40μl와 글리세롤 10μl를 혼합하여 글리세롤 스탁(glycerol stock)을 제조한 후, -70℃의 deep freezer에서 보관하였다.
실시예
1-2: 한우
BAC
DNA
의 분리 및 시퀀싱(
Sequencing
)
BAC DNA의 분리는 상기 제작된 1500,000개의 클론 중 10,272개의 클론에 대하여 하기와 같은 방법으로 양쪽 말단 염기서열 분석을 실시하여 수행하였다.
우선, 상기 제조한 한우의 BAC 클론을 클로르암페니콜(chloramphenicol) 12.5μg/ml를 포함하는 2 X LB 배지 1.5㎖이 담겨있는 2.0ml 96 deep well plate(Bioneer, 대한민국)에 접종한 후, 진탕배양기(shaking incubator, MegaGrow(Bioneer, 대한민국)를 이용하여, 450rpm으로 18시간 동안 진탕배양하였다.
상기 진탕배양한 배양액에 대하여 Montage BAC96 miniprep kit(Millpore)를 이용하여 추출하고 알카라인 라이시스(alkaline lysis, Birnboim , H. C. and Doly , J. A. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7(6):1513-1523(1979) 및 Kelley, J. M., Fields, C. E., Craven, M. B., Bocskai, D., Kim, U., Rounsley, S. D. and Adams, M. D. 1999. High throughput direct end sequencing of BAC clones. Nucleic Acids Res. 27(6):1539-1546.)법을 수행하여 plasmid 즉, 한우 BAC DNA를 분리하였다. 상기 분리된 한우 BAC DNA에 대해 전기영동을 수행하여 DNA의 통합성(integrity)과 농도를 확인하였다.
상기 DNA의 통합성(integrity)과 농도를 확인한 후, universal sequencing primer을 이용하여 PCR을 수행하였다. 보다 상세하게는 상기 universal sequencing primer는 T7 primer(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3', 서열번호 28) 및 조작된 RP2 primer(modified RP2 primer, 5'-TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3', 서열번호 29)를 이용하였으며, 상기 PCR은 하기 표 3의 조건으로 수행하였다.
| 단계(step) | 온도 | 반응시간 |
| First(1st) denaturation | 95℃ | 1 minutes |
| Second(2nd) denaturation | 95℃ | 30 seconds |
| Annealing | 50℃ | 10 seconds |
| Extension | 60℃ | 45 seconds |
| Cycle | go to 2nd denaturation | 35 cycle |
| Final Extension | 60℃ | 4 minutes |
상기 PCR에 의해 증폭된 DNA를 automated DNA sequencer인 3700 capillary sequencer 및 3730 XL capillary sequencer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)을 수행하여 말단 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하였다.
상기 시퀀싱에 의해 서열이 확인된 BAC 클론의 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 gene bank에 등록하였다.
상기 시퀀싱에 의해 서열이 확인된 BAC 클론의 염기서열의 신뢰도를 높이기 위하여 클론의 제작에 이용된 벡터의 염기서열을 제거하고, phred score가 20이상이며, 말단 염기서열의 크기가 100base pair 이상인 클론을 cross match sofrware(http://www.phrap.org)를 이용하여 선별하였다. 상기 선별된 한우 BAC 클론의 염기서열에서 repeat masking program(Repeat Masker-open-3-1-3, ‘Wu-BLAST engine’) 및 Repeat Database인 Rebase Current DB(Jan 20. 2006)를 이용하여 반복서열감춤(repeated masking) 즉, 반복염기서열의 제거를 수행하였다.
상기 반복염기서열을 제거한 염기서열과 NCBI에 공개된 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data)의 유사성을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 조사하였다. 상기 유사성 조사에 사용된 BLAST 프로그램은 NCBI local BLAST을 사용하였으며, 데이터베이스(Database)는 NCBI Genome Bos Taurus Build 2.1를 사용하였다.
실시예
1-3: 한우 고유의 유전자표식의 검색
한우 고유의 유전자표식 즉, 한우와 외국소의 염기서열의 차이를 나타내는 부분은 상기 반복염기서열을 삭제한 한우의 염기서열과 NCBI에 공개된 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data)를 비교하여 검색하여 한우와 외국소의 염기서열의 차이를 나타내는 부분 즉, 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위 및 2bp 이상의 mismatch 부위를 확인하였다.
상기 비교 검색 결과를 기초로 Primer 3 program(http://frodo.wi.mit.deu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)을 이용하여 한우와 외국소의 염기서열의 차이를 나타내는 부분 즉, 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위 또는 2bp 이상의 mismatch 부위와 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 서열을 결정하였으며, 상기 삽입-결실 부위 또는 2bp 이상의 mismatch 부위 및 프라이머의 서열이 포함되어 있는 한우 BAC 말단 염기서열을 도 1 내지 도 9에 나타내었다.
상세하게는, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01036887)와 비교 검색 결과 도 1에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 43번째 염기인 티민(Thymine, T) 뒤에 GGGTGC의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-3이라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01105952)와 비교 검색 결과 도 2에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 147번째 염기인 구아닌(Guanine, G) 뒤에 AAA의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-4라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01419786)와 비교 검색 결과 도 3에 기재된 염기서열 중, 3‘말단의 40번째 염기인 아데닌(Adenine, A) 뒤에 TGACTG의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-5라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01005550)와 비교 검색 결과 도 4에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 189번째 염기인 아데닌 뒤에 GGGGGGGG의 한우 고유의 mismatch 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-6이라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01199621)와 비교 검색 결과 도 5에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 162번째 염기인 티민 뒤에 5 bp의 한우 고유의 결실 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-7이라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01525233)와 비교 검색 결과 도 6에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 96번째 염기인 티민 뒤에 GA의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-8이라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01632156)와 비교 검색 결과 도 7에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 176번째 염기인 시토신(Cytosine, C) 뒤에 5 bp의 한우 고유의 결실 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-9라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01360830)와 비교 검색 결과 도 8에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 121번째 염기인 아데닌 뒤에 TGATG의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-10이라 명명하였다.
또한, 상기 NCBI에 공개된 외국소의 게놈데이터인 Bos Tarus의 게놈데이터(genome Data, AAFC01650191)와 비교 검색 결과 도 9에 기재된 염기서열 중, 5‘말단의 96번째 염기인 티민 뒤에 AGC의 한우 고유의 삽입 부위가 존재하고, 5‘말단의 103번째 염기인 아데닌 뒤에 2 BP의 한우 고유의 결실 부위가 존재하는 것을 확인하여 이를 한우 고유의 유전자표식으로 확인하였으며, 상기 유전자표식을 탐지할 수 있는 프라이머의 서열을 상기 방법에 의해 결정(desinged)하고 YUHW-MBL-11이라 명명하였다.
상기 확인된 유전자표식, 이를 확인할 수 있는 프라이머 서열을 포함하는 한우 BAC 말단 염기서열을 도 1 내지 도 9에 나타내었다. 상기 도 1 내지 도 9의 밑줄 친 부분이 각각의 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다.
<
실시예
2> 한우 고유의 유전자표식을 탐지할 수 있는
프라이머
제작
상기 실시예 1-3에서 확인된 한우 고유의 유전자표식을 탐지하기 위하여, 상기 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트 1) 내지 프라이머 YUHW-MBL-11(프라이머 세트 9)의 결정(desinged)된 서열을 기초로 Bioneer(대전, 대한민국)사에 합성을 의뢰하여 프라이머를 제작하였다.
상기 합성을 의뢰하여 제작한 프라이머는 상기 표 1에 기재된 것과 같다.
<
실시예
3> 한우와
수입소의
판별
상기 실시예 2에서 제작된 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트 1) 내지 프라이머 YUHW-MBL-11(프라이머 세트 9)을 이용한 한우와 수입소의 판별은 공시재료 즉, 이미 확인된 한우, 젖소(Holstein종) 및 수입쇠고기로부터 채취한 시료를 이용하여 하기의 방법으로 수행하였다.
실시예
3-1: 시료의 채취
실시예3
-1-1: 한우 및 젖소의 시료채취
경상도와 전라도 지역 도축장에서 수의사의 판정을 받은 한우 275개체 및 젖소(Holstein종) 68개체로부터 혈액을 채취하고, 상기 채취된 혈액의 응고를 방지하기 위하여 채취된 혈액 50 mL에 EDTA(0.5 M, pH 8.0) 10 mL를 첨가하여 falcon tube에 넣은 후, genomic DNA 추출 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예3
-1-2:
수입소의
시료채취
수입소의 경우, 혈액을 채취할 수 없으므로, 대구와 경산에 위치한 백화점 및 대형할인매장에서 수입쇠고기 시료 63개체를 채취하였고, 외국소 13개 품종 181개체의 정액시료를 확보하였다. 상기 채취된 수입쇠고기 시료 및 확보된 정액은 genomic DNA 추출 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예
3-2: 채취된 시료로부터
genomic
DNA
의 추출
실시예3
-2-1: 혈액시료로부터
genomic
DNA
의 추출
상기 실시예 3-1-1의 혈액시료로부터 genomic DNA의 추출은 FlexiGene DNA 키트(FlexiGene DNA kit, Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 및 상기 키트 제조사에서 공급받은 프로토콜을 이용하여 수행하였다.
실시예3
-2-2: 쇠고기시료로부터
genomic
DNA
의 추출
상기 실시예 3-1-2의 수입쇠고기 시료로부터 분리된 조직 1 g을 PBS 완충액(PBS buffer, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)이 5 내지 10 mL 담긴 falcon tube에 넣고 균질기(homogenizer)를 이용하여 분쇄한 후, 거즈를 이용하여 여과하였다. 상기 여과된 시료액에 대하여 원심분리를 300 x g에서 5분간 수행한 후에, 펠렛(pellet)을 수거하였다. 상기 수거된 펠렛으로부터 실시예 3-2-1과 동일한 키트 및 프로토콜을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.
실시예3
-2-3: 정액시료로부터
genomic
DNA
의 추출
상기 실시예 3-1-2의 수입소의 정액시료로부터 정액 30 μl 를 취하여 1.5 ml 튜브(tube)로 옮겨 담은 다음, 10 mM TNE 버퍼Ⅰ(10 mM TNE bufferⅠ, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS, 100 mM NaCl, 100 ug/mL proteinase K)을 500 μl 첨가하였다. 상기 TNE 버퍼Ⅰ이 첨가된 정액시료 튜브(tube)를 볼텍스(Vortex)를 이용하여 잘 혼합한 후 70℃의 수조(water bath)에 넣고 3시간 동안 항온처리(incubation)하여 가수분해(hydrolysis)를 수행하였다. 상기 가수분해를 수행한 혼합액을 원심분리기를 이용하여 12,800 x g 및 25 ℃의 조건에서 원심분리하여 정자가 존재하는 펠렛(pellet)을 수거하였다.
상기 펠렛에 TNE 버퍼 Ⅱ(TNE bufferⅡ, TNE bufferⅠ+0.1 M DTT) 0.5 ml를 첨가한 후, 55℃의 수조(water bath)에 넣고 8시간 동안 항온처리(incubation)하였다. 상기 항온처리(incubation)를 끝낸 시료에 500 ul의 반응액(Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol solution, Phenol,Chloroform 및 Isoamyl alcohol이 25:24:1로 혼합되어 있는 반응액)을 첨가하고 상온에서 30분간 흔들면서 혼합하였다(shaking). 상기 혼합(shaking)을 수행한 혼합액을 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm 및 상온(15℃)의 조건에서 5분간 원심분리를 실시한 후, 상층액을 새로운 튜브(tube)에 옮기고, 동일한 용량의 이소프로파놀(isopropanol)을 첨가하였다. 상기 이소프로파놀을 첨가한 혼한액을 원심분리기를 이용하여 13,000 x g 및 4℃의 조건에서 15분 동안 원심분리를 실시한 후, 이소프로파놀(isopropanol)을 제거하고 70% 에탄올 1,000 μl를 첨가하고 13,000 x g 조건에서 5 분간 원심분리 하여 DNA를 세척하였다. 상기 세척한 DNA를 상온(15℃)에서 건조시키고, 상기 건조된 DNA 펠렛(pellet)에 1 x TE 버퍼(TE buffer, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 μl를 첨가하여 다시 녹인 후, 4℃에서 16시간 동안 항온처리(incubation)하여 genomic DNA를 추출하였다. 상기 genomic DNA는 1.2 % 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
실시예
3-3:
프라이머
YUHW
-
MBL
-3 내지
프라이머
YUHW
-
MBL
-11을 이용한
PCR
PCR 반응을 위한 반응액은 10 X 반응 완충액(reaction buffer, 100 mM Tris-Cl, 400 mL KCl, 20 mM MgCl2, pH 9.0, GenDocs, 대한민국) 2μl, 3 ng의 시료로부터 추출한 genomic DNA, Taq DNA polymerase 0.5 unit(5 unit/μl, GenDocs, 대한민국), 1 μl의 dNTPs mixture( 2.5 mM dNTPs) 및 각 10 pmole의 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트 1) 내지 프라이머 YUHW-MBL-11(프라이머 세트)을 혼합한 후에, 최종 부피가 20 μl가 되도록 멸균 증류수를 첨가하여 제조하였다.
상기 제조한 PCR 반응액을 프라이머 종류에 따라, 표 2에 기재된 조건에서 MyGenie 96 Gradient thermal cycler(Bioneer, 대한민국)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
실시예
3-4: 전기영동(
Electrophoresis
)을 이용한
한우육의
판별
실시예 3-3에 의해 증폭된 PCR 산물을 이용하여 한우육을 판별하기 위하여 상기 PCR 산물에 대해 전기영동을 수행하였다.
전기영동을 수행하기 위해서 1 X TAE 버퍼(1 X TAE buffer, 40 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 20mM Acetic acid)와 아가로즈(agarose)를 이용하여 만든 1.2% 아가로즈 겔(agarose gel)에 PCR 산물을 로딩한 후, 100 volt의 조건에서 50분 동안 전기영동을 실시하여 반응 유무를 확인하였다.
상기 반응 유무의 확인을 통해 PCR 반응 여부를 확인한 후, 상기 PCR 산물을 non-denature polyacrylamide gel을 이용하여 2차 전기영동을 실시하였다. 상기 2차 전기영동에서 사용된 8% non-denature polyacrylamide gel은 acrylamide-bis solution, 40% 아크릴아마이드 용액(Acrylamide solution)과 2% Bis solution(Bio-rad, USA)을 29:1 비율로 혼합하여 제조한 20% 아크릴아마이드-비스 용액 4.8 ml, 멸균 증류수 4.8 ml 및 5 X TBE 버퍼(5 X TBE buffer, 45 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 45 mM Boric acid) 2.4 ml를 혼합하여 제조하였다. 상기 제조된 non-denature polyacrylamide gel에 10% ammonium persulfate(Sigma, USA) 200 ul와 TEMED(Sigma, USA) 10 ul를 첨가하여 상기 겔(gel)을 굳혔다.
실시예 3-3의 PCR 산물 5 μl 에 6 X 로딩 완충액(loading buffer, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerol) 1 μl를 혼합한 후 전량을 취해 상기 굳힌 8% Non-denature Polyacrylamide gel의 각 웰(well)에 로딩한 후, Mini Format Vertical Electrophoresis (Bio-rad, USA)를 이용하여 85 volt의 조건에서 20분 및 50 volt의 조건에서 1시간 20분 동안 전기영동을 실시하였다.
상기 전기영동 결과를 분석하기 위하여 사용한 DNA 싸이즈 마커(DNA size marker)는 100 bp DNA ladder(Bioneer, 대한민국)을 사용하였다.
상기 전기영동을 완료한 후, 2 μl의 EtBr(10 mg/ml)로 염색하고 ChemiImagerTM Ready(Alpha Innotech, Mississauga, Ontario, Canada)를 이용하여 DNA 밴드(band)를 확인하였으며, 그 결과를 도 10 및 도 18에 나타내었다.
상기 도 10 내지 도 18에 나타낸 결과는 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트1) 내지 YUHW-MBL-11(프라이머 세트9)을 이용하여 PCR을 수행한 한우, 젖소 및 외국소 각 20개체에 대한 결과이다.
상기 실시예 3-1에서 채취한 전체 한우, 젖소 및 외국소 전부에 대한 상기 PCR 산물의 분석 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
보다 구체적으로, 상기 도 10에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트1)를 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 301 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 0개체, 외국소가 5개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 275개의 시료 중에서 단 19개체 즉, 7%만이 복수의 밴드(double band)가 나타난 반면, 외국소의 경우 244개의 시료 중에서 98개체 즉, 50%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-3을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 상기 프라이머 YUHW-MBL-3을 이용하여 PCR을 수행할 경우 예상되는 증폭산물의 크기와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 11에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-4(프라이머 세트2)를 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 370 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 0개체, 외국소가 7개체, 젖소가 4개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 275개의 시료 중에서 단 0개체인 반면, 외국소의 경우 244개의 시료 중에서 95개체 즉, 39%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-4를 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 12에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-5(프라이머 세트3)를 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 394 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 0개체, 외국소가 8개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 단 8개체 즉, 5%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중에서 33개체 즉, 41%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-5를 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 13에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-6(프라이머 세트4)을 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 482 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 8개체, 외국소가 0개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 55개체 즉, 31%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중에서 어느 시료에서도 복수의 밴드가 나타나지 아니하였다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-6을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 외국소의 고기 즉, 수입육 보다는 한우육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 14에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-7(프라이머 세트5)을 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 286 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 12개체, 외국소가 5개체, 젖소가 3개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 91개체 즉, 51%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중, 단 12개체 즉, 18%만이 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-7을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 외국소의 고기 즉, 수입육 보다는 한우육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 15에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-8(프라이머 세트6)을 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 287 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 6개체, 외국소가 4개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 단 51개체 즉, 29%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중, 단 5개체 즉, 6%만이 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-8을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 외국소의 고기 즉, 수입육 보다는 한우육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 16에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-9(프라이머 세트7)를 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 231 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 0개체, 외국소가 1개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 단 5개체 즉, 3%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중에서 22개체 즉, 28%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-9를 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 17에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-10(프라이머 세트8)을 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 267 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 2개체, 외국소가 4개체, 젖소가 7개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 단 26개체 즉, 15%인 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중에서 31개체 즉, 39%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-10을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 18에 나타난 바와 같이 프라이머 YUHW-MBL-11(프라이머 세트9)를 이용하여, 표 2의 조건으로 PCR을 수행한 결과 253 base pair외의 다른 크기의 DNA 밴드가 나타나는 개체의 수는 한우가 0개체, 외국소가 3개체, 젖소가 0개체이었다. 또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 한우의 경우 179개의 시료 중에서 단 한개체에서도 복수의 밴드가 나타나지 않은 반면, 외국소의 경우 80개의 시료 중에서 12개체 즉, 15%가 복수의 밴드가 나타났다.
상기한 결과에 의할 때, 상기 프라이머 YUHW-MBL-11을 이용하여 PCR을 수행할 경우 복수의 밴드(double band) 즉, 프라이머 사이즈와 다른 밴드를 보이는 시료는 한우육 보다는 외국소의 고기 즉, 수입육일 확률이 높은 것으로 확인되었다.
이상의 실험결과를 참조하면, 한우의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위를 한우 고유의 유전자표식으로 하여, 이를 탐지할 수 있는 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 PCR과 전기영동을 수행한 후에, 전기영동의 DNA 밴드 패턴의 차이를 분석함으로써, 한우와 외국소를 구별하는 본원발명은 기존의 모색 발현에 관여하는 것으로 알려진 MC1R(Melanocortin 1 Receptor) 유전자를 이용하는 종래방법에 비하여 다양한 종의 수입육에 대하여 단시간에, 간단한 방법으로 한우육과 수입육을 구분할 수 있어 한우육과 수입육을 효과적으로 구분할 수 있다고 할 것이다.
또한, 상기 실험결과로부터 상기 한우의 삽입-결실(Indel, Insertion and Deletion) 부위가 한우 고유의 유전자표식으로 인식될 수 있음이 확이되었으므로, 상기 한우의 삽입-결실 부위을 포함하는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 탐침 올리고뉴클레오티드(probe)를 이용하여 한우육과 수입육을 효과적으로 구분할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-3(프라이머 세트 1)을 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01036887)와 구분되는 서열번호 1의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-4(프라이머 세트 2)를 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01105952)와 구분되는 서열번호 2의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-5(프라이머 세트 3)를 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01419786)와 구분되는 서열번호 3의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-6(프라이머 세트 4)을 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01005550)와 구분되는 서열번호 4의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-7(프라이머 세트 5)을 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01199621)와 구분되는 서열번호 5의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-8(프라이머 세트 6)을 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01525233)와 구분되는 서열번호 6의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-9(프라이머 세트 7) 를 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01632156)와 구분되는 서열번호 7의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-10(프라이머 세트 8)을 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01360830)와 구분되는 서열번호 8의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 프라이머 YUHW-MBL-11(프라이머 세트 9)를 제작하기 위하여 확인한, Bos Tarus의 게놈 데이터(AAFC01650191)와 구분되는 서열번호 9의 한우 BAC 말단 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머를 이용하여 수행한 한우, 젖소 및 외국소 시료에 대한 PCR 결과의 전기영동 사진이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Yeungnam University
<120> A NEW PRIMER SET AND A METHOD OF SELECTING HANWOOMEAT BY USING
THE SAID PRIMER SET
<130> DPP20096524KR
<160> 29
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 301
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-3
<400> 1
ctctgaggtg agggaacagg gttcctttca ctggagcatg aatgggtgca gtgcctggct 60
aattgccctg tgttggcagc tgggagagac ccgctagctg tggggtacag atgcccacta 120
ttaaagctga tctcattctg cctcttctct gtgtaactaa aatgctgtcc catctagggc 180
ttgactgcat tgtatctttt tttggaaagt ccagtcaata ccgagatgca aggggctgaa 240
gtgtttggag atttccccta ggattcatca ccagggcacc atgctctgct taacaccatg 300
c 301
<210> 2
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-4
<400> 2
ccaggttttc catcaaccac tcttcctgct gccttgggag gctcagccat tgagtttttt 60
tcattgaaaa gtttcgtgga gagctgccca cttctttatt ctcaatcctc gtattatttt 120
agaaattttt agaaaaaggt gagttagaaa aaaaaagaga tgcaggatga ctggagggtg 180
tggtacctgc cgccctggga catgctattt gttcatttca tccagtttta tctgttcctt 240
tataaattac ttctctagca aacttcctca cgttacagtg gactgtttca ctcaagtttc 300
attgtccacg atgttttttt tttaaccatg ccaggcacct tttggggcca tattttcctc 360
cccagggatt 370
<210> 3
<211> 394
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-5
<400> 3
cccaagctcc aaaagacagt tctgcctctt tttctttttc catgaatgta ttggaaggag 60
tgtggtttct gactatttca tacctatcta tatttcctct ctatattgat tgcaatattt 120
ttgctaacaa attgggttat aaatataact ccagacagca gatatgttct aagtttgatt 180
atagcagaat aactatattt tgtgacatgg tcatgaagaa aagaaaaaaa aatcctgata 240
tttagataaa gtgggtctta gaacttccac atgtttaaaa ggctgttgaa ggcaaattag 300
aaatggatag atgatgaagc tgagcctcag tccattattt aaagcaagtg actgaaaatg 360
ttgattttcc tgccacaggg gaatgtcagc actt 394
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<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-6
<400> 4
caagcttggg ctttcctaaa actacattct cctgtacaac attgttctct gttatctcat 60
cagaaaccgg tgaggccaaa ttcgccacac ttcccacttc tctcttcttt cctcaagtac 120
cctctcctac ccagaccttg tcctaacaca cacagtagac acagagaggg tgctcaatcc 180
catgtgcgag ggggggggag tcatccttgt ctgggagcac agattctatc ccctggcaga 240
aaccctcttt taacatgatc tgtttaccct agagaccctt ttctacagac ctttccctgt 300
gacacatatg gttatccaag gagggtagat ctaatttgag gaaaaagaga aaaatctcat 360
tcctaacatg attgatttcc cttcctctcc agcttaggtc tcctaggatc tccgtcttca 420
cttgtcaccc acaactcctc ccctcctgcg taattcctga cccagaggag agatggggat 480
ga 482
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-7
<400> 5
cagccaggaa tcaggttttc ccttaaggca gattctgtta tacaaatcca aatgctgtat 60
ggaaattctg cgagtgaaac tttctggtta tacttattcg actatccaaa cttaattaaa 120
tcctcaatca ccttcctggg aactgaaatg atgagatgag atccaatgac ccgaaatttc 180
tggaatctcc ttttatttcc cctacccctt tcccctggtg agtgaagcat taacaatttt 240
ttcctccagg ctttgagagt tgctgtaaag gacatcttgt gtcccg 286
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-8
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ttcccagtct caaggcactc ggagtaaatg aagtcttttc ccaaaacagt agagtgctta 60
gtgcttctat catgccattt aatccgtaac taccttgaga cagttccctc tagatcaagt 120
tattcttccc taatcaactg tggagtcctg tctccgataa acaactaaat tctctaatgg 180
caatttagca aaggccccac ctcatactct ctggactcct cccgaagtcc tcccaaagca 240
caacaggtaa cactgagcac acaataaaag tacactgggc catttgc 287
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-9
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tcctttttgg catcttggag aagagtgaaa aggggaaaga gcataaagtt taagaaactc 60
cattcacagt tgtttgcatt aaatttttcc aatgataata tagatctgtt gtgattcaca 120
cctcaaccct tggaatcaca ggctttggaa tcttctttgt gaatctactt aatctcctag 180
ttcatttggg taatccagtt gagacgacta agctgtttcc tgtttgctgg a 231
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-10
<400> 8
acagcacttg gcttcctcat agaccactgc acttggaagt ctgggcctat gtatgcttgt 60
gcacccgacc tgggcaggca gggctgttag gaagcaggtt cccatcccgg ctttggcagt 120
atgatgctgg atacccacga atacctgatt tgatttcttt gtcctaaatt tcatccataa 180
aatgaaaata ttagactaaa tcaagcagct tctcatctta tggctagtga aagtaaaatt 240
cattataatt gtccacagag tgctgag 267
<210> 9
<211> 253
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-11
<400> 9
gagtcacacc acagggcttt gagaaaaaga taactgggac ccaattttaa cctccagccg 60
agagatgagg aaggccctgt tccttccgtg gcacagtagc ttaaaaggtc caagcaactc 120
tagtttcctg aactctcacc accagggggt gcattgagag caagaaaagc ttctgaatgt 180
gttgtattct ctttcagcta tcttgccccg aggctcagtt ttacgtcacc ccgtgtattg 240
agtgggcacc aga 253
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-3-F-Primer
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ctctgaggtg agggaacagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-3-R-Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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acgagacgaa ttgtggtacg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-4-R-Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cccaagctcc aaaagacagt 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-5-R-Primer
<400> 15
tgtcccctta cagtcgtgaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-6-F-Primer
<400> 16
caagcttggg ctttcctaaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-6-R-Primer
<400> 17
gtctcctctc tacccctact 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-7-F-Primer
<400> 18
agccaggaat caggttttc 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-7-R-Primer
<400> 19
tttcctgtag aacacagggc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-8-F-Primer
<400> 20
ttcccagtct caaggcactc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-8-R-Primer
<400> 21
ttcatgtgac ccggtaaacg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-9-F-Primer
<400> 22
tcctttttgg catcttggag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-9-R-Primer
<400> 23
cgacaaagga caaacgacct 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-10-F-Primer
<400> 24
acagcacttg gcttcctca 19
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-10-R-Primer
<400> 25
attaacaggt gtctcacgac tc 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-11-F-Primer
<400> 26
gagtcacacc acagggcttt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YUHW-MBL-11-R-Primer
<400> 27
acataactca cccgtggtct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Primer
<400> 28
taatacgact cactataggg 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP2 Primer
<400> 29
tacgccaagc tatttaggtg aga 23
Claims (6)
- 삭제
- 서열번호 22의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 상기 서열번호 22의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된 것인 한우 선별용 프라이머 세트.
- a) 판별 대상이 되는 소로부터 DNA 시료를 채취하는 단계; 및b) 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 상기 DNA 시료를 증폭시키는 단계; 및c) 상기 증폭 산물을 분석하여, 한우 고유의 유전자 표식을 탐지하는 단계를 포함하는 한우 또는 한우육의 판별방법.
- 제3항에 있어서,c) 단계는 상기 증폭 산물을 전기영동하여 DNA 밴드가 단일밴드 또는 복수 개의 밴드인지 여부를 확인하는 것인 한우 또는 한우육의 판별방법.
- 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머와 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 DNA 시료를 증폭시킬 수 있는 증폭 수단 및 상기 증폭 수단에 의해 증폭된 증폭 산물로부터 한우 고유의 유전자표식을 탐지하는 탐지수단을 포함하는 한우 또는 한우육 판별 키트.
- 제5항에 있어서,상기 탐지수단은 상기 증폭 산물을 전기영동한 후에, 상기 전기영동의 결과인 DNA 밴드가 단일밴드 또는 복수 개의 밴드인지 여부를 확인할 수 있는 수단인 것을 특징으로 하는 한우 또는 한우육 판별 키트.
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