KR101501436B1 - 생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 생리활성 펩타이드가 자기회합되어 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있는 젤 형태의 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 지지체는 임플란트 등 다양한 의료기기 표면에 도포가 가능하고, 입자형 골이식재와 혼합하여 적용이 가능하므로, 치과영역에서 뿐만 아니라 종양환자의 골조직 수복, 정형외과 및 성형외과 영역에서도 기존의 의료기기의 치료효과를 증가시켜 조직재생을 극대화할 수 있는 효과가 있다.

Description

생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법{Osteogenic Peptide Self-assembled Gel-type Scaffold and Method for Preparing the Same}
본 발명은 생리활성 펩타이드가 자기회합된 젤 형태의 지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 생리활성 펩타이드가 자기회합되어 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있는 젤 형태의 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 질병 또는 사고로 인하여 생체조직이나 장기의 손상을 입었을 때, 손상된 조직을 재생시키거나 대체시킬 수 있는 치료방법이다. 이 방법에 따르면 손상된 조직을 구성하는 세포 또는 줄기세포를 3차원 구조를 가진 다공성 고분자 지지체에 이식하고, 바이오 리엑터에서 일정기간 배양시킨 후에 외과적 수술을 통해 손상부위에 이식한다. 여기에서 사용되는 고분자 지지체는 세포 외기질을 구성하는 단백질, 세라믹, 의료용 합성고분자를 사용하고 있다.
또한 이식된 세포의 성장과 특정 조직으로 분화를 촉진하기 위해 조직성장인자 (예: 골형성 단백질)를 지지체에 첨가하여 조직재생능을 증가시키고자 하였다(대한민국 등록특허 제10-0757241호). 이러한 조직성장인자의 경우, 분자량이 수십 Kda에 이르는 단백질이기 때문에 삼차구조를 유지하지 않으면 활성이 소실되기 쉽다. 또한 체내에서 단백질 분해효소에 의해 활성이 감소하며, 면역반응을 유발할 가능성이 있다.
지지체에 사용되는 세라믹과 합성 고분자의 경우, 세포에 대한 활성이 없기 때문에, 조직성장인자를 지지체내에 함유시키거나, 표면에 고정 또는 코팅하는 시도가 이루어졌다. 표면에 코팅하는 경우, 단순한 물리적인 흡착이기 때문에 장기간 지속하기가 어려우며, 세포와의 초기 상호작용도 불규칙하여 정확한 치료효과를 얻을 수가 없다. 표면에 화학적으로 고정하는 경우에는 안정한 결합을 형성할 수는 있으나, 표면에 고정되는 양에 한계가 있으며, 화학적 반응에 의해 조직성장인자의 활성이 감소하는 경향이 있다.
상기의 문제를 해결하기 위해, 친수성 생리활성 펩타이드와 소수성의 카본체인의 자가회합에 의해 젤 형태 또는 다공성의 나노섬유 구조를 형성하여 세포를 배양할 수 있는 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제10-0630903호). 상기의 자가회합에 의한 지지체는 세포외기질의 특징을 모방한 구조를 가지고 있다. 친수성 생리활성 펩타이드는 세포의 부착과 분화를 증가시키거나, 특정 조직 재생에 특이적인 펩타이드를 사용하여 치료효과를 현저하게 증가시킬 수 있다. 그러나 친수성 부분과 소수성 부분을 서로 화학적으로 결합된 물질을 먼저 합성해야 하고, 이 합성체를 임계 마이셀 농도 이상으로 수용액 상에 적용해야 자가회합이 일어날 수 있다.
이에, 본 발명자들은 소수성의 카본체인을 생리활성 펩타이드에 도입할 필요가 없이, 생리활성 펩타이드를 구성하고 있는 친수성 또는 소수성 아미노산의 배열을 조절하여 자가회합에 의해 지지체를 형성하는 펩타이드를 발굴하고, 상기 펩타이드를 자기회합시켜 젤 형태의 지지체를 제조하고, 상기 제조된 지지체에 중배엽 유래 줄기세포를 시딩(seeding)한 다음 성장인자 없이 배양한 결과, 중배엽 유래 줄기세포가 골조직으로 분화되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자기회합에 의해 지지체를 형성하는 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 펩타이드가 자기회합되어 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있는 젤 형태의 지지체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 펩타이드가 자기회합되어 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K중 적어도 하나와 S가 각각 A로 치환되어 있고, R중 적어도 하나가 F로 치환된 생리활성 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나가 F로 치환되어 있고, P 및 I가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 생리활성 펩타이드가 자기회합되어 있는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제공한다.
본 발명은 또한, 자기회합(Self-assembly)에 의해 지지체를 형성하는 생리활성 펩타이드를 용매에 녹인 후, 상온에 방치시키는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고 점도가 1000cps 내지 3000cps 이며, 직경이 20nm 내지 60nm인 나노형상 젤 형태의 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 지지체는 임플란트 등 다양한 의료기기 표면에 도포가 가능하고, 입자형 골이식재와 혼합하여 적용이 가능하므로, 치과영역에서 뿐만 아니라 종양환자의 골조직 수복, 정형외과 및 성형외과 영역에서도 기존의 의료기기의 치료효과를 증가시켜 조직재생을 극대화할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 자기회합에 의해 형성된 젤 형태의 지지체이다.
도 2는 시차주사전자현미경(SEM)으로 젤 형태의 지지체의 미세구조를 관찰한 것이다.
도 3은 젤 형태의 지지체에 중배엽 유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 배양하여 골조직으로 분화한 것을 공초점 현미경(confocal microscope)로 관찰한 것이다.
도 4는 토끼의 두개골 결손부에 지지체를 이식하고, 4주후 골재생 정도를 광학현미경으로 관찰한 것이다.
본 발명에서는 골분화능을 가진 생리활성 펩타이드를 자가회합 시키는 것을 특징으로 하는 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있는 젤 형태의 지지체를 제조하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 세포외기질을 구성하는 단백질의 아미노산 서열 GLRSKSKKFRRPDIQYPDA(서열번호 1)의 일부분을 변형시켜 생리활성 펩타이드 1 내지 3를 제조하였다.
생리활성 펩타이드 1 : GLAAKAAFARADIQYADA(서열번호 2)
생리활성 펩타이드 2 : GLRSKSKKFFRADAQYADA(서열번호 3)
생리활성 펩타이드 3 : GLRAKAKAKFFRPDIQFPDA(서열번호 4)
본 발명에서 세포외기질을 구성하는 단백질은 대한민국 등록특허 제10-0739528호에 개시되어 있는 인간 오스테오폰틴 (osteopontin)에서 유래한 펩타이드이며, 자기 화합에 의해 젤 형태로 변화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 이외에도 대한민국 등록특허 제10-0757241호에 개시되어 있는 골형성 단백질 유래 펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 우선, 서열번호 1의 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P를 각각 A로 치환시킴으로써, 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 반복되는 패턴을 유지하여 자가회합을 할 수 있는 형태로 구성되었으며, 기존 펩타이드가 가지고 있는 P을 A로 치환하여 꺾임 구조를 제거하여 자가회합 반응이 용이하도록 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드에 관한 것이다.
상기 생리활성 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 서열번호 1의 K중 적어도 하나와 S를 각각 A로 치환시키고, R중 적어도 하나를 F로 치환시킴으로써, N- 말단 부분은 친수성과 소수성 아미노산을 반복되게 하였고, C- 말단 부분은 그 곁가지가 양전하와 음전하로 이루어지는 서열을 반복적으로 넣어주어 자가회합 반응이 용이하도록 하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K중 적어도 하나와 S가 각각 A로 치환되어 있고, R중 적어도 하나가 F로 치환된 생리활성 펩타이드에 관한 것이다.
상기 생리활성 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 서열번호 1의 R중 적어도 하나를 F로, P 및 I를 각각 A로 치환시킴으로써, N- 말단 부분은 곁가지가 양전하와 음전하로 이루어지는 서열을 반복적으로 넣어주었고, C-말단 부분의 P를 A로 치환하여 꺾임 구조를 제거함과 동시에 다시 양전화와 음전하로 이루어지는 서열을 반복되게 함으로써 자가회합 반응이 용이하게 하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나가 F로 치환되어 있고, P 및 I가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드에 관한 것이다.
상기 생리활성 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 3의 생리활성 펩타이드 2와 서열번호 4의 생리활성 펩타이드 3에 연속된 F를 배열함으로써, 파이결합에 의한 자가회합 반응이 일어날 수 있도록 하였다.
서열번호 2 내지 4의 생리활성 펩타이드 1 내지 3은 소수성 카본체인이 필요 없고, 어떠한 화학적 성분의 첨가가 필요 없으며, 친수성 및 소수성 아미노산의 배열에 의해 자가회합이 일어날 수 있다. 자기회합에 의해 형성된 젤 형태의 지지체는 조직공학용 세포배양에 사용될 수 있으며, 지지체 자체는 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시킬 수 있으므로, 부가적으로 조직성장인자를 첨가하지 않아도 된다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 서열번호 2 내지 4로 표시되는 생리활성 펩타이드 1 내지 3을 용매에 녹인 후, 방치하여 젤 형태의 지지체를 제조하였다.
상기 용매는 정제수, 세포배양용 배지, 인산염완충액(phosphate buffer, pH7.4)을 사용할 수 있으며, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴과 같은 유기용매를 사용해도 무방하나 정제수를 사용하는 것이 바람직하다.
젤 형태의 지지체의 점도는 펩타이드의 함량으로 조절할 수 있으며, 펩타이드는 용매 1ml당 50mg 내지 100mg로 녹이는 것이 바람직하다. 만약 생리활성 펩타이드를 50mg/ml 미만으로 녹일 경우, 젤이 형성되지 않으며 100mg/ml을 초과할 경우, 점도가 높아 젤의 유동성이 떨어지는 단점이 있다.
젤 형태의 지지체를 제조하기 위해서는 생리활성 펩타이드를 용매에 녹인 후, 상온에서 5분 내지 15분 방치하는 것이 바람직하다. 만약 5분 미만으로 방치할 경우, 젤이 형성되지 않으며 15분을 초과할 경우, 점도가 높아 젤의 유동성이 떨어지는 단점이 있다. 따라서, 더욱 바람직하게는 상온에서 10분간 방치할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 자기회합(Self-assembly)에 의해 지지체를 형성하는 생리활성 펩타이드를 용매에 녹인 후, 상온에 방치시키는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 젤 형태의 지지체의 미세구조를 관찰하였다. 그 결과, 직경이 20mm 내지 60mm 이며 나노섬유 형상인 것을 알 수 있었다. 또한, 줄기세포를 지지할 수 있는 구조임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 생리활성 펩타이드를 용매 1ml당 50mg 내지 100mg로 녹여 점도 1000cps 내지 3000cps의 젤 형태 지지체를 수득할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 생리활성 펩타이드를 함유하는 젤 형태의 지지체에 중배엽 유래 줄기세포를 시딩(seeding)하고 14일동안 배양한 후, 세포외 기질에 침착된 칼슘을 관찰한 결과, 펩타이드를 함유하지 않은 군에 비해 칼슘의 양이 많은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 젤 형태의 지지체는 줄기세포의 골조직 분화 촉진능을 가진다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 젤 형태의 지지대의 골재생능을 확인하기 위하여 뉴질랜드 흰토끼의 두개골에 결손부를 형성시킨 후, 젤 형태의 지지대를 이식하고 봉합하여 표본을 채취한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 생리활성 펩타이드를 포함하는 젤 형태의 지지대는 중배엽 유래 줄기세포를 골조직으로 분화시켰고, 생체내에서 골재생 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 생리활성 펩타이드로 구성된 젤 형태의 지지체는 단독으로 사용하거나, 세포를 배양하여 이식할 수 있다. 또한, 임플란트 등의 다양한 의료기기 표면에 적용하거나, 입자형 골이식재와 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 입자형 골이식재는 생물유래 골미네랄의 분말 및 그 다공성 블럭, 합성 수산화아파타이트의 분말 및 그 다공성 블럭, 트리칼슘인산의 분말 및 그 다공성 블럭, 모노칼슘인산의 분말 및 그 다공성 블럭, 이산화 규소(실리카)를 주성분으로 하는 골이식재, 실리카와 고분자의 혼합체를 주성분으로 하는 골충진 이식재, 키토산, 생체적합성 고분자를 주성분으로 하는 미립자 및 티타늄을 포함할 수 있다.
입자형 골이식재와 혼합할 경우, 생리활성 펩타이드로 구성된 젤 형태의 지지체 1ml와 골이식재 0.1g 내지 1.0g을 혼합하여 사용할 수 있다. 이때, 골이식재 1.0g 당 생리활성 펩타이드는 40mg/ml 내지 400mg/ml이 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조되고, 점도가 1000cps 내지 3000cps 이며, 직경이 20nm 내지 60nm인 나노형상 젤 형태의 지지체에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자기회합에 의해 지지체를 형성하는 생리활성 펩타이드의 제조
생리활성 펩타이드를 제조하기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 세포외기질을 구성하는 단백질인 인간 오스테오폰틴 (osteopontin)에서 유래한 펩타이드를 표 1과 같이 변형시켜, 서열번호 2 내지 4로 표시되는 생리활성 펩타이드 1 내지 3을 제조하였다.
치환된 펩타이드 서열
osteonpontin 유래 펩타이드
서열번호 1
G
L
R
S
K
S
K
K
F
R
R
P
D
I
Q
Y
P
D
생리활성 펩타이드 1
서열번호 2
G
L
A
A
K
A
K
A
F
A
R
A
D
I
Q
Y
A
D
생리활성 펩타이드 2
서열번호 3
G
L
R
A
K
A
K
A
F
F
R
P
D
I
Q
Y
P
D
생리활성 펩타이드 3
서열번호 4
G
L
R
S
K
S
K
K
F
F
R
A
D
A
Q
Y
A
D
상기 서열번호 2 내지 4로 표시되는 생리활성 펩타이드 1 내지 3은 세포외기질을 구성하는 인간 오스테오폰틴 단백질의 C 말단으로부터 순서대로 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다. 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin(0.075m㏖/g, 100~200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50㎎의 Rink resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후, Fmoc-group의 제거를 위하여, 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. 0.5M 아미노산 용액(용매: DMF), 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP), 0.5M HBTU(용매: DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 NMP로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후, 디프로텍션(deprotection) 하여 Fmoc-group을 제거하였다.
닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하여 합성을 확인하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 resin은 THF나 DCM으로 건조시킨 후 TFA cleavage cocktail을 resin 1g당 20㎖의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 다음, 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리하였다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였고, 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결 건조하였다.
합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제하였다. 정제된 펩타이드의 순도와 분자량을 확인하여 표 2에 나타내었고, 분석용 HPLC의 이동상 gradient 조건을 표 3에 나타내었다.
정제된 펩타이드의 분자량, 순도, pI
분자량 isoelectric point (pI) 순도
생리활성 펩타이드 1 1823.04 5.96 96.2
생리활성 펩타이드 2 2159.43 9.99 95.9
생리활성 펩타이드 3 2143.43 10.28 95.4
HPLC분석조건
column : C18 5㎛ 4.6X250mm
분석파장 : 분석파장: 214 nm
이동상 : H2O containing 0.1% TFA(trifluoro acetic acid), acetonitrile containin 0.1% TFA
분석용 HPLC의 이동상 gradient 조건
Retention Time (min) Solvent A (H2O) % Solvent B (ACN) % 비 고
0 100 0 5min 이후 분당 1%씩 ACN 증가, 대략 29.5 31.5% ACN 함량에서 peak가 나타남.
5 100 0
105 0 100
실시예 2: 생리활성 펩타이드를 이용한 젤 형태의 지지체 제조
실시예에서 정제된 서열번호 2의 생리활성 펩타이드 1을 10, 20, 50mg/ml 농도로 정제수에 녹인 후, 상온에서 방치하였을 때, 젤 형태로 변하는지 관찰하였다. 약 8-10분 후에 젤 형태의 지지체를 형성하였다(도 1).
그 결과, 10mg/ml의 경우, 젤이 형성되지 않았으며, 20mg/ml의 경우, 유동성이 있는 젤이 형성되었고, 50mg/ml의 경우, 점도가 높은 젤 (2000cps, 20℃, 20rpm)이 형성되었다. 따라서, 생리활성 펩타이드를 50mg/ml 농도로 녹이는 것이 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 생리활성 펩타이드를 이용한 젤 형태의 지지체 제조
실시예에서 정제된 서열번호 3의 생리활성 펩타이드 2를 50mg/ml 농도로 정제수에 녹인 후, 상온에서 10분간 방치하여 젤 형태의 지지체를 수득하였다.
실시예 4: 생리활성 펩타이드를 이용한 젤 형태의 지지체 제조
실시예에서 정제된 서열번호 4의 생리활성 펩타이드 3을 50mg/ml 농도로 정제수에 녹인 후, 상온에서 10분간 방치하여 젤 형태의 지지체를 수득하였다.
실시예 5: 자가회합에 의해 형성된 젤 형태의 지지체의 미세구조
시차주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 실시예 2 내지 4에서 제조된 젤 형태의 지지체의 미세구조를 관찰하였다. 젤 형태의 지지체는 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)로 3시간 처리하고, 1% 사산화 오스뮴 (osmium tetroxide)에서 후고정한 다음, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100%의 알코올로 탈수시켜 현미경의 시편을 만들었다. 시차주사전자현미경으로 상기 시료를 관찰한 결과, 도2에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 젤 형태의 지지체(a), 실시예 3에서 제조된 젤 형태의 지지체(b) 및 실시예 4에서 제조된 젤 형태의 지지체(c) 모두 나노섬유로 구성되어 있으며, 나노섬유의 직경은 25-50nm로 관찰되었다. 이는 세포외기질을 구성하는 콜라겐 분자 20-30개가 모인 것과 비슷한 직경이다.
따라서, 실시예 2 내지 4의 지지체는 세포외기질과 유사한 환경을 조성하여 세포배양에 적합한 조건을 제공할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
실시예 6: 젤 형태의 지지체에 의한 줄기세포의 골조직 분화능
실시예 2에서 제조된 젤 형태의 지지체에 중배엽유래 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, Lonza)를 1X105개를 시딩하고, 칼세인 (calcein, sigma, 칼슘염색)이 함유된 경조직 형성 배지에서 14일 동안 배양하였다. 배양된 중배엽유래 줄기세포를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 세포를 1% 트리톤 엑스 100 (triton X-100)으로 처리한 후, DAPI (Sigma)로 핵을, 로다민 팔로이딘(Rhodamine phalloidin)(Molecular Probe, red)으로 세포질의 액틴 (actin)을 염색하였다. 세포외 기질에 침착된 칼슘(green)을 공초점 주사형광 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였다(도 3).
도 3에서, negative control은 24well에 세포를 배양한 것이다. 대조군은 poly glutamic acid로 구성된 펩타이드이며, 세포에 대한 활성이 없다. 도 3에서 (a)는 미처리군 (no treatment, NT)이고, (b)는 poly glutamic acid, (c)는 실시예 2에서 제조된 지지체, (d)는 실시예 3에서 제조된 지지체, (e)는 실시예 4에서 제조된 지지체에 의한 세포내의 칼슘 침착정도를 나타낸 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 미처리군(a)과 poly glutamic acid (b)에 비해, 실시예 2에서 제조된 지지체(c), 실시예 3에서 제조된 지지체(d) 및 실시예 4에서 제조된 지지체(e)에서 더 많은 칼슘의 형광이 나타났다. 또한 실시예 2 내지 4의 지지체 사이에서는 큰 차이가 보이지 않았으므로, 실시예 2 내지 4의 지지체가 중배엽유래 줄기세포의 골조직으로 분화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 젤 형태의 지지체에 의한 골결손부에서 골재생능
뉴질랜드 흰토끼 (종명: cuniculus)의 두개골에 직경 8mm의 결손부를 형성시키고, 실시예 2에서 제조된 지지체를 결손부당 0.2mL를 이식하고, 골막과 피부를 이중봉합하였다. 이식 4주 후에 동물을 희생시키고, 채취한 표본은 포르말린 용액에 넣어 고정시킨 후 조직을 포매하여 두께 20 ㎛의 시편으로 제작하였다. 제작된 시편은 염기성 푹신과 톨루이딘 블루로 염색하여 비탈회 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경으로 관찰하였다.
도 4에서 (a)/(d)는 미처리군 (no treatment, NT)이고, (b)/(e)는 poly glutamic acid, (c)/(f)는 실시예 2에서 제조된 지지체를 이식한 군으로 이식한지 4주후의 조직사진을 나타낸 것이다 (OB: old bone, NB: new bone, arrow: bone margin, CT: connective tissue). (a)/(b)/(c)는 20배율, (d)/(e)/(f)는 100배율로 관찰한 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 지지체를 이식한 군에서 보다 많은 신생골이 골결손부 중앙부위까지 형성되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 실시예 2에서 제조된 지지체는 생체내의 골결손부위에서 골재생 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에서는 생리활성 펩타이드를 합성하고, 자가회합에 의해 젤 형태의 지지체를 제조하여, 상기의 지지체에 중배엽유래 줄기세포를 이식하여 골조직으로의 분화 및 동물의 골결손부에 이식하여 골재생능을 확인한 결과, 상기의 지지체는 중배엽유래 줄기세포를 골조직으로 분화를 증가시켰고, 생체내에서 골재생 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> nibec <120> Osteogenic Peptide Self-assembled Gel-type Scaffold and Method for Preparing the Same <130> P13-B041 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> human <400> 1 Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 <400> 2 Gly Leu Ala Ala Lys Ala Lys Ala Phe Ala Arg Ala Asp Ile Gln Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ala <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 <400> 3 Gly Leu Arg Ala Lys Ala Lys Ala Phe Phe Arg Pro Asp Ile Gln Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 3 <400> 4 Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Phe Arg Ala Asp Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ala

Claims (25)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 생리활성 펩타이드.
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K중 적어도 하나와 S가 각각 A로 치환되어 있고, R중 적어도 하나가 F로 치환된 생리활성 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 생리활성 펩타이드.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나가 F로 치환되어 있고, P 및 I가 각각 A로 치환된 생리활성 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 생리활성 펩타이드.
  7. 자기회합(Self-assembly)에 의해 지지체를 형성하는, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P가 각각 A로 치환된 펩타이드; (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K중 적어도 하나와 S가 각각 A로, R중 적어도 하나가 F로 치환된 펩타이드; 및 (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나가 F로, P 및 I가 각각 A로 치환된 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 생리활성 펩타이드를 용매에 녹인 후, 상온에 방치시키는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나와 K중 적어도 하나, S 및 P가 각각 A로 치환된 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서, 상기 (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K중 적어도 하나와 S가 각각 A로, R중 적어도 하나가 F로 치환된 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제7항에 있어서, 상기 (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R중 적어도 하나가 F로, P 및 I가 각각 A로 치환된 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 용매는 정제수, 세포배양용 배지, 인산염 완충용액, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드의 함량은 용매 1ml당 20mg 내지 100mg인 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체를 제조하는 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩타이드가 자기회합되어 있는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  17. 제16항에 있어서, 점도가 1000cps 내지 3000cps인 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  18. 제16항에 있어서, 직경이 20nm 내지 60nm인 나노섬유 형상을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  19. 제16항에 있어서, 줄기세포를 지지할 수 있는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  20. 제16항에 있어서, 줄기세포의 골조직 분화 촉진능을 가지는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  21. 제16항에 있어서, 생체내 골재생능을 가지는 것을 특징으로 하는 젤 형태의 지지체.
  22. 제7항의 방법에 의해 제조되고, 점도가 1000cps 내지 3000cps이며, 직경이 20nm 내지 60nm인 나노형상 젤 형태의 지지체.
  23. 제22항에 있어서, 줄기세포를 지지할 수 있는 것을 특징으로 하는 나노형상 젤 형태의 지지체.
  24. 제22항에 있어서, 줄기세포의 골조직 분화 촉진능을 가지는 것을 특징으로 하는 나노형상 젤 형태의 지지체.
  25. 제22항에 있어서, 생체내 골재생능을 가지는 것을 특징으로 하는 나노형상 젤 형태의 지지체.











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