KR101006079B1 - 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101006079B1
KR101006079B1 KR1020080032587A KR20080032587A KR101006079B1 KR 101006079 B1 KR101006079 B1 KR 101006079B1 KR 1020080032587 A KR1020080032587 A KR 1020080032587A KR 20080032587 A KR20080032587 A KR 20080032587A KR 101006079 B1 KR101006079 B1 KR 101006079B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
garlic
dna
ssr
seq
primer
Prior art date
Application number
KR1020080032587A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090107199A (ko
Inventor
마경호
박용진
이기안
이정로
이석영
곽재균
김태산
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020080032587A priority Critical patent/KR101006079B1/ko
Publication of KR20090107199A publication Critical patent/KR20090107199A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101006079B1 publication Critical patent/KR101006079B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Abstract

본 발명은 마늘에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 마늘의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 마늘의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 마늘의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.
SSR 프라이머, 마늘, DNA 다형성

Description

마늘에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{SSR primer derived from Garlic and use of there}
본 발명은 마늘에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 마늘(Garlic ; Allium Sativum . L)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 초위성체 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕(Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다(Tang et al ., Theor . Appl . Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 마늘에서는 SSR 마커가 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 외국에서도 이와 관련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 마늘의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 다양한 마늘 계통들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 마늘의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출 방법 및 마늘의 품종 동정 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출용 키트 및 마늘의 품종 동정용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 마늘의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al., Mol. Eco. Note, 5: 736-738) 방법으로 마늘로부터 SSR 마커를 개발 하였다. 마늘에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 마늘로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션하였다.
라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 탐침과 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 마늘의 초위성체를 포함하고 있는 500개의 DNA단편을 수득하였다.
상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 5개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 초위성체를 증폭 할 수 있는 양방향 프라이머 200쌍을 디자인 하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 재배형 마늘 계통 및 품종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 8쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 GB-AS-035(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-040(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-053(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-059(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-072(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-078(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이 머쌍), GB-AS-080(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-AS-109(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초위성체에 존재하는 반복 모티브(repeat motif), 증폭되는 초위성체의 크기, Tm(℃) 및 초위성체가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.
프라이머명 서열 서열
번호		 반복모티브 증폭되는 초위성체의 크기의 범위(bp) Tm(℃) 대립인자의 수
GB-AS-035 F : TTGGACTGAATTCTGAATACCT 1 (GCC)3, (TC)3(CC)(CT)2, (TCC)3 288-298 52 4
R : GGGTGTGTGGTTCAAGGA 2
GB-AS-040 F : CACAGCAACATGCACCAT 3 (CA)n 266-300 52 7
R : TGCCGGAACTCGATATT 4
GB-AS-053 F : ACAAGGTCGACATCGTTTG 5 (CA)n 168-294 52 11
R : GGGCTTCACCTGAACACA 6
GB-AS-059 F : CTTGCCGGAACTCGATATT 7 (CGT)3, (TGT)3, (TG)n 278-312 52 6
R : CACAGCAACATGCACCAT 8
GB-AS-072 F : CACGCGAATCTTTCTTGG 9 (TA)n(TG)n 194-276 52 9
R : TGCAAAGCAATATGGCAG 10
GB-AS-078 F : TGTTCCAACCAGATTTAATGC 11 (TG)n 194-226 52 5
R : AAGTGGCGGTTGTGTCTG 12
GB-AS-080 F : AATCTCCCTCCAAAGTCCC 13 (CCG)5 171-174 52 2
R : CCTGTATTTTGTGTAAAGCATCA 14
GB-AS-109 F : GGTCTCCTCATCCACCGT 15 (CCG)3, (CCT)n, (CCA)n 206-245 52 6
R : GTGTGGGGCATGATTGAC 16
aF: 정방향 프라이머 bR: 역방향 프라이머
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 마늘에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 마늘의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 마늘의 DNA 다형성 검출 방법은
(a) 마늘로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res.,4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 마늘에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 마늘의 품종 동정 방법을 제공한다.
구체적으로 마늘의 품종 동정 방법은
(a) 마늘 및 대조군 마늘 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 마늘 및 대조군 마늘 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 마늘과 대조군 마늘 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 마늘과 대조군 마늘 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 마늘은 대조군 마늘 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 마늘 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 마늘과 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 마늘 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 마늘에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 마늘의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 마늘은 Allium Sativum . L. 및 이들의 변종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Allium Sativum . L 일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 마늘에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 마늘의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 마늘의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 마늘의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 마늘의 품종을 판별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 게놈 DNA 추출
재배종 마늘(농업생명공학연구원 유전자원과, 보존번호 : 25)로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 생육 1개월째의 어린 마늘 식물체로부터 0.5 g의 잎 조직을 채취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액(200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750 ㎕를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀(phenol):클로로포름(chloroform):이소아밀알코올(isoamylalchol) (25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300 ㎕의 RNase (50 ㎍/㎖)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간동안 보관하였다.
<실시예 2> 어댑터와의 라이게이션(ligation)
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500 ng을 각 제한효소 제조사의 지침에 따라 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 표 2에 나타낸 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 12℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 AP-12 어댑터는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, Promega, 미국)로 5’ 말단을 인산화하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼(Promega, 미국), 50ng AP11 어댑터, 50ng AP12 어댑터, 150ng DNA 단편, 3 Unit T4 라이게이즈(Promega, 미국).
어댑터 명 염기서열 서열번호
AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3' 17
AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAGCACA-3' 18
<실시예 3> 초위성체를 포함하고 있는 DNA 단편의 선발 및 분리
<3-1> 마그네틱 비드 준비
마그네틱 비드(magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC(Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6 ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100 ㎕를 넣은 후 30분이내에 사용하였다.
<3-2> 혼성화
상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500 ㎕가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴(biotin)이 표지된 SSR 탐침 1.5 ㎕(20ng)와 20x SSC 버퍼 13 ㎕를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 8개의 SSR 탐침은 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 탐침은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.
서열 서열번호
Biotin-(GA)20 19
Biotin-(AT)20 20
Biotin-(CA)20 21
Biotin-(AGC)15 22
Biotin-(GGC)15 23
Biotin-(AAG)15 24
Biotin-(AAC)15 25
Biotin-(AGG)15 26
혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 탐침들과 상보적 결합을 할 것이고, 이를 SSR 탐침-템플릿(template) 혼성체(hybrid)라고 한다.
<3-3> 템플릿의 분리
<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 탐침-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시킨다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300 ㎕로 4회 세척한 후 증류수 50 ㎕를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.
<3-4> PCR 반응
<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5 ㎕ 10× 완충용액. PCR 반응은 72℃에서 2분, 94℃에서 3분동안 가열한 후 94℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 24 싸이클(cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
이와 같은 방법으로 본 발명에서는 초위성체를 함유하고 있는 500개의 DNA 단편을 분리하였다.
< 실시예 4> 분리된 DNA 단편의 서열분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 3에서 분리된 초위성체를 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 5개 이상의 반복 유닛(repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 초위성체를 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 200쌍의 프라이머쌍을 디자인하였다(결과미도시).
< 실시예 5> SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 마늘 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 16점의 재배형 마늘 또는 마늘 품종에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다.
기탁번호 기탁기관 수집국
(원산지)		 형(type)
25 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
38 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
43 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
60 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
183 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
226 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
267 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
273 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
313 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
400 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
495 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
542 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
584 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
618 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
636 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
643 농촌진흥청 대한민국 Allium Sativum L
각각의 PCR 반응 혼합물 (20㎕)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 마늘 주형 DNA 40ng, 정방향 프라이머 0.2μM, 역방향 프라이머 0.6μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT, 서열번호 27) 0.6μM, 1X PCR 반응액 (10mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 Tm(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 30초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 35회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 15회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분의 조건으로 수행하였다.
각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5㎕, Hi-di 포름아미드(formamide) 9.2㎕, 내부 크기 표준시약(Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3㎕을 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.
그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 마늘 재배형 및 마늘 품종들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 8쌍을 확인하여 GB-AS-035(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-040(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-053(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-059(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-072(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-078(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-AS-080(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-AS-109(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다(표 1 참조). 상기 8쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 5와 같다.
기탁번호
프라이머		 25 38 43 60 183 226 267 273
GB-AS-035 298 298 298 298 292 298 298 298
GB-AS-040 294 268 270 290 294 268 268 270
GB-AS-053 294 268 270 200 232 180 180 180
GB-AS-059 306 280 280 302 306 280 280 280
GB-AS-072 238 234 236 238 238 234 232 276
GB-AS-078 194 208 226 194 194 226 212 210
GB-AS-080 174 174 171 174 174 174 174 174
GB-AS-109 221 224 224 221 221 245 224 221
기탁번호
프라이머		 313 400 495 542 584 618 636 643
GB-AS-035 296 298 298 298 298 296 296 288
GB-AS-040 268 270 290 266 270 296 296 300
GB-AS-053 180 224 206 180 184 168 216 224
GB-AS-059 280 280 308 278 280 308 308 312
GB-AS-072 240 204 194 236 204 194 194 202
GB-AS-078 194 208 194 194 208 194 194 226
GB-AS-080 174 171 171 174 171 171 171 174
GB-AS-109 221 206 224 212 224 224 224 218
<110> Rural Development Administration <120> SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-035 <400> 1 ttggactgaa ttctgaatac ct 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse pimer of GB-AS-035 <400> 2 gggtgtgtgg ttcaagga 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-040 <400> 3 cacagcaaca tgcaccat 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-040 <400> 4 tgccggaact cgatatt 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-053 <400> 5 acaaggtcga catcgtttg 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-053 <400> 6 gggcttcacc tgaacaca 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-059 <400> 7 cttgccggaa ctcgatatt 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-059 <400> 8 cacagcaaca tgcaccat 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-072 <400> 9 cacgcgaatc tttcttgg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-072 <400> 10 tgcaaagcaa tatggcag 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-078 <400> 11 tgttccaacc agatttaatg c 21 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-078 <400> 12 aagtggcggt tgtgtctg 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-080 <400> 13 aatctccctc caaagtccc 19 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-080 <400> 14 cctgtatttt gtgtaaagca tca 23 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-AS-109 <400> 15 ggtctcctca tccaccgt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-AS-109 <400> 16 gtgtggggca tgattgac 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor, AP-11 <400> 17 ctcttgctta gatctggact a 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor, AP-12 <400> 18 tagtccagat ctaagcaaga gcaca 25 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GA)20 <400> 19 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AT)20 <400> 20 atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(CA)20 <400> 21 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGC)15 <400> 22 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagc 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GGC)15 <400> 23 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggc 45 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAG)15 <400> 24 aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaag 45 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAC)15 <400> 25 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaac 45 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGG)15 <400> 26 aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggagg 45 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 27 tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR(simple sequence repeat) 프라이머쌍.
  3. 제2항에 있어서, 마늘(Garlic ; Allium Sativum L)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
  4. (a) 마늘로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출 방법.
  5. (a) 마늘 및 대조군 마늘 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 마늘 및 대조군 마늘 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 마늘의 품종 동정 방법.
  6. 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 마늘의 DNA 다형성 검출용 키트.
  7. 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 마늘의 품종 동정용 키트.
KR1020080032587A 2008-04-08 2008-04-08 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 KR101006079B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080032587A KR101006079B1 (ko) 2008-04-08 2008-04-08 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080032587A KR101006079B1 (ko) 2008-04-08 2008-04-08 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090107199A KR20090107199A (ko) 2009-10-13
KR101006079B1 true KR101006079B1 (ko) 2011-01-10

Family

ID=41537036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080032587A KR101006079B1 (ko) 2008-04-08 2008-04-08 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101006079B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220160917A (ko) * 2021-05-28 2022-12-06 전라남도 단영마늘 품종 판별용 마커 및 이의 용도

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101501436B1 (ko) * 2013-02-14 2015-03-18 주식회사 나이벡 생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법
CN111690761B (zh) * 2020-04-09 2021-04-30 广西壮族自治区农业科学院 香葱est-ssr分子标记及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980082207A (ko) * 1997-05-02 1998-12-05 김동태 생물종의 유전형 진단을 위한 다범위 dna 표지인자

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980082207A (ko) * 1997-05-02 1998-12-05 김동태 생물종의 유전형 진단을 위한 다범위 dna 표지인자

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bot. Bull. Acad. Sin. Vol.43:63-68 (2002).
Molecular Ecology Notes Vol.7:708-710 (2007).
Turk. J. Agric. For. Vol.32:357-362 (2008).

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220160917A (ko) * 2021-05-28 2022-12-06 전라남도 단영마늘 품종 판별용 마커 및 이의 용도
KR102567270B1 (ko) 2021-05-28 2023-08-17 전라남도 단영마늘 품종 판별용 마커 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090107199A (ko) 2009-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101183987B1 (ko) 다래에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
Hu et al. Target region amplification polymorphism: a novel marker technique for plant genotyping
KR101403494B1 (ko) 고구마의 품종판별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 및 이를 이용한 고구마의 품종 판별 방법
KR100769366B1 (ko) 녹두에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100996968B1 (ko) 버섯에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101788989B1 (ko) 벼멸구 저항성 벼 품종 판별용 마커 및 이의 용도
KR100842432B1 (ko) 귤에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100645445B1 (ko) 식물체의 다형성 검출용 마커의 제조방법
KR100842434B1 (ko) 인삼에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100781205B1 (ko) 들깨 속 식물에서 분리된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101269311B1 (ko) 심비디움 속 식물에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100781206B1 (ko) 참깨 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101006079B1 (ko) 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101271367B1 (ko) 나리 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ프라이머 및 이의 용도
KR101183996B1 (ko) 메밀에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100842429B1 (ko) 잔디에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100769367B1 (ko) 기장에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR20100079527A (ko) 팥에서 분리된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100842446B1 (ko) 생강에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100842430B1 (ko) 매실에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
CN114410821A (zh) 鉴定苋菜叶色性状的InDel分子标记及其应用
KR101236316B1 (ko) 가시오갈피에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도
KR101183991B1 (ko) 구기자에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100918018B1 (ko) 아마란스에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100803392B1 (ko) 율무에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant