KR20220160917A - 단영마늘 품종 판별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 단영마늘 품종 판별방법에 관한 것으로, 본 발명의 마커 조성물은 단영마늘의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 국내외 마늘 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 품질이 우수하고 거대 주아재배가 가능한 마늘 단영 품종을 특이적으로 구별할 수 있으며, 단영 품종보호 수단으로 유용하다.
Description
본 발명은 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 단영마늘 품종 판별방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
이러한 분자마커는 조기 선발 및 계통 분석을 통하여 육종기간의 단축뿐만이 아니라 육성을 위한 비용도 감소시킬 수 있다. 분자마커는 대표적으로 RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA), RFLP(restriction fragment length polymorphism), AFLP(amplified fragment length polymorphism), SSR(simple sequence repeat), SNP(single nucleotide polymorphism) 등이 있다. 국제 식물 신품종 보호 동맹(UPOV: International Union for the Protection of New Varieties of Plants)에서도 분자표지에 의한 품종별 데이터베이스 구축에 대한 가이드 라인을 제시하고 있으며, 재현성 및 품종별 다형성 정도가 높은 SSR 또는 SNP 마커 활용을 권장하고 있다.
대한민국 전라남도 육성 단영마늘은 품질이 우수하고 거대 주아재배가 가능한 품종으로 산업적 가치가 높아 해외에서 재배되어 국내로 수입될 가능성이 충분함으로 영구적 품종보호 수단이 필요하다. 따라서 단영마늘 품종을 판별하기 위한 분자마커의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 단영마늘 품종 판별방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 조성물을 제공한다.
상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 서열번호 6 및 서열번호7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단영마늘 품종 판별용 조성물을 포함하는 단영마늘 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계, (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계 및 (c) 상기 66번째 서열이 G 와 A인 경우, 단영마늘 품종으로 판단하는 단계를 포함하는, 단영마늘 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 마커 조성물은 단영마늘의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 국내외 마늘 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 품질이 우수하고 거대 주아재배가 가능한 마늘 단영 품종을 특이적으로 구별할 수 있으며, 단영 품종보호 수단으로 유용하다.
도 1은 단영(Dan) 및 단영 원종(Ori)의 유전체 크기를 비교한 것이다.
도 2는 단영 특이적 후보 유전자 11개의 1차 HRM 분석결과이다. 도 2(a)는 후보 유전자 H018890, 도 2(b)는 후보 유전자 H044705, 도 2(c)는 후보 유전자H046781, 도 2(d)는 후보 유전자 H060714, 도 2(e)는 후보 유전자 H066629, 도 2(f)는 후보 유전자 H074637, 도 2(g)는 후보 유전자 H104620, 도 2(h)는 후보 유전자H115020, 도 2(i)는 후보 유전자 H134455, 도 2(j)는 후보 유전자 H137816, 도 2(k)는 후보 유전자 H138564이다.
도 3은 국내외 유전자원 88종에 대해 H046781 유전자를 2차 HRM 분석한 결과이다.
도 4는 국내외 유전자원 88종에 대해 H074637 유전자를 2차 HRM 분석한 결과이다.
도 5는 단영(Dan)과 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 DNA 염기서열을 비교 분석한 결과이다.
도 6은 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 HRM 정방향 분석을 나타내는 것이다.
도 7은 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 HRM 정방향 분석을 나타내는 것이다.
도 8은 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 HRM 역방향 분석을 나타내는 것이다.
도 9는 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 HRM 역방향 분석을 나타내는 것이다.
도 2는 단영 특이적 후보 유전자 11개의 1차 HRM 분석결과이다. 도 2(a)는 후보 유전자 H018890, 도 2(b)는 후보 유전자 H044705, 도 2(c)는 후보 유전자H046781, 도 2(d)는 후보 유전자 H060714, 도 2(e)는 후보 유전자 H066629, 도 2(f)는 후보 유전자 H074637, 도 2(g)는 후보 유전자 H104620, 도 2(h)는 후보 유전자H115020, 도 2(i)는 후보 유전자 H134455, 도 2(j)는 후보 유전자 H137816, 도 2(k)는 후보 유전자 H138564이다.
도 3은 국내외 유전자원 88종에 대해 H046781 유전자를 2차 HRM 분석한 결과이다.
도 4는 국내외 유전자원 88종에 대해 H074637 유전자를 2차 HRM 분석한 결과이다.
도 5는 단영(Dan)과 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 DNA 염기서열을 비교 분석한 결과이다.
도 6은 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 HRM 정방향 분석을 나타내는 것이다.
도 7은 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 HRM 정방향 분석을 나타내는 것이다.
도 8은 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 HRM 역방향 분석을 나타내는 것이다.
도 9는 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 HRM 역방향 분석을 나타내는 것이다.
본 발명은 단영마늘 품종을 판별하기 위한 분자마커를 개발한 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 마커는 마늘 품종인 단영을 특이적으로 판별할 수 있는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에서 사용한 단영 품종은 전라남도에서 출원 및 등록받은 마늘(Allium sativum.L) 품종으로, 출원번호 2015-364로 출원하였으며, 품종보호권 등록번호 제6311호 2016년 9월 27일 품종보호 등록 결정되었다.
본 발명을 통해 국내외 마늘(Allium sativum.L) 품종과 단영품종 마늘을 구별할 수 있으며, 구체적으로 횡성, 산동, 암수재래B, 화미산, 암수W6편, 암수재래c, 흑룡강성, 중공, 암수w.a1, 암수w.a2, 중국용정, 개화연경, 관성재래, 산뚱, 가정시, 강도시, 강소성 사양구1, 강소성 신절시, 강소성 사양구2, 강소성 숙천시, 강소성 고유시, 강소성 원석시, 강소성 보응구, 강소성 태흥시1, 강소성 태흥시2, 강소성 청강시, 강소성 소주시1, 강소성 소주시2, 강소성 소주시3, 강소성 곤산시, 강소성 양주시, 강소성 태창시, 북경시 대흥구1, 북경시 대흥구2, 북경시장1, 북경시장2, 산동성 제남시, 산동성 담성구, 고양, 대화, 명주, 인제, 고성, 단양2, 진천, 서산, 서산해미, 월성, 안동, 의성1, 봉화, 옥구개정, 양평서종, 평창미탄, 암수W.A, 암수W.B, 복지W.A, 복지White, 북해도, 암수재래B, 장야W.6편, 북해도(2), 북해도 White, 대만, Common Red, 화미산, 개화연경, Spain, 중공, 무주, 옥개, 완도, 고창, 나주, 완도, 승주, 진도, 여천, 해남, 무안, 영덕, 양일, 창원, 울주, 함안, 진양, 하동 및 의령 등의 품종과 구별할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 실시예에서 단영(Dan)과 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자가 다형성을 나타냄을 확인하였으며, 단영(Dan) 및 단영-원종(Ori)에서 DNA 염기서열 비교분석한 결과 H046781 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지고 있고, 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 66번째 염기는 G와 A로 확인되었으며, 단영-원종(Ori)에서 H046781 유전자의 66번째 염기는 A임을 확인하였다. 또한, 88종의 유전자원에서 H046781 유전자를 분석한 결과 단영 특이적 패턴을 나타냄을 확인하였다. 따라서 H046781 유전자의 다형성 분석을 통해 단영 품종을 특이적으로 구별 또는 판별할 수 있으며, 구체적으로 H046781 유전자의 66번째 염기가 G 와 A인 경우, 단영 품종임을 확인할 수 있다.
따라서 마늘 품종 중 단영 품종에서 특이적인 단일염기다형성(SNP)을 나타내는 H046781 유전자의 66번째 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 단영마늘 품종 판별 용도로 이용할 수 있다.
따라서 본 발명의 마커는 서열번호 1로 표시되는 마늘의 H046781 유전자에서 66번째 염기가 G 와 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 마커에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 “검출 또는 증폭할 수 있는 제제”란, 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하여 인식하거나 또는 마커를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적인 상기 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 “프라이머”는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 마커 염기서열과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 마커 염기서열과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 실시예에서 서열번호 6 및 서열번호7 프라이머 세트를 이용하여 H046781 유전자를 증폭 및 검출하였는바, 상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 구체적으로 서열번호 6 및 서열번호7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
또한 상기 단영마늘 품종 판별용 조성물을 포함하는 단영마늘 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 상기 판별용 조성물뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계, (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계 및 (c) 상기 66번째 서열이 G 와 A인 경우, 단영마늘 품종으로 판단하는 단계를 포함하는, 단영마늘 품종 판별 방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계의 시료는 식물의 뿌리, 잎, 열매, 줄기를 포함하며, 상기 식물은 구체적으로 마늘일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 DNA의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
(b) 단계에서 상기 마커를 증폭할 수 있는 제제를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다.
상기 PCR 반응은 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시료에서 분리된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외의 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
본 발명의 실시예에서 H046781 유전자에 특이적인 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 HRM-PCR을 수행하였다.
따라서 본 발명의 상기 (b) 단계는 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에서 HRM-PCR(High Resolution Melting curve-Polymerase Chain Reaction)을 수행하였는바, 본 발명의 증폭하는 방법은 구체적으로 HRM-PCR을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 HRM-PCR(High Resolution Melting curve-Polymerase Chain Reaction)은 real-time PCR 기법을 기반으로 한 PCR 방법 중 하나로, PCR 산물(product) 고유의 녹는 온도(melting temperature) 차이를 실시간으로 감지하여 PCR product의 서열 하나의 차이까지 구분하는 PCR 방법이다.
PCR 산물이 만들어지면 그 PCR 산물은 DNA 서열에 따라 고유의 Tm 값을 갖고, 이중가닥(Double strand)에 끼어 들어가는 인터칼레이팅 염료(intercalating dye)는 PCR 산물에 끼어들어가게 되고 형광 파장을 방출(emission)하게 된다. 이때 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 서서히 올리면, PCR 산물은 고유의 Tm 값(특정온도) 에서 변성(denaturation), 즉 이중가닥(double strand)에서 단일가닥(single strand)로 바뀌게 되고 형광 값이 급격히 떨어지게 된다. 이때의 온도를 멜팅 온도(melting temperature)라 하며 이 멜팅온도(melting temperature)의 차이를 검출하여 PCR 산물에서 서열 하나의 차이까지 구분해 낼 수 있다.
본 발명에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 단영(Dan)과 단영-원종Ori)에서 하기 서열번호 1의 H046781 유전자가 다형성을 나타냄을 확인하였으며, 단영(Dan) 및 단영-원종Ori)에서 DNA 염기서열 비교 분석한 결과 H046781 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지고, 단영(Dan)에서 H046781 유전자의 66번째 염기서열이 G와 A로 확인되었으며, 단영-원종(Ori)의 H046781 유전자의 66번째 염기는 A임을 확인하였다. 따라서 H046781 유전자의 다형성 분석을 통해 단영 품종을 구별 또는 판별할 수 있으며, 구체적으로 H046781 유전자의 66번째 염기가 G와 A인 경우, 단영 품종임을 확인할 수 있다.
<서열번호 1: H046781_DAN>
TTCATTCATCATATGTACTCGATTCTTCAGGATACTTACTCCCTCTTCAATTCCTTTTCTATTTA(G,A)TTCTCTGTCTCTAGTCTCCTCTCCCACAAGTAATTATTCTGCAATGTCGCATGCTAAACCTTTTGTTACTTCTTCTTCTTCCTCCTCGAGCTATGCATCTTCTAATGCCAGAAAAAGGTAATTGTCATTAAATTTGTATTTGAACTTTCGAATCACTTTATTACTTACTTTCTTAAATCAAATTCATGGGTGAAAAAAGAATTTTGGGAAAAAACATCTTATGTATGCTACCTACCTGTGGTTTGTTTTATGCGCTTTTTATCCTTTTGTTGAGTTGTTAAAAGAAAACGAAAATGGAATACAGATATTGGCCTCTACTTGTGTATTGTTTATGCTCGTA
따라서 본 발명의 판별 방법은 상기 (c) 단계의 검출결과 서열번호 1로 표시되는 마늘의 H046781 유전자에서 66번째 서열이 G와 A인 경우, 단영마늘 품종으로 판단하는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 단영마늘 품종의 cDNA 염기서열 분석
단영 및 단영-원종(Origin: 개량되지 않은 전통종)의 DNA를 해독하여 분석하였다. 분석결과 단영(Dan) 품종은 가공 데이터 기준으로 54,658,266개 단편, 7,977,641,592 베이스로 분석되었으며 단영-원종(Ori) 품종은 57,582,990개 단편, 8,392,157,843 베이스로 원종과 비교하여 유전자 단편수와 염기 수가 감소되었음을 확인하였다(표 1, 도 1).
| 구 분 |
단편(Read)
(개) |
염기(Read Base)
(베이스) |
|||
| 단 영 | 단영-원종 | 단 영 | 단영-원종 | ||
| DNA 염기서열 | 기본 데이터 (Raw data) |
58,822,820 | 61,940,292 | 8,882,245,820 | 9,352,984,092 |
| 가공 데이터 (Trimmed data) |
54,658,266 | 57,582,990 | 7,977,641,592 | 8,392,157,843 | |
2. 단영마늘 품종 특이적 유전자 선발 및 프라이머 제조
단영 품종 특이적 유전자를 검출하기 위해 단영(Dan)과 단영-원종(Ori) 유전자를 비교분석하여 27,456 유전자에서, 139,999개의 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorpism, SNP)를 나타냄을 확인하였다(표 2).
| 단편(read) | 다형성 | 후보유전자 선발 | |||
| 단영 (Dan) |
단영-원종 (Origin) |
계 | 유전자 | SNP | |
| 54,658,266 | 57,582,990 | 112,241,256 | 27,456 | 139,999 | 11 |
이 중 단영(Dan)은 단영-원종(Ori)의 돌연변이 육종을 통하여 육성된 품종이므로, 단영-원종(Ori)은 동형접합형(Homozygous)이고 단영(Dan)은 이형접합형(Heterozygous)인 SNP를 검색하여 통합적인 유전체학 뷰어(Integrative Genomics Viewer, IGV)로 단편들을 확인하여 유용한 SNP를 포함하고 있는 후보 유전자 11개를 선발하였다. 그 다음, 표 3과 같이 각 후보 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제조하였다.
| 순서 | 후보 유전자 |
SNP | 프라이머(primer) | Blast-X 분석 | ||
| 단영 | 원종 | 정방향(forward, F) | 역방향(reverse, R) | |||
| 1 | H018890 |
C/T | T | TGCATGCATGTATGTATATGTGTC (서열번호2) |
TGGTTAGAAAGGAGTCCATACATWTT (서열번호3) |
conserved Plasmodium protein, unknown function [Plasmodium ovale] |
| 2 | H044705 |
G/A | A | TGTCTTGGGGACATGATGATT (서열번호4) |
TCTTGTTCTCCTTRGCCACCA (서열번호5) |
probableinositoloxygenase[Asparagusofficinalis] |
| 3 | H046781 |
G/A | A | CTCCCTCTTCAATTCCTTTTCT (서열번호6) |
TGGGAGAGGAGACTAGAGACAGA (서열번호7) |
tRNA2'-phosphotransferase1-like[Asparagusofficinalis] |
| 4 | H060714 |
T/C | C | TCGAACTGTAGCCTCCTTTCA (서열번호8) |
AGTGTCGAACAGWTGTACCTCAA (서열번호9) |
No significant similarity found |
| 5 | H066629 |
T/C | C | TGTTCTGCTCAACCCTAACAA (서열번호10) |
TCTGGAGATTGGGGTTTGAC (서열번호11) |
GntRfamilytranscriptionalregulator[Photobacteriummarinum] |
| 6 | H074637 |
C/T | T | GGACTAGTCAATGAATATGCAGAGTA (서열번호12) |
GTGGAAGGTTTATGCCTTGG (서열번호13) |
UDP-glycosyltransferase 83A1-like [Phoenix dactylifera] |
| 7 | H104620 |
G/A | A | CCCTCAGGGCAAAAGAAAT (서열번호14) |
CCACAAAGGTCTTTGGTCAT (서열번호15) |
uncharacterizedproteinLOC109824056[Asparagusofficinalis] |
| 8 | H115020 |
A/C | C | GCGTGGATGGATCTGAAACT (서열번호16) |
GAGATAGGGTCGGCAATGG (서열번호17) |
hypothetical protein AALP_AA6G245200 [Arabis alpina] |
| 9 | H134455 |
G/A | A | TCAGGACCACACAACAAAACA (서열번호18) |
GTGAATATTGTTGCATAAATGACAG (서열번호19) |
No significant similarity found |
| 10 | H137816 |
C/T | T | AACTTCAGATCAATCAAACTGTCAA (서열번호20) |
AGACTGGGACCAGGCTTTC (서열번호21) |
hypothetical protein CRG98_008717 [Punica granatum] |
| 11 | H138564 |
C/T | T | GTCGACCAGAGCATCAATCA (서열번호22) |
ATCCTATTCCCCATGCTGTG (서열번호23) |
proteinZINCINDUCEDFACILITATOR-LIKE1-like[Asparagusofficinalis] |
| ※ Blast-X 분석 : 미국 국립생물정보센터(www.ncbi.nlm.nih.gov) 유사 단백질 탐색 | ||||||
3. 단영 특이적 후보 유전자의 1차 HRM 분석
단영(Dan)과 단영-원종(Ori) 품종에서 선별한 11개의 후보 유전자에 대해 고해상도 용융(High Resolution Melt, HRM)을 이용한 분석에서 단영 품종에 특이적으로 다형성을 나타내는 유전자를 확인하였다.
분석결과, 도 2(a)-(k)에 나타난 바와 같이 H046781 유전자와 H074637 유전자인 2개 유전자에서 단영(Dan)과 단영-원종(Ori) 사이의 다형성이 나타나며, 그 외 9개 후보 유전자에는 다형성이 나타나지 않음을 확인하였다(표 4).
| 순서 | 후보 유전자 | 다형성 | 순서 | 후보 유전자 | 다형성 |
| 1 | H018890 | x | 2 | H044705 | x |
| 3 | H046781 | 유 | 4 | H060714 | x |
| 5 | H066629 | x | 6 | H074637 | 유 |
| 7 | H104620 | x | 8 | H115020 | x |
| 9 | H134455 | x | 10 | H137816 | x |
| 11 | H138564 | x | - | ||
4. 단영 특이적 유전자의 2차 HRM 분석을 통한 검증
국내외 마늘 유전자원 88개(표 5)에서 H046781 유전자와 H074637 유전자에 대해 2차 HRM 분석을 수행하였다. 분석결과, 도 3에서 보는 바와 같이 H046781 유전자의 경우 다른 국내외 유전자원과 단영-원종(Ori)은 동일하게 약 73℃에서 동형접합형(Homozygous) 싱글 피크가 확인 되었으며 이와 대조적으로 단영(Dan)에서는 약 71℃와 74℃에서 이형접합형(Heterozygous) 더블 피크가 관찰되어 단영 특이적 패턴을 나타냄을 확인할 수 있었다. 다만, 도 4에서 보는 바와 같이 H074637 유전자에서는 단영 특이적 패턴을 나타내지 않았다.
| 수집번호 | 자원명 | 수집번호 | 자원명 | 수집번호 | 자원명 | 수집번호 | 자원명 |
| J1 | 횡성 | J23 | 강소성 보응구 | J45 | 진천 | J67 | 개화연경 |
| J2 | 산동 | J24 | 강소성 태흥시1 | J46 | 서산 | J68 | Spain |
| J3 | 암수재래B | J25 | 강소성 태흥시2 | J47 | 서산해미 | J69 | 중공 |
| J4 | 화미산 | J26 | 강소성 청강시 | J48 | 월성 | J70 | 무주 |
| J5 | 암수 W6편 | J27 | 강소성 소주시1 | J49 | 안동 | J71 | 옥개 |
| J6 | 암수재래c (9612) | J28 | 강소성 소주시2 | J50 | 의성1 | J72 | 완도 |
| J7 | 흑룡강성 | J29 | 강소성 소주시3 | J51 | 봉화 | J73 | 고창 |
| J8 | 중공 | J30 | 강소성 곤산시 | J52 | 옥구개정 | J74 | 나주 |
| J9 | 암수w.a1 | J31 | 강소성 양주시 | J53 | 양평서종 | J75 | 완도 |
| J10 | 암수w.a2 | J32 | 강소성 태창시 | J54 | 평창미탄 | J76 | 승주 |
| J11 | 중국용정 | J33 | 북경시 대흥구 1 | J55 | 암수W.A | J77 | 진도 |
| J12 | 개화연경 | J34 | 북경시 대흥구 2 | J56 | 암수W.B | J78 | 여천 |
| J13 | 관성재래 | J35 | 북경시장 1 | J57 | 복지 W.A | J79 | 해남 |
| J14 | 산뚱 | J36 | 북경시장 2 | J58 | 복지 White | J80 | 무안 |
| J15 | 가정시 | J37 | 산동성 제남시 | J59 | 북해도 | J81 | 영덕 |
| J16 | 강도시 | J38 | 산동성 담성구 | J60 | 암수재래 B | J82 | 양일 |
| J17 | 강소성사양구1 | J39 | 고양 | J61 | 장야 W.6편 | J83 | 창원 |
| J18 | 강소성 신절시 | J40 | 대화 | J62 | 북해도(2) | J84 | 울주 |
| J19 | 강소성 사양구2 | J41 | 명주 | J63 | 북해도 White | J85 | 함안 |
| J20 | 강소성 숙천시 | J42 | 인제 | J64 | 대만 | J86 | 진양 |
| J21 | 강소성 고유시 | J43 | 고성 | J65 | Common Red | J87 | 하동 |
| J22 | 강소성 원석시 | J44 | 단양2 | J66 | 화미산 | J88 | 의령 |
5. 단영 및 단영-원종에서 H046781 유전자 DNA 비교 분석
2차 HRM 분석 검증에서 단영 특이적 패턴을 나타낸 H046781 유전자에 대해 단영 및 단영-원종에서 DNA 염기서열을 비교 분석하였고 도 5에 나타내었다.
H046781 유전자의 SNP에 대해 HRM 분석을 수행한 결과, 도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이 단영-원종(Ori)에서는 싱글피크를 나타내는 반면, 단영(Dan)에서는 더블피크를 나타냄을 확인할 수 있다. 도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이 HRM 역방향 분석에서도 마찬가지 결과를 나타내었다. 종합적인 결과에서, 단영(Dan) 품종은 서열번호 1으로 표시되는 염기서열의 66번째 염기가 G 와 A이며, 단영-원종(Ori) 품종은 66번째 염기가 A를 나타냄을 확인하였다.
이를 통해 본 발명에서 선별한 마커 조성물을 이용하여 단영 품종을 구별할 수 있음을 확인하였으며 국내외 마늘 유전자원의 분자마커로서 활용 가능성을 제시한다.
<110> JeollaNamdo
<120> Marker for discriminating DANYOUNG garlic and use thereof
<130> DP20190375
<160> 23
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 406
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H046781_DAN
<400> 1
ttcattcatc atatgtactc gattcttcag gatacttact ccctcttcaa ttccttttct 60
atttarttct ctgtctctag tctcctctcc cacaagtaat tattctgcaa tgtcgcatgc 120
taaacctttt gttacttctt cttcttcctc ctcgagctat gcatcttcta atgccagaaa 180
aaggtaattg tcattaaatt tgtatttgaa ctttcgaatc actttattac ttactttctt 240
aaatcaaatt catgggtgaa aaaagaattt tgggaaaaaa catcttatgt atgctaccta 300
cctgtggttt gttttatgcg ctttttatcc ttttgttgag ttgttaaaag aaaacgaaaa 360
tggaatacag atattggcct ctacttgtgt attgtttatg ctcgta 406
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H018890-forward
<400> 2
tgcatgcatg tatgtatatg tgtc 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H018890-reverse
<400> 3
tggttagaaa ggagtccata catwtt 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H044705-forward
<400> 4
tgtcttgggg acatgatgat t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H044705-reverse
<400> 5
tcttgttctc cttrgccacc a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H046781-forward
<400> 6
ctccctcttc aattcctttt ct 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H046781-reverse
<400> 7
tgggagagga gactagagac aga 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H060714-forward
<400> 8
tcgaactgta gcctcctttc a 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H060714-reverse
<400> 9
agtgtcgaac agwtgtacct caa 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H066629-forward
<400> 10
tgttctgctc aaccctaaca a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H066629-reverse
<400> 11
tctggagatt ggggtttgac 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H074637-forward
<400> 12
ggactagtca atgaatatgc agagta 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H074637-reverse
<400> 13
gtggaaggtt tatgccttgg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H104620-forward
<400> 14
ccctcagggc aaaagaaat 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H104620-reverse
<400> 15
ccacaaaggt ctttggtcat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H115020-forward
<400> 16
gcgtggatgg atctgaaact 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H115020-reverse
<400> 17
gagatagggt cggcaatgg 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H134455-forward
<400> 18
tcaggaccac acaacaaaac a 21
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H134455-reverse
<400> 19
gtgaatattg ttgcataaat gacag 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H137816-forward
<400> 20
aacttcagat caatcaaact gtcaa 25
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H137816-reverse
<400> 21
agactgggac caggctttc 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H138564-forward
<400> 22
gtcgaccaga gcatcaatca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H138564-reverse
<400> 23
atcctattcc ccatgctgtg 20
Claims (5)
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 마커 조성물.
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 단영마늘 품종 판별용 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 서열번호 6 및 서열번호7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것인, 조성물. - 제 2항의 조성물을 포함하는 단영마늘 품종 판별용 키트.
- (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계,
(b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 66번째 염기가 G 및 A이고, 상기 66번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계 및
(c) 상기 66번째 서열이 G 와 A인 경우, 단영마늘 품종으로 판단하는 단계를 포함하는, 단영마늘 품종 판별 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210069164A KR102567270B1 (ko) | 2021-05-28 | 2021-05-28 | 단영마늘 품종 판별용 마커 및 이의 용도 |
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| KR101006079B1 (ko) * | 2008-04-08 | 2011-01-10 | 대한민국 | 마늘에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
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-
2021
- 2021-05-28 KR KR1020210069164A patent/KR102567270B1/ko active IP Right Grant
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| KR101395883B1 (ko) * | 2012-04-26 | 2014-05-15 | 전남대학교산학협력단 | 양파의 구피색 선발용 분자 표지 |
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Non-Patent Citations (2)
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| LEE ET AL., KOREAN SOCIETY FOR HORTICULTURAL SCIENCE, 2014, 5:109_110 * |
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